מאמר שיטה

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

DOI:

10.3791/56090

⸱

27 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד חושי חריג ביסוד הקרביים כאב ותסמינים אחרים של מחלות מעיים דלקתיות פונקציונלי. פרוטוקול עבור ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות של העצבים מביא חוקן בהכנה ex-vivo עכברוש colorectum מוצג כאן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקוד העצבים החישה חוקן היה מעורב הפתופיזיולוגיה של מספר מצבים שכיחים, כולל מחלות מעיים דלקתיות פונקציונלי וסוכרת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה אפיון מאפייני אלקטרופיזיולוגיות afferents שטיפת המעי הגס בחולדות. Colorectum, עם שלם האגן גנגליון (עמוד) מצורפים, יוסר העכברוש; superfused עם carbogenated קרבס פתרון בתא ההקלטה; לצינוריות בקצוות אוראלי, אנאלי כדי לאפשר התנפחות. צרור עצבים בסדר שמקורם PG מזוהה, הפעילות העצב מביא multiunit נרשם באמצעות אלקטרודה היניקה. התנפחות של המקטע הגס מעורר הדרגתית העלאות הפרשות multiunit. ניתוח גורמים ראשיים מתנהל להבדיל לסף נמוך, סף הגבוה ואת הסיבים מביא טווח דינמי רחב. רגישות כימית של מעי afferents שניתן ללמוד דרך המינהל אמבט או intraluminal של תרכובות הבדיקה. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור יישום למינים אחרים, כגון עכברים, שרקנים, וכדי ללמוד את ההבדלים במאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של afferents thoracolumbar/hypogastric ו lumbosacral/האגן של המעי הגס היורד רגילה, מצבים פתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העיכול (אידיוט) בעושר innervated עם חיצוני מביא עצבים שיש להעביר אותות החישה מהבטן אל מערכת העצבים המרכזית ואשר תורמות האינטראקציה בטן-מוח. דעתנית מסולף של אלה afferents חיצוני, כמו גם העיבוד המרכזית מסולף על גבי מביא, ביסוד הקרביים כאבים וסימפטומים אחרים של מחלות במערכת העיכול, כולל מחלות מעי דלקתיות פונקציונלי1. החושיות מהרובד colorectum מועברת בעיקר דרך thoracolumbar/hypogastric ואת העצבים lumbosacral/האגן (PN)2. יש כבר עניין מוגבר ללמוד את המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבים אלה מביא העיקרי במודלים המחלה מכרסמים. עם זאת, ויוו אלקטרופיזיולוגיות הקלטות של afferents שטיפת המעי הגס בחולדות הוא אתגר טכני ודורש מיומנויות כירורגית. בנוסף, שינויים והמודינמיקה רקמות תנועה, הרדמה עשוי גם להשפיע פעילות העצבים ורגישות לאור מבחן גירויים ויוו. לכן, בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים המועסקים במבחנה (ex-vivo) ההכנות של מינים שונים, לרבות עכברים, עכברושים, שרקנים, בני האדם, לבחון על מנגנוני התמרה חושית חושית בחוקן afferents, דעתנית שינו את תנאי המחלה. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

