מאמר שיטה

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56056

⸱

25 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

תקציר

תכונות מכאניות מורכבות, מבוסס פולימר חומר רך, כגון תאים או רשתות ביופולימרים, יכול להיות מובן במסגרת אף הקלאסית של פולימרים גמיש ולא של מוטות נוקשה. חוטים המשמש כבסיס להישאר פרושות עקב שלהם נעלם ללא עמוד שדרה נוקשות, אשר הוא לכמת דרך האורך ההתמדה (lp), אבל הם גם הפניה תרמית חזקה. נוקשות כיפוף סופיים שלהם מוביל מכניקה קולקטיבית ייחודי, לא טריוויאלי של רשתות בתפזורת, המאפשר הקמת פיגומים יציב על השברים בנפח נמוך תוך מתן רשת גדול מידות. העיקרון הבסיסי הזה נפוצה בטבע (למשל, תאים או רקמות), שמירה על איכות גבוהה בתוכן מולקולרית, ובכך להקל דיפוזיה או הובלה פעילה. בשל השלכות הביולוגי שלהם יישומים טכנולוגיים פוטנציאליים hydrogels מסתיימים, שהיו פולימרים semiflexible המחקר ניכר. עם זאת, חקירות מובנים נותר מאתגר מאז הם הסתמכו על פולימרים טבעיים, כגון חוטים אקטין, אשר אינם tunable בחופשיות. למרות מגבלות אלה, בגלל חוסר של פולימרים סינתטיים מכנית tunable, semiflexible, חוטים אקטין הוקמו מערכת מודל נפוץ. מגבלה משמעותית היא כי כמות מרכזי lp לא יכול להיות בחופשיות מכוון כדי לחקור את ההשפעה שלו על מבנים בצובר מאקרוסקופית. מגבלה זו נפתרה על ידי העסקת מבנית לתכנות צינוריות דנ א, המאפשר שינוי מבוקרת של הקשיחות נימה. הם נוצרו באמצעות עיצובים מבוסס-אריח, שבו קבוצה בדידה של גדילים משלימים חלקית hybridize במבנה הטבעת עם היקף דיסקרטית. טבעות אלו כוללים קצוות דביקים, המאפשר הפילמור יעיל לתוך חוטים מספר מיקרונים אורך, ולהציג קינטיקה הפילמור דומים כמו biopolymers טבעי. בשל המכניקה שלהם לתכנות, הצינורות האלה הם מגוונים, הרומן כלים לחקור את ההשפעה של lp בהמולקולה יחיד, כמו גם היקף בצובר. בניגוד אקטין חוטים, הם נשארים יציבים בשבועות, ללא ניוון הבולטים, הטיפול וסופן וזהובה.

מבוא

בשל התנהגויות מורכבות מופעל על-ידי תכונות מכניות הייחודי שלהם, פולימרים semiflexible הם אבני הבניין הבסיסיות של מרכיבי החיים. בניגוד פולימרים גמיש, פולימרים semiflexible לאמץ תצורה פרושות עקב שלהם נוקשות עמוד שדרה שאינו נעלם תוך שנותרו על תנודות תרמית חזקה1. לפיכך, מודלים סטוכסטיים גרידא ניתן להחילם על התנהגויות שלהם, כמו עם הקצוות של פולימרים גמיש לחלוטין או נוקשה. 3,4 2,מודל שרשרת תולעת כביכול פותחה כדי לכמת את נוקשות זו באמצעות lp, אשר הוא קבוע הדעיכה של המתאם משיק-משיק לאורך הלהט4. אם lp הוא להשוות אורך מתאר (lc) של חוט הלהט, הפולימר נחשב semiflexible1. מקביל והקטבים של אוהל, הסדרי שלהם רשתות או חבילות מייצבת את כל מערכת קולקטיבית על השברים בנפח נמוך, המוביל אל viscoelastic יוצא דופן מאפיינים5,6,7, 8,9. מבנים אלה מספקים בכללותו גבוהה elasticities mesh בגדלים10, שמירה על תקינות מכנית תוך עדיין הקלת המפזרת ותהליכים הובלה פעילה. מאפיין זה מתאים במיוחד עבור מערכות ביולוגיות כגון את שלד התא או את מטריצה חוץ-תאית, אך הוא גם משמש מזון-11,1,-הנדסה-12.

