הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56077

⸱

3 בנובמבר 2017

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.

תקציר

בין מודלים שונים עבור פגיעה בחוט השדרה אצל חולדות, המודל החבורה משמש לעתים קרובות ביותר כי הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה בחוט השדרה האנושית. המודל המלא חיתוך, אמנם לא כמו קלינית הרלוונטיים כמודל החבורה, היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להעריך את האקסון התחדשות. במודל החבורה, קשה להבחין מחדש של אקסונים נבט או והבחירה הנכונה מצילה בשל נוכחותם של הנותרים רקמות שלאחר הפציעה. במודל חיתוך מלאה, שיטת הגישור יש צורך למלא את הפער וליצור המשכיות של rostral גדמי סימטרית על מנת להעריך את האפקטיביות של הטיפולים. ניתוח גישור אמין חיוני כדי לבדוק את התוצאה אמצעים על-ידי הפחתת מידת ההשתנות בשל שיטת. הפרוטוקולים המתוארים כאן משמשים להכנת שוואן תאים (SCs), תעלות לפני ההשתלה, חיתוך מלאה של חוט השדרה החזי רמה 8 (T8), הכנס את הצינור ולאחר השתלת SCs לתוך הצינור. גישה זו משתמשת גם בחיי עיר ג'לי של מטריקס קרום המרתף בזריקות עם השתלת SC המאפשר צמיחה האקסון משופרת על פני הממשקים rostral וסימטרית עם רקמת המארח.

מבוא

תיקון פגיעה בחוט השדרה הוא בעיה מורכבים ומאתגרים שיחייבו טיפול קומבינטורית אסטרטגיה מעורבים, לדוגמה, השימוש של תאים biomaterial לפרנס microenvironment חיובית ותפקוד התאים המושתלים האקסון התחדשות באתר של פציעה. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 , חיתוך מלא10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 מודלים משמשים לעתים קרובות כדי להעריך את ההשפעות של biomaterial מבוססי טיפולים גישור. היתרון של שימוש דגם hemisection הוא כי הוא מספק יציבות יותר הבונה גישור לעומת חיתוך מלאה. עם זאת, hemisection דגמים, קשה להוכיח התחדשות האקסון כפועל של השיטה הטיפולית יישומית בשל נוכחותם של רקמות והבחירה הנכונה מצילה. המודל חיתוך מלאה היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להדגים האקסון התחדשות.

חומרים טבעיים וסינתטיים שונים נחקרו לשימוש ג'ל להזרקה, ג'ל הקבועים מראש להציב החבורה או מודלים hemisection, או כצינור תקשורת מובנית לתוך hemisection או להשלים חיתוך מודלים (מפורט את הדעת23 , 24 , 25). בחיי עיר ג'לי של תערובת להזרקה מטריקס/SC יוצר ממשק יותר מתירני בין ההשתלה את כבל מארח האקסון המעבר26,27 לעומת מטריקס וג'ל מראש/SC שתלים 5 , 18 , 19 , 28. בחיי עיר ג'לי מותר המטריקס כדי ליצור מתאר סביב הממשקים המארח לא סדיר בעוד צינור קשיח ומובנים יותר או פחות moldable ג'ל הקבועים מראש לא יכול. צינור מובנים לעיתים קרובות מספק הדרכה קשר ויציבות השתל לעומת מטריקס להזרקה. הפרוטוקולים המובאת כאן לתאר את הליך כירורגי מנצל של מטריקס להזרקה קרום המרתף (למשל, matrigel, ראה הטבלה של חומרים, המכונה כמו מטריקס להזרקה כאן) והן צינור מובנים הערכת האקסון התחדשות במודל פגיעה בחוט השדרה ואינטלקטואלית.

Electrospun פולי-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) מיושר תעלות חלול סיביים משמשים בגישתנו ניסיוני. PVDF-TrFE הוא פולימר פיזואלקטריים יוצר מטען ארעי כאשר מכנית מעוות ולא הוכח לקדם התחדשות האקסון והסיומת neurite הן במבחנה29,30 , ויוו בתוך 31. Electrospinning היא שיטה נפוצה לגרדום פבריקציה נוספת שיכול לייצר במהירות אמין פיגומים סיביים באמצעות מגוון של פולימרים עם מאפיינים לשליטה כגון יישור סיבים, סיבים בקוטר עובי לגרדום עבור 33,32,עצבית ויישומים אחרים34.

