כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
Cyanobacteria לצבור גליקוגן כמו פחמן תאיים הגדולות ואנרגיה אחסון במהלך פוטוסינתזה. ההתפתחויות האחרונות במחקר הדגישו מנגנונים מורכבים של מטבוליזם גליקוגן, כולל מחזור diel של biosynthesis ו catabolism, רגולציה רגולציה, ואת מעורבותם של RNA לא קידוד. במקביל, נעשים מאמצים להפנות פחמן מגליקוגן למוצרים רצויים בקיאנובקטריות מהונדסות גנטית כדי לשפר את תפוקת המוצרים. כמה שיטות משמשות כדי לקבוע את תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria, עם משתנות משתנה המורכבות הטכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לקביעת אמין של תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria כי ניתן לבצע במעבדה סטנדרטית מדעי החיים. הפרוטוקול כרוך משקעים סלקטיבי של גליקוגן מן lysate התא ואת deolymerization אנזימטי של גליקוגן לייצר מונומרים גלוקוז, אשר מזוהים על ידי גלוקוז שורIdase-peroxidase (GOD-POD) אנזים מצמידים אנזים. השיטה יושמה על Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, שני מינים cyanobacterial מודל כי נמצאים בשימוש נרחב בהנדסה מטבולית. יתר על כן, השיטה בהצלחה הראו הבדלים בתכולת הגליקוגן בין wildtype לבין מוטנטים פגומים ברכיבים רגולטוריים או גליקוגן biosynthetic גנים.
מבוא
Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO 2 קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה
- תרבויות Cyanobacterial
- לגדול Synechocystis sp. PCC 6803 ב 30 מעלות צלזיוס BG11 בינוני 8 , עם אספקה קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של פוטון 50 μmol / m 2 / s.
- לגדול Synechococcus sp. PCC 7002 בנוזל A + בינוני 23 (בי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
10 מ"ל של wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 גדלו בתנאים photautotrophic עד הערך 730nm OD הגיעו כ 0.8. התאים נקצרו resuspended ב 50 מ"מ טריס HCl, pH 8. ערך 730nm OD הותאם 2-3. תכולת הגליקוגן נותחה בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. תכולת הגליקוגן לכל 730 ננו-מטר היה 13 ± 1.8 מיקרוגרם / מ"ל / OD 730 ננומטר ( N = 12). קרוב המשפחה תוכן הגליקוגן לתוכן חלבון היה 0.24 ± 0.03 מיקרוג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים קריטיים בפרוטוקול הם משקעים גליקוגן resuspension. לאחר צנטריפוגה לאחר משקעים אתנול, גליקוגן יוצר גלולה שקוף כי באופן רופף דבקות קירות microcentrifuge צינורות. לכן, בעת הסרת supernatant, תשומת לב מיוחדת צריך להינתן כדי לא להסיר את גלולה. גליקוגן גלולה הוא דביק, solubilization יכול להיות קשה אם הוא מתייבש. שים לב כי solubilization מלא של גלולה גליקוגן חשוב משום solubilization חלקית יוביל לעיכול אנזימטי יעיל ולכן יהיה ליצור וריאציות גדולות בין משכפל טכני. היישום של sonication ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
המחברים מכירים במחקר Nordic Energy (AquaFEED, פרויקט מס '24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, פרויקט מס' 12-131844) וווילום פונדן (פרויקט מס '13363)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 קורא מיקרופלייט | מכשירים מולקולריים | NA אלייזה קורא צלחות | |
| כדור בלנדר סערה | הבא מתקדם | BBY24M-CE | מקצף חרוזים |
| Ultrospec 3100 pro UV / ספקטרופוטומטר גלוי | אמרשם ביוסיינסס | NA | ספקטרופוטומטר |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | תוספת pH |
| נתרן אצטט | סיגמא-אולדריץ' | 32319 | בופר |
| עמילוגליקוזידאז (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | לדה-פולימריזציה של גליקוגן |
| ואלפא;-עמילאז, עמיד בחום (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | לדה-פולימריזציה של גליקוגן |
| D-Glucose | Merch | 8337 | תקן לבדיקת גלוקוז |
| ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce | Thermo Fisher scientific | 23225 | לקביעת ריכוזי חלבון |
| מגשי ייבוש אלומיניום, חד פעמיים | VWR | 611-1362 | לקביעת משקלים יבשים של תאים |
| ערכת בדיקת D-Glucose (פורמט GODPOD) | Megazyme | K-GLUC | לקביעת ריכוזי גלוקוז |
| לחמי תחמוצת זירקוניום, 0.15 מ"מ | Next Advance | ZrOB015 | חרוזים לליזה תאים ב |
| צינורות RINO | NA | מתקדמים הבאים | לליזה תאים בסערה של Bullet Blendar |
מקורות
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