הולך מרכיבי החיים מעבר את משמעותם, חשוב לבחון באופן מקיף המאפיינים הפיזיים של מבנים אלה כדי יש את הכלים לפתח חומרים ביונים או hydrogels רומן. במונחים של פולימרים semiflexible, זה מרמז על הקביעה שיטתית של המאפיינים קולקטיבית של רשתות הנובע יחיד-פילמנט מאפיינים כגון lp והפיתוח של מסגרת תיאורטית תיאורי. במחקרים חלוצית, אקטין הסלולר ביופולימרים הוקמה מערכת מודל עבור פולימרים semiflexible והוא עדיין נחשב את תקן זהב5,13,14,15 , 16 , 17. עם זאת, מחקרים ממצה מוגבלות במערכת זו מאחר שהם קשורים למאפייני הטבועה של חלבון זה. גישות תיאורטיות שונות שכיוונתם בניין תיאור של ההתנהגויות מכני לא טריוויאלי ברמת יחיד-פילמנט, הובילו בעיקר שונים קנה מידה תחזיות עבור התלות של מישור אלסטיים לינאריים הטיה המודולוס, G 0 (קרי, "הגמישות" של הרשת), ריכוז (c), lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. בזמן הריכוז שינוי קנה מידה נגיש ניסויים עם מבוססי אקטין או מערכות אחרות דגם ובזמן תחזיות תיאורטיות היה בקפדנות לאמת13,16,24, 25, שינוי קנה מידה ביחס lp נותר נגיש השפעול. עם זאת, זו מגבלה משמעותית מאז lp הוא גם משתנה בלתי-תלוי מה הכמות המכונן של פולימרים semiflexible.

מגבלה זו המרכזי, טבעי המוטלים על-ידי קבוע lp של אקטין או פולימרים אחרים נגזר ביולוגית כגון קולגן לאחרונה נפתרה על ידי העסקת צינורות DNA מבוסס-אריח, אשר tunable תכונותיהם מכני 9 , 26 , 27 , 28. שייתכנו שינויים הארכיטקטורות של הצינורות (למשל, מספר שונה של DNA בוחרים קווצות בתוך הזירה היחידה) תשואה של ערכים שונים עבור lp, אשר ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, על-ידי ניתוח שפופרת אחת המשתנות או הערכת התצורות מעוקל של מספר צינורות מודבקת, כפי שתואר לעיל9,28. ניתוחים אלה חשף כי ערכיp lשל אוכלוסיות שונות צינור משתנות מעל סדר גודל אחד או יותר, טכניקות הערכה שונים להניב תוצאות עקביות9,28.

באופן מפתיע, גודל כולל הרמה אלסטי ליניארי הטיה מודולוס G0 הריכוז, lp דווחה להיות עקביים עם כל גישות תיאורטיות קודמות 9, בפרט הפגנת הרבה יותר תלות החזוי על lpחזק. ממצאים אלה מדגישים את הערך של מערכת מודל חדש ללמוד את התכונות המרכזיות של פולימרים semiflexible. העסקת n-סליל ה-DNA צינורות מרחיב באופן דרמטי את היקף החקירות האלה. לא רק יכולים lp להיות בחופשיות מגוונים מבלי לשנות את החומר הבסיסי, אבל הטבע לתכנות הטבועה של ה-DNA ניתן לאפשר בחינה שיטתית של רכיבים נוספים, כגון crosslinks או תהליכי מיתוג קינטי. בנוסף, הצינורות האלה הם מסיסים במים ויציב, בניגוד לרוב חלבונים, pH הולם ותנאי יוניים למשך מספר שבועות, ללא השפלה לזיהוי9.