מחקרים רבים של עכברוש SCs מושתלים לתוך חוט השדרה פגיעה באתרים הראו הטיפול היעילות5,9,18,19,20,21 ,26. השתלות אלה הן neuroprotective בשביל לרקמות שמסביב לפצע, לצמצם את גודל חלל הנגע, לקדם התחדשות האקסון לתוך הנגע/השתלת האתר ואת myelination של האקסונים מחדש. יכול להיות מושתלים autologously SCs אנושי, יתרון לעומת שאר עצביות הקשורות תאים24. לאחר ביופסיה במערכת העצבים ההיקפית, SCs יכול להיות מבודדת וטיהרו ו ותתנהל כדי הסכום הרצוי עבור השתלת לתוך בני אדם. עצמיים השתלת SC לחולים חוט השדרה נפגע הוכח כדי להיות בטוחים איראן35,36,37,38,39,סין40, ו ארצות הברית41,42. SCs ידועים להפריש מספר גורמים neurotrophic של מטריצה חוץ-תאית חלבונים חשובים לצמיחה האקסון וכדי לשחק תפקיד חיוני האקסון התחדשות לאחר פגיעה במערכת העצבים ההיקפית. מטרתנו כאן היא לתאר את שיטות אשר יכולים לחקור conduit עיצובים כדי לשפר את התוצאה של השתלת SC במודל חיתוך בחוט השדרה עכברוש שלם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

חולדות פישר למבוגרים נקבות (180-200 גרם משקל) שוכנות על פי הנחיות משרד החקלאות ו- NIH. המוסדיים חיה אכפת שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר כל ההליכים בבעלי חיים-