שני סוגים של ex-vivo הכנת מעי בעיקר דווחו: "גיליון שטוח" הכנה9,5,, או10 ו- "צינור" הכנה3,4. פרוטוקול וידאו להכנת colorectum מאתר "גיליון שטוח" כבר שפורסמו בעבר11. ב פרוטוקול זה, colorectum העכבר, עם PN) או המותני העצבים splanchnic (LSN) מצורפים, הוא שנקטפו ו superfused תא רקמות. Colorectum נחתך פתוח longitudinally, הצרור עצב מורחב לתוך תא הקלטה מלאה בשמן פרפין. פעילות העצבים נרשם באמצעות אלקטרודת פלטינה-אירידיום monopolar. הפרוטוקול מאפשר הזיהוי של שדות פתוחים לרעיונות של סיבי מביא בודדים באמצעות גירוי חשמלי לא משוחדת. זה רגישה היישום של גירויים כימיים, כמו גם את היישום של פרדיגמות גירוי מכני שונה (למשל, מוקד הרירית חיטוט למתוח במבניו), על קצות העצבים מביא. כי העצב חייב שיורחבו לתא נפרד מן החדר רקמות, זה קריטי לשמור על העצב צמוד יחסית ארוכה; ניתוח מוצלח העצבים מציב אתגר לאלה חדש מתודולוגיה זו. לאחרונה, לאור Nullens. et al. פרוטוקול וידאו עבור ההקלטה במבחנה של afferents מצע המעי העליון jejunal מאתר ועוד מקטעי מעי12. זו הכנה "צינור", קטע בטן עם מצע המעי מצורף נשמרת ללא פגע, ובכך מאפשר התנפחות מדורגת ומינהל אינטרה - ו extra-luminal של כימיקלים שונים. מאז העצב מצע המעי נרשם באמצעות אלקטרודה היניקה, אשר יכול להיות ממוקם קרוב הרקמה, ניתן להקליט מביא פעילות למרות העצב מצע המעי הוא קצר יחסית. עם זאת, העצב מצע המעי מורכב אוכלוסיות מעורבות של הסיבים מביא vagal של עמוד השדרה innervate מעי צם או thoracolumbar hypogastric. Afferents האגן Lumbosacral innervate colorectum, אשר לא יכול שיפלו ב פרוטוקול זה. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות של עכברוש afferents שטיפת המעי הגס באמצעות הכנת colorectum "צינור" עמ' ללא פגע שיטה זו עשויה לאפשר אפיון פונקציונלי מאפייני המותני splanchnic (hypogastric) ו lumbosacral האגן afferents.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הניסוי דיווחו כאן אושרה על ידי חיה אתי הוועדה של שנחאי ג'יאוטונג של הספר לרפואה של אוניברסיטת (# SYXK2013-0050). ניתוח colorectum עם שלם גנגליון, עצבים תא המטען לוקח מינימום של 15 דקות לאדם די מנוסים בטכניקה זו. לכן, יש לשמור את בעלי החיים אבל בחיים תחת הרדמה עמוקה בזמן ביצוע ניתוח, כדי להבטיח יכולת הקיום של הרקמה להקלטה אלקטרופיזיולוגיות עוקבות.

1. הכנה של פתרון זלוף ותרכובות מבחן

  1. להכין 5 L של קרבס פתרון: 113 מ מ NaCl, מ מ 5.9 אשלגן כלורי, 1.2 מ מ NaH 2 PO 4, 1.2 מ מ MgSO 4, 25 מ מ NaHCO 3, 1.2 מ מ CaCl 2 , וגלוקוז 11.5 מ מ. להרוות את הפתרון עם 95% O 2 + 5% CO 2 תערובת. מראש מגניב ~ 500 מ של קרבס מחומצן במקרר.
  2. הכנת aliquots של מניות מבחן תרכובות (קפסאיצין 1 מ מ באתנול וביו -10 מ מ 5-hydroxytryptamine (5-HT) בתוך תמיסת מלח) לפי הצורך. לדלל את המניה בקרבס (עבור יישום אמבט) וב -תמיסת מלח (עבור ניהול intraluminal) לריכוז סופי רק לפני השימוש.

2. הכנת האלקטרודה הקלטה

  1. למשוך האלקטרודה הקלטה סטנדרטי זכוכית צינורות ללא חוטים הפנימי (הקוטר החיצוני של 1.5 מ מ) באמצעות של פולר אלקטרודה קונבנציונלי. התאם את הגדרות פולר חום ולמשוך כך הדוקרן של האלקטרודות משך הוא בין 20 ו- 25 מ מ.