להרכיב את הצינורות האלה, קבוצה בדידה של ה-DNA oligonucleotides משמש, שכל אחד מהם מכיל שתי קבוצות המחשבים חולקים רצפי הבסיס משלימים שני הגדילים הסמוכים (עקב רצפים ספציפיים, גדיל אחד לא יכול ליצור מבנים כמו סיכות לשיער). רצפים משלימים hybridize בצורה מחזורית, ויוצרים טבעות סגור, חצי חופפות של n מחוברים מקטעי כפול-הסליל (איור 1A ו- B). טופס אלה טבעות בקוטר דיסקרטית (איור 1C), ואת התצורה שלהם חופפות חצי חושף קצוות דביקים צירית משלימים בקצוות דביקים של טבעת אחרת. תוספת זו בררני של התאמת oligonucleotides מפעיל את הערמה של הטבעות, שמוביל הפילמור יעיל של צינורות סליל ה-DNA filamentous בגודל n (nHT). אורכי מתאר שלהם בדרך כלל למדוד מספר מיקרונים אורך, פריסתם אורך דומה לזו של אקטין חוטים9,26,27,28. הוכח עבור צינורות DNA דומה כי הם אכן מציגים הפילמור קינטיקה דומים לאלה של אקטין חוטים ו- microtubulesp class = "xref" > 29. בהתאם מספר n של גדילי DNA בודדים ממציא את המבנה הבסיסי טבעת, הארכיטקטורה nHT, וכן את היקף ואת קוטר, יכולים להיות מכאנית ופיקודית מגוונים. שימוש גדילי DNA יותר מגביר את היקף הטבעות/הצינורות, משתנה המתאימה הקפיצות תכונות מכאניות לערכים גבוהים יותר lp (איור 1C), המקביל קשיחות גבוהה יותר. בסולם mesoscopic, אלה ערכים גדולים יותר שלp lמתרגמים פחות כפופות הייצורים החיים בשל הקשיחות גבוה יותר (איור 1D ו- E).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1-הכנת n HTs

הערה: כאן, n מציין את מספר שונה גדילי DNA יחיד מעורב היווצרות הצינורות סליל בגודל מסוים. עבור n = 8, שמונה גדילי DNA שונה יחיד להמציא טבעת יחידה.

  1. רכישה DNA רצף (HPLC טוהר כיתה או גבוה יותר) מן סינתזה הדנ א מתאים שירות או לבצע סינתזה באיכות גבוהה, טיהור (למופת רצפים נתון טבלה 1).
  2. Resuspend lyophilized oligonucleotides מים מטוהרים, בצע resuspension נוספת השלבים במדריך המתאים מהחברה. התאימו את כמות המים בריכוז הסופי של מיקרומטר 200.
  3. לקבוע ריכוז של ה-DNA בודד קווצות כדי לוודא שהערכים שניתנו על ידי המפיץ (למשל, באמצעות ספקטרוסקופית UV-Vis ב-260 ננומטר) מאז סטויכיומטריה המדויק הוא קריטי עבור תהליך ההרכבה. לחשב את הריכוז של oligonucleotides, לוקח בחשבון את המשקל הסגולי טוחנת, המקדם הכחדה עבור כל oligonucleotide דנ א חד גדילי.
    הערה: הכחדה מקדם ערכי מטבעו להשתנות עבור רצפים שונים לבין מתוארים בתיעוד של DNA שנרכש באופן מסחרי. הם גם ניתן לחשב על פי המודל הקרוב ביותר-שכן תוך שימוש במספר כלים מקוונים זמינה בחופשיות. כדי לקיים מגוון ספקטרומטר ליניארי, שקול דילול המדגם המשמש לקביעת ריכוז.
  4. משתמש של micropipette, לערבב ה-DNA גדילי, כל באותו ריכוז-אין מיכל מתאים thermocycler (למשל, צינור PCR 200 µL) ליצור את הרצוי n HTs (מאגר הסופי תנאים: 1xTE (10 מ מ EDTA טריס ו- 1 מ מ, pH 8), MgCl 12.5 מ מ 2).
    הערה: דגימות DNA הסופית n HT מורכב n - 1 קווצות, U 1 − U n − 1 וגדיל אחד של n T. הריכוז לכל גדיל יכול להשתנות sub-micromolar על יותר מ- 10 מיקרומטר, בהתאם לצרכים של המשתמש (למשל, < 1 מיקרומטר לכל גדיל של דילול עוקבות להתבונן חוטים יחיד או ריכוז גבוה לבדיקת איכות רשת צפופה מכניקה).
  5. Hybridize של n. השודדים ב thermocycler (דנטורציה 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, עם ירידה מהירה הבאים עד 65 מעלות צלזיוס; איטי בטמפרטורה ירידה מ- 65 ° C עד 55 ° C, עם בסיס משלימים זיווג 20 צעדים בטמפרטורה של -0.5 K למשך 30 דקות בכל אחד מהם; ו ירידה מהירה מ- 55 ° צלזיוס עד 20 ° C); ראה איור 2A.
    הערה: השלבים ירידה איטית מ- 65 ° C יכול מאורכים כדי להאריך את אורך צינור הממוצע; עם זאת, הירידה מהירה הבאים עד 20 ° C חיוני למנוע הצבירה של צינורות polymerized.
  6. אחסן hybridized n HTs עד 3 שבועות ב 4 ° C ללא השפלה לזיהוי.
    הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, שכותרתו השודדים n הן hybridized על ידי (חלקית) החלפת U1 עם ששונה U1-Cy3 (טבלה 1). משכי זמן ארוכים יותר תצפית, התוספת של סוכנים אנטי-הלבנת הוקמה מומלץ.
  7. בקפידה לדלל את הדגימה לריכוז הסופי הרצוי (למשל, 4 מיקרומטר עבור רשתות או 20 ננומטר על תצפיות יחיד-פילמנט) באמצעות המאגר לדוגמה, במידת הצורך. כדי למזער שגיאות אפשריות מקורות, להרכיב דגימות-הריכוז הסופי הרצוי.