1. הכנה לפני השתלת

  1. הכנה Conduit-
    1. לחתוך לצינור 5 מ"מ אורך באמצעות סכין #10 תחת מיקרוסקופ ויבתר.
      הערה: הקוטר הפנימי של הצינור הוא בין 2.4-2.7 מ"מ; הקוטר החיצוני הוא בין 2.5-2.8 מ מ.
    2. מקפלים הצינור בעדינות לאורך הצד האורך ( איור 1 א'). חותכים ארבעה חתכים קטנים אודות 0.4 מ"מ לפחות 1 מ מ הפתחים של הצינור אותם על 1 מ מ בנפרד באמצעות שוליים ישרים Vannas מספריים ( איור 1B).
      1. נפרשים הצינור ( איור 1C) וחותכים בין שני חתכים לאורך באותו הצד יצירת שני חלונות זה לצד זה ( איור 1D). להבטיח כי החלונות יכול להיות נפתח ונסגר כראוי לאורך הצד נימולים.
    3. לחטא המוליכים 75% אתנול במשך 25 דקות בצלחת פטרי 10-ס מ. לשטוף מתים פעם אחת במשך 4 דקות עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולהעביר המוליכים עם מלקחיים עקר פטרי ס מ-10 החדש. לשטוף את המוליכים פעמיים עם PBS 1 x 25 דקות כל אחד.
    4. לאחסן המוליכים ב- PBS 1 x עד הניתוח.
      הערה: תעלות רבים יכולים להיות מעוקר בבת אחת. לאחסן המוליכים mL 1.5 סטרילי נפרד צינורות צנטריפוגה כדי לשמור על סטריליות.
  2. ירוק חלבון פלואורסצנטי (GFP)-הכנה תאי שוואן (SC)
    1. להכין את תרבויות SC מטוהרים מן העצבים בשוקה של פישר נקבה בוגרת חולדות כפי שתואר לעיל 43. בסיום שלב זה, לוח ה-SCs-פולי-L-ליזין (PLL)-מצופה ס מ-10 פטרי ולתחזק במדיום D10/3 מ'; SCs אלה מוגדרים מעבר 0-
      הערה: D10/3 מ' בינוני מורכב מהפעולות הבאות: 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), יותרת המוח µg/mL 20 לחלץ, forskolin 2 מיקרומטר, 2.5 ננומטר heregulin ב Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s בינוני (DMEM).
    2. לחדש D10/3 מ' טריים בינונית (7 מ ל/10-ס מ פטרי) כל 3-4 ימים.
    3. תרבות פיצול SC ברגע שהוא מגיע למפגש 70-80%.
      1. בינוני להסיר ולשטוף פעמיים עם האנק ' s מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום.
      2. להוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין/EDTA כל ס מ-10 פטרי, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. הוסף 5 מ של D10 בינוני (10% FBS ו 1% עט/דלקת ב- DMEM) לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL לנטרל טריפסין.
      4. בעדינות pipet טריפסין/EDTA פתרון לתוך פטרי צלחת מספר פעמים להתנתק SCs. להסיר את המתלים תא מתוך קערה ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה מוכן בשלב הקודם. לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר D10 בינוני ומניחים אותו לתוך הצינור צנטריפוגה כדי למקסם את הקציר תא.
      5. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל פיצול פטרי.
      6. לוותר על 1 מ"ל של השעיה SC ו 6 מ של בינוני D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל פיצול פטרי תגרום 4 צלחות פטרי. SCs אלה מוגדרים מעבר 1.
      7. לחדש D10/3 מ' טריים בינונית היום לאחר ציפוי, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.
      8. פעם ה-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.6. ה-SCs נמצאים על המעבר 2.
    4. מגלי ה-SCs פעם להגיע למפגש 50%, עם וקטור lentiviral קידוד GFP ב- D10/3 מ' בינוני בן לילה-ריבוי של זיהום של 30 כאמור תיאר 44 , 45 .
    5. לחדש בינונית טרייה-D10/3 מ' יום למחרת, כל 3-4 ימים לאחר ציפוי.
    6. לאחר ה-GFP-SCs להגיע למפגש 70-80%, חזור על שלבים כ- 1.2.3.1 כדי 1.2.3.5 אבל resuspend ה-GFP-SCs ב 6 מ של בינוני D10 במקום. לוותר על µL 15 של השעיה GFP-SC לתוך שפופרת צנטרפוגה 1.5 מ"ל ולהוסיף µL 15 של 0.4% trypan blue פתרון. קפיצי הצינור צנטריפוגה בעדינות, לוותר על 10 µL של התערובת לתא של השקופית ספירת תאים.
      1. מקום השקופית לתוך מונה הניתן תא אוטומטיות ולקבוע את צפיפות תא.
    7. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend 1.5 מ של מדיום מקפיא עבור כל 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1.5 מ ל GFP-SC השעיה לתוך המבחנה קריוגני, הקפאת ב-80 o C עבור פחות 24 שעות לפני העברת חנקן נוזלי לאחסון.
      הערה: הקפאת בינוני: 25% FBS ו- 8% דימתיל סולפוקסיד ב- DMEM.
    8. להפשיר GFP-SCs שבוע לפני הניתוח.
      1. להוסיף 10 מ"ל D10 בינוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל.
      2. להפשיר צלוחיות של GFP-SCs קפוא באמבט מים-37 o C עד חלקית הקרת.
      3. להסיר את המתלים GFP-SC המבחנה קריוגני ולמקם אותו לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ ל בכיכר 1.2.8.1. בעדינות pipet הפתרון למעלה ולמטה שוב ושוב.
      4. Centrifuge התאים ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C. הסר תגובת שיקוע, resuspend את התאים במדיום D10/3 מ מ ל 4 עבור כל בקבוקון הקרת.
      5. לוותר על 2 מ"ל של השעיה GFP-SC ו- 5 מ של מדיום D10/3 מטר לתוך צלחת פטרי 10-ס מ; כל בקבוקון יביא 2 צלחות פטרי. ה-GFP-SCs מוגדרים מעבר 3.
        הערה: צלחת פטרי ס מ-10 שמשפר בדרך-כלל בסביבות 8 x 10 6 GFP-SCs אחרי שבוע אחד.
    9. ביום של הניתוח, חזור על שלב 1.2.6. השתמש צפיפות התאים שחושבו בצעד 1.2.10.
    10. Dispense aliquots של 3 x 10 6 GFP-SCs לתוך צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי צינורות בהתבסס על צפיפות תא מחושב מהשלב 1.2.9. Centrifuge את aliquots GFP-SC ב g x 370 למשך 5 דקות בבית 4 o C ולהסיר את תגובת שיקוע. להוסיף 1 מ"ל של DMEM/F12 בינוני לכל aliquot ולכל צנטריפוגה-370 x g...
      הערה: כל בעל חיים מקבל 3 x 10 6 GFP-SCs-בינוני עם הנסיוב נמצא בשימוש עם GFP-SCs עד שלב זה.
    11. SCs GFP לשמור בקירור עד הזמן של השתלת.