3. אוסף רקמה

  1. להרדים את החולדה עמוקות באמצעות סודיום פנטוברביטל (80 מ"ג/ק"ג, i.p.).
  2. תוך הקפדה על עקרות, לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך קו האמצע בדופן הבטן בעזרת אזמל. למשוך את מצע המעי לרקמות אחרות הצידה כדי לחשוף את colorectum.
  3. במקום החיה תחת המיקרוסקופ ויבתר. דרך ניתוח זהיר, לאתר את PG השמאלי ולזהות את PN, את LSN להצטרף זה. לחתוך עצבים אלה כמה מילימטרים בלבד עמ'
    הערה: PG נמצא קרוב לצומת המעי הגס. בדרך כלל, 3-4 PN חוט השדרה lumbosacral, פרוייקט LSN PG ( איור 1).
  4. לחתוך את העצם symphysis לחשוף את פי הטבעת. הסרת הרקמות (קרי, שלפוחית השתן, וכו ') מעל colorectum; יש להקפיד להשאיר את עמוד שלם.
  5. להקריב את החולדה על ידי הזרקה תוך ורידי של מנת יתר של פנטוברביטל. Transect המעי הגס 3 ס מ מעל PG ולהסיר את colorectum מן החיה באמצעות מלקחיים.
  6. להעביר את colorectum צלחת פטרי מלא עם פתרון קרבס טרום מקורר. הסר את הצואה על ידי שטיפה בעדינות את המעי הגס. להסיר את שלפוחית השתן שריד ורקמות אחרות בקפידה, מבלי להתפשר על עמ'

4. דיסקציה של העצבים מביא חוקן

  1. למקם את המעי הגס לתא הקלטה (20 מ ל), perfuse את הרקמה באופן רציף עם carbogenated פתרון קרבס. הגדרת הקצב זלוף-15 מ"ל לדקה
  2. נקרר את colorectum בשני קצותיו אוראלי, אנאלי. נתחיל העירוי intraluminal של המעי הגס עם תמיסת מלח בקצב של 10 מ"ל/h – בכתב על כיוון אנאלי.
  3. אתר של PG הגדולות תחת המיקרוסקופ ויבתר. להשתמש בפינים חרקים כדי לחשוף גנגליון. עם ניתוח זהיר, למצוא ענף בסדר של עצב שמקורם גנגליון, רץ לכיוון המעי הגס ( איור 1). חתך העצב קרוב גנגליון.
    הערה: איור 1 מדגימה הקלטה מענף עצב דיסטלי כדי עמ' ככל הנראה, העצב מכיל תערובת של האגן ועמוד שדרה וכן סיבים מביא splanchnic. לחלופין, הקלטה יכול להתבצע על PN ו/או את LSN הפרוקסימלית עמ'
  4. להפעיל חימום ואמבט חם הפתרון קרבס כדי לשמור על הטמפרטורה קאמרית ב ± 0.5 34 מעלות צלזיוס.

5. הכנת האלקטרודה שאיבה

  1. לקחת על פיפטה מזכוכית מראש משך (שלב 2), יש לבדוק אותו תחת המיקרוסקופ ויבתר. לשבור את קצה האלקטרודה עם זוג מלקחיים כך שיהיה תואם הקוטר של עצב שיירשמו בגודל.
  2. מסגרת משופעת הקצה על-ידי הצבתו קרוב קרני אור בהיר יותר.

6. הקלטה אלקטרופיזיולוגיות

  1. חיבור האלקטרודה משופע עם בעלי אלקטרודה. מזרק 10-mL להתחבר ליציאה בצד את המחזיק להחלת לחץ שלילי או חיובי על האלקטרודה.
  2. להתחבר המחזיק headstage של bioamplifier והר את headstage על גבי תחמן.
  3. לעבור האלקטרודה האמבט רקמות ולמלא את האלקטרודה עם הפתרון קרבס על-ידי החלת יניקה עדינה עד זה יוצר קשר החוט כסף של בעל. מקם קצה האלקטרודה קרוב לסוף חיתוך העצב והפעילו לחץ שלילי למצוץ העצב אל האלקטרודה. הפעילו לחץ שלילי יותר כך ~ 1 מ"מ של העצב נמשך אל האלקטרודה וצורות חותם צר.
  4. התור על bioamplifier ועל ערכת המסנן כדי 300-3,000 הרץ. האות המשודר אוסצילוסקופ לפקח ולתעד את האות העצבי (קצב הדגימה 20 kHz), האות לחץ intraluminal (קצב הדגימה 100-הרץ) באמצעות מחשב עיבוד הנתונים ספייק תוכנה-