2. להטיה Rheology

גאומטריה
  1. בחר הולם (צלחת צלחת או חרוט-plate) עבור rheometer ההטיה דינמי. אחסון קטן (קרי, מתחת 200 µL), להשתמש הגיאומטריה פלייט-חרוט.
  2. לטעון את דגימות rheometer דינמי הטיה.
  3. Passivate הממשק מים אוויר של המדגם, סביבה באמצעות השלבים הבאים כדי למנוע אידוי תופעות אפשריות.
    1. המקיפים את הדגימה עם 2.5 מ של האמבטיה מאגר מדגם.
    2. הוספה של חומרים פעילי שטח מתחת הריכוז מיצלה.
    3. השתמש מזרק המילטון להקיף את הדגימה עם ליפופרוטאין להימנע ממגע ישיר של המדגם באוויר.
  4. חותם תא הדגימה עם כובע מצויד ספוגים רטובים, במידת האפשר, עם אמבט מים נוספים (לא בקשר עם המדגם) בכדי לדכא את אידוי.
  5. להתחיל את המדידה באמצעות תוכנה ספציפית rheometer בטמפרטורת החדר; לחלופין, לבצע את המדידה בטמפרטורות שונות, כגון 37 ° C (אם יש צורך בתנאים פיזיולוגיים).
    הערה: קירור המדגם לעתים קרובות היא מלווה את עיבוי של אדי מים מן האוויר שמסביב, ואילו חימום מוביל אידוי משופרת. שני אפקטים ללא שליטה יכול לשנות את הריכוז של המדגם, אז כל המדידות בסדרה יש לבצעו בטמפרטורה קבועה.
  6. לאפשר את הדגימה כדי equilibrate עבור 2 h בטמפרטורת החדר. ההתפתחות זמן יתועד עם מטאטא זמן (נתונים אחת הצבע לדקה; זן וγ = 5 %); בתדר f = 1 הרץ).
  7. למדוד תכונות מכאניות עם הפרוטוקולים המבחן הרצוי. להתחיל עם סדרה של תדירות מטאטא (f-מטאטא) כי הם השאירו את הדגימה ללא פגע ולאפשר מדידות יותר.
    הערה: בנוסף, קצר f-מטאטא תיעשנה בחוץ לפני ואחרי מדידות זמן רב יותר (כגון ארוך f-מטאטא ברזולוציה גבוהה יותר) כדי לוודא כי המדגם נותר ללא שינוי לאורך כל פרוטוקול מלא מדידה.
    1. בצע קצר f-סריקה (למשל, וγ = 5%; f = 0.01 הרץ עד 30 הרץ; נקודות נתונים 5 לכל עשור).
    2. לבצע ארוך f-סריקה (למשל, וγ = 5%; f = 0.001 הרץ עד 30 הרץ; 21 נקודות נתונים לכל עשור); המשטר בתדר נמוך יכול להיות מושמט אם לא הכרחי לצמצם את זמן מדידה.
    3. לבצע קצר f-לטאטא.
    4. לבצע סריקה וγ (למשל, f = 1 הרץ; וγ = 0.0125% עד 100%; נקודות נתונים 20 לכל עשור).
      הערה: השתמש קצר של f - לטאטא קודם, כפי שהוא בדרך כלל בקנה אחד עם הקודם f - מטאטא כי רשתות בדרך כלל להיקרע במהלך γ-סריקה או ניתוק של הלוחות. לחלופין, השתמש γ-שיפוע (למשל, = 0.025 s -1, t = 60 s); עם זאת, רמפות דורשות בדרך כלל לשנות את מצב המנוע, אז עוקבות קצר f-הרייטינג סולפה.
  8. סל ו/או חלקה הנתונים הגולמיים עם קרנל גאוסיאנית.

3. בסיוע פלורסצנטיות ניתוח של ה-DNA חישול

µL
  1. aliquots 8 להכין 12 עבור כל דגימה באמצעות 1-4 מיקרומטר DNA לכל סטרנד, 12.5 מ"מ MgCl 2 1 x מאגר TE ו 1 x חומצת גרעין ג'ל כתם של דימתיל סולפוקסיד 10,000 x מניות. הפוך פקד שלילי עם שום דנ א, אך כוללות חומצות גרעין ג'ל הכתם.
  2. להעביר את aliquots צלחת PCR בזמן אמת, לאטום עם סרט דביק (למשל, צלחת 96-ובכן התגובה).
    הערה: בטמפרטורות גבוהות בשימוש התרמי חישול פרוטוקולים יתפוגג דגימות. לפיכך, ודא כי הבארות חתומות באופן הדוק עם סרט דביק כדי למנוע עלייה אידוי וריכוז מים, במיוחד במהלך ניסויים ארוכי טווח.
  3. Centrifuge את הצלחת ב g x 100 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר את בועות הגז; אם להרחיב בועות הגז, לא יכול להיות מנותח הבארות.
  4. לטעון את הצלחת אטום לתוך מערכת ה-PCR כמותי בזמן אמת-
  5. להפעיל תוכנית מחזק. Denature ה-DNA ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ירידה הטמפרטורה במהירות כדי 72 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הקטנת הטמפרטורה באיטיות ב- 0.5 מעלות כל 30 דקות. אחרי האות נבלם, להאיץ את הרמפה טמפרטורה.
    הערה: 72 ° C הוא מספיק מעל הטמפרטורה הכלאה אמיתי; כך, האות נרשם על טווח טמפרטורות רחב המתאים לקביעת טווח הטמפרטורה הדרושים.
  6. לוודא המכסה של הצנטרפוגה מחממת עד לפחות 100 ° C כדי למנוע עיבוי מדגם המתאיידים בסרט דבק.
  7. במהלך ההרכבה, לרגש את הדגימות עם לייזר ארגון-יון-488 ננומטר ולגלות את זריחה ב- 550 ננומטר בעת שימוש כתם ג'ל חומצת גרעין (או spectrally דומה). על צבעים אחרים, בחרו שילוב המתאימים עירור/פליטה. למדוד את האות פלורסצנטיות לעיתים קרובות ככל האפשר כדי להגדיל הכולל איכות אות באמצעות המצלמה המובנית.
    הערה: כאן, מדידות נלקחו כל 9 ס
  8. אם נמס מראש, חישול תוכניות מיושמים, להשתמש בתוכנה שסופקו כדי לנתח את הנתונים. אם לא, להחסיר את הערך הממוצע הקודם מ הערך הממוצע עבור כל שלב טמפרטורה להשגת השינוי היחסי של האות פלורסנט.

4. AFM הדמיה

  1. קליב נציץ (למשל, נציץ " V1 ") על ידי הצמדת זמינים מסחרית דבק לשדוד אותו; להסיר את השכבה העליונה של נציץ.
  2. שימוש של micropipette, להפקיד הקבועים מראש n HT במ ג 2 + המכיל מאגר מתקפלים על מישה טרי cleaved ולתת לו להסתפק 10 דקות
  3. לסובב את הדגימות במרווחי זמן קצר 3-s-g x 2,000 על צנטריפוגה שולחן קטן כדי להסיר את הנוזל הנותר. מספר n. השודדים עדיין צריכה להיות מחוברת אל פני השטח נציץ.
  4. להשתמש טיפ זיז עם מנדנד גבוהה (למשל, 54 Nm -1) ולקבוע את תדר תהודה עם התוכנה AFM פנימי.
  5. שיא הפרופיל גובה עם AFM באוויר ב הקשה מצב בקצבי סריקה נמוך (למשל, 1 קו/s) כדי למנוע פגיעה או ועקרו מבתיהם את n HTs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההרכבה של צינוריות הדנ א באמצעות רמפה טמפרטורה (איור 2) היא שיטה אמינה. כדי ליצור פולימרים semiflexible מלאכותיים אלה. פולימרים אלה בעלי מאפיינים דומים לכלים המקבילים המתרחשים באופן טבעי, כגון חוטים אקטין, אך מספק מסגרת ניסיונית הרבה יותר רחב שכן תכונות מכניות שלהם יכול להיות מכאנית ופיקודית שינו9,27 . כמו biopolymers, הם מארגנים ברשתות (איור 3), ליתר דיוק לאפשר אחד לבחון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כדי להשיג רשתות בנוי כראוי, בהרכבת הנאנו DNA היא צעד חיוני. שגיאות במהלך תהליך סינתזה השפעה שלילית על איכות צינור; לכן, מומלץ כי hplc, קורס או תהליך מחמירים יותר לשמש כדי לטהר את oligonucleotides. מאז היווצרות דיסקרטית במקום צינוריות DNA צבור, וכן הפצה האורך שלהם, תלוי סטויכיומטריה equimolar של oligonucleotides בוחרים n בתוך הקבוצה, יש צורך remeasure ריכוז של גדילי שנרכשו, מאז שניתנה ערכים יכול להשתנות באופן משמעותי הריכוז בפועל. זה יכול להתבצע, למשל, על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis-גל ספיגת של 260 ננומטר. אנו רוצים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו להכיר מימון מאת DFG (1116/17-1), את לייפציג בבית הספר למדעי הטבע "BuildMoNa" (GSC 185). עבודה זו תמכה באמצעות הפרויקט פראונהופר Attract 601 683. T. H מאשר מימון הקרן החברתית האירופאית (ESF-100077106).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שלוחת AFM ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
מצלמת CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
DNA oligonucleotidesBiomers.netלרצפים ראה טבלה 1
אוליגונוקלאוטידים עם תווית DNA Cy3Biomers.netלרצף ראה טבלה 1
EDTASigma-AldrichE-9884
מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטיLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
נציץ "V1", 12 מ"מ עגולPlano GmbH50-12
MicroAmp® צלחת תגובה אופטית מהירה 96 בארותThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® סרט דבק אופטיתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטרתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ
100x אובייקטיביLeica5506168
מים מטוהריםMerk Millipore - Milli-Q & צינורות PCR של אליקס
ספירGreiner Bio-One683271
תקן PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070- תקן
7900HT מערכת PCR מהירה בזמן אמתיישומי ביו-מערכות 4351405
ריאומטרTA מכשיריםARES
SYBR® כתם ג'ל חומצת גרעין ירוק IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100מדכא אידוי של דגימה בממשק אוויר-מים
43469074306311

מקורות

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001(2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274(2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCR

מאמרים קשורים