2. להשלים את חיתוך בשמונה רמת בית החזה (T8)

  1. בעלי חיים הכנה לניתוח
    1. Anesthetize פישר נקבה לעכבר (180-200 גרם) עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (60 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לפקח העומק של הרדמה לפני שתמשיך לשלב הבא על ידי בדיקת הבוהן צובט, עין תגובות מהבהב.
    2. לגלח האחורי של העכברוש עם קוצץ חשמלי ונגב את העור עם 70% אתנול. חומר סיכה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים. להעביר את החיה אל שולחן הניתוחים על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף כ 37 o C. המקום החיה על הגל, אז החוליות ניתנים לגישה בקלות.
      הערה: ניתן לבצע את הגליל מגבת נייר או 2 ב x2 הבנתם זה יכולים להיות מעוקר. לחמניות גדולות מומלץ כאשר T7-T9 צריך להיות מונח שטוח מעל לגלגל את.
  2. T7 כדי T9 laminectomy
    1. לאתר את הציון עבור התהליכים קוצניים T9-T11.
      הערה: הפערים בין T9, T10 T11 קטנים בהשוואה מקטעים אחרים אניn באזור. לאחר הנחת העכבר על הסליל, תהליכים קוצניים T9-T11 תרגיש בליטה משולש קטן דרך העור.
    2. עושים חתך קו האמצע 4 עד 5 ס מ של העור בעזרת סכין #10 מ- T4 כדי T11. עושים חתך קטן בשכבת שומן שטחית עם מספריים מעוגלים עם קצוות קהים לנתח את השומן.
      הערה: סוגים אחרים של כלי נגינה ניתן להשתמש כדי להפריד את השומן אך מספריים מעוקל, עם קצוות קהים לאפשר השיטה היעילה ביותר, לפחות פולשני עבור הפרדת השמן.
    3. לאתר את T7 לתהליכים קוצניים T9 באמצעות גב הלהב #10. . תחזיק את השריר-על T4 עם מלקחיים בוטה, לבצע חתך בשריר לאורך כל צד של החוליות T6-T10. . תחתוך כמה שיותר קרוב החוליות ככל האפשר לעשות חור נקי, תגרום לפגיעה מינימלית החיה.
    4. לבודד כל בודדים תהליכים קוצניים מ- T7 T9 על ידי חיתוך של השרירים והרצועות בין T6, T7, T7 ו T8, T8 T9, ושל T9 T10 עם להב #10-
    5. השתמש rongeur כדי להסיר כל השרירים והרצועות על שנבזזו T7 כדי T9. להסיר את השרירים והרצועות רוחבית ככל האפשר עד הפערים בין התהליכים רוחבי של T7 כדי T9 גלויים.
    6. להסיר תהליך קוצניים T9 עם rongeur. להחזיק את תהליכים קוצניים T8 עם מלקחיים בוטה ולהרים בעדינות כדי לרומם את הנדן T9 בפתח קטן בין התהליכים T9, T10-
    7. להסיר את הנדן החל מפתיחת ונע rostrally עם rongeur-T9. להסיר את הנדן רוחבית ככל האפשר; שורשי העץ יהיו גלויים לאחר laminectomy.
    8. ברגע הנדן מוסר, חזור על התהליך עבור T8 ו- T7.
      הערה: במהלך laminectomy, להשתמש הקליטה ספירס להסיר דם בעוד בהמשך laminectomy. אם עודף דימום מתרחשת, למקם ספוג דחוס באתר דימום ולהוסיף מלח כדי לעזור עם קרישת הדם-
  3. חיתוך-T8
    1. למקם את המדחק סביב T7 כדי T9. לאחר כל שנבזזו מוסרות, ודא כי הפערים בין התהליכים רוחבי גלויים, במיוחד בזמן T8. גם לבחון את העצמות לאורך שני הצדדים בין T7 כדי T9 כדי להבטיח ישנם אין שברי עצמות בולטות כלפי חוץ.
      הערה: את הפער הזה-T8 חשוב עבור ביצוע של חיתוך מלאה. החוליות לאורך להסירם עבור הכניסה צינור קל יותר.
    2. לחתוך את הגבי ו הגחוני / שורשים מעל ומתחת T8 שימוש בזווית מעיין מספריים. הוסף תמיסת מלח בחוט השדרה ולחכות על הדם הקריש.
      הערה: השלב זה חשוב להכנסה צינור מתאים.
    3. למקם את המספריים האביב בזווית מעל חוט השדרה הפערים בין התהליכים רוחבי-T8 ולעשות אחד1 לנתק לחלוטין את חוט השדרה. מניחים חתיכה קטנה של קצף דחוס לתוך הפער שנוצר 2-2.5 ממ ולהוסיף את תמיסת מלח לאזור מיד.

3. צינור הכניסה

  1. בעת המתנה גדמי כבל קטועה להגיע hemostasis, להוציא את צינור מהערוץ 1 x. לחתוך את המשולשים הקליטה לחתיכות ארוך דק, למקם אותם לתוך הצינור כדי להסיר עודפי PBS. בדוק כי החלונות חתוכות מראש פתוחות.
  2. להסיר את תמיסת מלח ודם באמצעות דק פיסות הקליטה משולשים. הרם את שני העצים הגדועים של חוט השדרה באמצעות microspatula כדי להבטיח הפרדה טובה. בעדינות הרם את הגדם rostral עם microspatula, להחליק את הצינור על הגדם עם החלונות הפונים עצמו. להבטיח הגדם כולו מוכנס אין עודף דימום לתוך הצינור.
  3. בעדינות הרם את הגדם סימטרית, להחליק את הקצה השני של התעלה על הגדם. ודא כי הגדם כולו מוכנס, החלונות הם על המשטח הגבי ( איור 2 א).

4. תאי שוואן / מטריקס להזרקה (ראה טבלה של חומרים) הכנה, הזרקת

  1. בעת המתנה חוט קטועה להגיע hemostasis, להסיר את המדיום מעל בגדר GFP-SC (להכין בשלב 1.2). Resuspend ה-GFP-SCs ב 10 µl של DMEM קר/F12. להוסיף 10 µl של ג'ל להזרקה קר התליה תא ומערבבים היטב על ידי חזר pipetting. לשמור את התערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה על הקרח עד צינור הכניסה הושלמה.
  2. אחרי שתוודא כי החלונות על פני השטח הם הגבי לפתוח ( איור 2 א), להזריק µl 20 של תערובת מטריקס GFP-SC/DMEM/F12/להזרקה לתוך הצינור דרך לאחד windows חתוכות מראש 46 באמצעות אבן חשופה המערבי טעינת עצה ו- micropipette. אם התערובת מטריקס SC/DMEM/F12/להזרקה צריך תמלא יותר מדי הצינור, להסיר את עודף עם הקליטה משולשים. סגור את החלון לאחר ההזרקה; תפירת אינו זקוק ( איור 2B).

5. פצע הסגר ולדאוג לאחר הניתוח

  1. תפר השריר שכבות ושכבות שומן שטחית. לנקות את העור עם 70% אתנול והידוק ואז (למשל, באמצעות סרטוני הפצע) סגור העור. שמור את החיות חממה תרמית מוסדר עד שהם ישובו להכרה. העברת החיות בחזרה לתוך הכלובים. לספק מים צינור האכלה ארוך ומניחים באוכל שלהן על מצעים לגישה קלה.
  2. מנהל הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) פעמיים ביום למשך 3 ימים subcutaneously מתחיל מיד לאחר הניתוח כדי להפחית את הכאב. מזריקים gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously פעם ביום במשך 7 ימים מיד לאחר הניתוח כדי למנוע ולצמצם את זיהום. להזריק 10 מ"ל של פתרון פלאפונים lactated subcutaneously פעמיים ביום במשך 7 ימים לטיפול בהתייבשות.
    3. שלפוחיות
  3. ריק באופן ידני פעמיים ביום עד שלפוחית השתן הפונקציה מחזירה. אם מתרחשת דלקת בשלפוחית השתן, ואז לנהל 10 מ ל תמיסת מלח subcutaneously עד השתן הופך ברור. אם אין שיפור תוך יומיים, להזריק gentamycin (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ופעם ביום) subcutaneously עד השתן הופך ברור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת השימוש בטכניקה כירורגית זו היא להעריך את השימוש של צינור מובנית ו מטריצה להזרקה בדימונה SC פונקציה לאחר השתלת לתוך שידרה transected הושלמה. שלושה שבועות לאחר ההשתלה, החיות הן perfused עם 4% paraformaldehyde, העמודות השדרה בגסות גזור, תיקנו את לשבועיים זהה עבור עוד 24 שעות ביממה. חוט השדרה הוא לאחר מכן גזור, הדגימות למקטעי הווריד cryostat ממוקמים בתוך 30% סוכרוז פתרון עבור cryoprotection. חתכי רוחב בעובי 1 מ מ מבודד באמצע הגשר SC של קבוצה נוספת של ביתור שידרה ממוקמים לתוך גלוטראלדהיד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלב הקריטי ביותר ביצירת מודל חיתוך יעיל קטיעת חוט השדרה ב חתכים אחד או שניים. פער 2-2.5 מ מ בין ליער rostral, סימטרית השדרה צריך להיות נוכח באתר חיתוך. הסיבות ככל הנראה שלושה פער לא מופיע הן שורשים הגחוני הגבי / / (1) שלא הוסרו כראוי, (2) דורא הגחון לא הוסר כראוי, ו/או היה (3) בעל החיים אינו ממוקם כראוי על הסליל להציב תחתיה.

כדי לבצע ההכנסה conduit יעיל בין גדמי: (1) הקוטר של הצינור שלתלמידים מינים ספציפיים, הגיל של החיה המשמשים את הניסוי; (2) שנבזזו להסירו מספיק רוחבית עד, ניתן לאבחן את הפער...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות את וקטור ויראלי ואת חיה ליבות בפרויקט מיאמי תרופה לשיתוק בהפקת הטיפול בבעלי חיים lenti-GFP-וירוס ומספקת, בהתאמה, היסטולוגיה ואת ליבות הדמיה לשימוש של cryostat, מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם החוקר סטריאו. מימון סופק על ידי NINDS (09923), משרד ההגנה (W81XWH-14-1-0482) ואת ה-NSF (DMR-1006510). מ ב בונחה הוא כריסטין E לין נכבדים פרופסור של מדעי המוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקונים קריוגנייםThermoFisher Scientific5000-0020
צלחת פטרי 10 ס"מVWR25382-428
מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת חומרים מזינים F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12" בפרוטוקול.
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher Scientific15140-122"עט/סטרפטוק" בפרוטקול.
סרום בקר עובריHycloneSH300-70-03"FBS" בפרוטוקול.
תמצית יותרת המוחטכנולוגיות ביו-רפואיותBT-215
פורסקוליןסיגמא-אולדריץ'F6886
הרגוליןR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lysineSigma-AldrichP2636"PLL" בפרוטוקול.
מדיום הנשר המותאם של DulbeccoThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" בפרוטוקול.
תמיסת המלח המאוזנת של האנקThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" בפרוטוקול.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
נקבת חולדת פישר (160-180 גרם)Envigo
Vannas מספריים, ישרFST15018-10
קטמיןVedco Inc5098976106100 מ"ג/מ"ל
קסילזיןלויד בע"מAnaSed20 מ"ג/מ"ל
GentamycinAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02יכול להיות כל מותג לבחירה.
מיקרו מריתFST10089-11יכול להיות כל מותג לבחירה.
מספריים מעוקלים עם קצה קההFST14017-18יכול להיות כל מותג לבחירה.
מלקחיים קהיםFST11006-12יכול להיות כל מותג לבחירה.
rongeurFST16121-14יכול להיות כל מותג לבחירה.
מספריים קפיציים זוויתייםFST15006-09יכול להיות כל מותג לבחירה.
משולשי ספיגהFST18105-03יכול להיות כל מותג לבחירה.
קצף ג'להנרי שיין9083300"קצף דחוס" בפרוטוקול.
#10 להביםSklar06-3010יכול להיות כל מותג לבחירה.
מטריגלקורנינג354234"מטריצה להזרקה" בפרוטוקול.
נוגדן חלבון פלואורסצנטי עוף נגדMilliporeAB16901
עכבר RT97 נוגדן היברידומהDSHBRT97
ארנב נוגדן נגד נוירופילמנטEncor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
ארנב פוליקלונלי אנטי גליה נוגדן חלבון חומצי סיביDakoZ033401
Alexa Fluor 488 עיזים אנטי עוף IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 עז נגד ארנב IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 עז נגד עכבר IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
מיקרוסקופיה קונפוקליתניקוןclsi
ירוק

מקורות

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517(2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חתך רוחבי של חוט השדרההשתלת תאי שוואןהשתלת צינוריתמודל של חתך מלאהליך למינקטומיהג'ל מטריקס הניתן להזרקהתאי שוואן עם GFPצינורית PVDF-TrFEדימות פלואורסצנטי קונפוקאלי
השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.