7. בדיקת הרגישות מביא חוקן

  1. החל התנפחות הרמפה של המעי הגס על ידי סגירת הברז משולשת על הצינורית עודפים תוך החדרת ברציפות intraluminally. לנטר את הלחץ intraluminal עד שהוא מגיע 60 מ מ כספית, ובו בזמן פתח את הברז משולשת על בצינורית המנקזים.
  2. חזור על הליך זה במרווחי זמן קבועים של סמים החל 15 דקות נוספות - או intraluminally כדי לבדוק את הרגישות כימי של העצבים מביא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 הוא האיור סכמטי של ההתקנה ניסיוני להכנת colorectum ex-vivo "צינור", עם נציג הקלטה של עצב דיסטלי עמוד אחד העצב הכיל ככל הנראה תערובת של afferents splanchnic האגן, המותניים. ההכנות של חולדות רגילה, העצבים מביא שטיפת המעי הגס בדרך כלל יש רמה נמוכה של פעילות ספונטנית לא סדיר. הרמפה התנפחות של המעי הגס גורם עלייה הדרגתית קצב ירי (איור 1B). המאפיין mechanosensory של כל העצבים מיוצג על ידי התוויית עקומת תגובת עצב לחץ-מבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה ניסיונית פשוטה יחסית כדי להעריך את מאפייני אלקטרופיזיולוגיות afferents חוקן של חולדות. הפרוטוקול (מתוך רקמת לנתיחה להגדרת ההקלטה עצב) בדרך כלל לוקח בערך 2 h כדי להשלים. אוסף רקמה (שלב 3) המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות לשלבים הקריטיים הכנה של האלקטרודה היניקה (שלב 5). זה חיוני להיות מסוגל לאתר את PG את LSN, את PN, לדאוג שלא יגרמו נזק על גנגליון ועצבים במהלך ניתוח רקמה. קצה פיפטה מזכוכית חייב להיות שבור, משופע לגודל תואם הצרור עצב.

ההכנה הוא בדרך כלל קיימא ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקי מחקר את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (#31171066, #81270464) ומרכז המדע הגרמני-סין (GZ919).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן פנטוברביטלשנחאי ווסטנג ביו-טקB558
קפסאיציןסיגמאM2028
חולץ אלקטרודותMicroData Instrument IncPMP107
מערכת נוירולוגית (ביו-מגבר)Digitimer, Ltdמערכת
ממיר A/Dקיימברידג' עיצוב אלקטרוניMicro1401
תוכנה לעיבוד נתוניםקיימברידג' עיצוב אלקטרוניSpike2 גרסה 6
חוט כסףמכשירי דיוק עולמייםEP12
צינורות זכוכיתמכשירי דיוק עולמיים1B150-4
מחזיק אלקטרודהמכשירי דיוק עולמייםMEH3SBW
חימום אמבטיהמענקGR150
ניתוח מיקרוסקופLeicaZoom2000
ניתוח מיקרוסקופמכשירים מדויקים בעולםPZMIII-BS
מציתכלNA
כלים כירורגייםמכשירים מדויקים בעולםNA
סיכות חרקיםתוצרת בית חוט נירוסטה 0.1 מ"מNA
מניפולטורתלת כיווניWorld Precision InstrumentsKITF-R
חולדותכלNAניתן להשתמש בכל זן/מין.
נוירולוג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
  10. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
  11. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  12. Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
  13. Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
  14. Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
  15. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  16. La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים