פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה
במאמר זה
סיכום
תקציר
AWESAM ( הלאוw-עלות easy stellate strocyte מ'ethod) פרוטוקול כרוך דרך מהירה, פשוטה וזולה להפקת כמויות גדולות של in vivo-כמו עכבר, חולדה monocultures אסטרוציט : תאי המוח ניתן לבודד אזורים שונים במוח, אחרי שבוע של תרבית תאים, התאים הלא-astrocytic הם ניערתי מעליי על-ידי הצבת הכלים תרבות על מטרף עבור 6-אייץ ' בחממה. האסטרוציטים הנותרים הם passaged ואז לוחות חדשים בינונית אסטרוציט ספציפיים (הנקרא NB + H). NB + H מכיל ריכוזים נמוכים של הפארין מחייב EGF פקטורי גדילה דמויי (HBEGF), אשר משמש במקום סרום בינוני. לאחר גידול ב- NB + H, AWESAM האסטרוציטים יש תכונה תהליכים בסדר ומורפולוגיה stellate. יתר על כן, האסטרוציטים אלה יש יותר ויוו-כמו ביטוי גנים מאשר האסטרוציטים שנוצר על ידי שיטות שפורסמו בעבר. Ca2 + הדמיה, שלפוחית dynamics ואירועים אחרים בקרבת הקרום שניתן ובכך יהיה לחקור את התהליכים astrocytic בסדר במבחנה, למשל, באמצעות וידאו בשידור חי התא או מיקרוסקופ TIRF. ראוי לציין, AWESAM האסטרוציטים גם התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות דומה האסטרוציטים ויוו.
מבוא
האסטרוציטים להשפיע על תפקוד המוח באמצעות תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, איתות סינפטית, פלסטיות ותקשורת המערכת - כל אלה הם מנגנונים מרכז סביב התהליכים astrocytic דק. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן מאפשר חקר תהליכים אלו ללא הפרעה בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד, אשר הוא שימושי למשל, כי הביטוי של חלבונים רבים ו- Ca2 + איתות אפילו חופפים מעבר לתא מוח סוגי. עוד יותר, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות זמינים בעבר. בפרט, פרוטוקול שלנו מספק ויוו-כמו מורפולוגיה (stellate האסטרוציטים עם תהליכים דק), ביטוי גנים, מהיר, קל, ואופן זול.
מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים רבים תהליכים רגולטוריים אחרים מושפעים ישירות הסביבה. בקערה תרבות, ז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות עבור רווחת גרמני.
הערה: ציר הזמן ואת השלבים העיקריים של הפרוטוקול מומחשים באיור1.
1. תכשירים
-
הכינו את הפתרונות הבאים.
- להכין DMEM + culturing האסטרוציטים MD polygonal: DMEM עם 10% FCS, פניצילין U 100 100 סטרפטומיצין µg/mL.
- להתכונן NB + H culturing האסטרוציטים stellate: neurobasal בינוני עם 5 ננוגרם למ"ל HBEGF, 1 x B-27 תוספת, תוספת גלוטמין x 1, 100 פניצילין U ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL.
הערה: Aliquots של ריכוז גבוה של HBEGF יכול להיות מוכן ומאוחסנים ב-20 ° C להתווסף המדיום בכל פעם שיש צורך.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
האסטרוציטים תרבותי משותף עם נוירונים, גדל ב- NB + בינוני מופיעים stellate לאחר 2 שבועות של תרבות (איור 2). בנוסף NB + בינוני, האסטרוציטים תרבותי משותף נחשפים גם לא ידוע נגזר נוירון גורמים שתורמים סביר שלהם הישרדות, מורפולוגיה. לעומת זאת, MD האסטרוציטים גדלו ב DMEM + כמו monocultures (לאחר וניעור סוגי תאים אחרים לפני המעבר) מופיעים מצולע לאחר שבועיים. האסטרוציטים AWESAM גדל ב- NB + H לאחר טלטולים, מופיעים stellate עם תהליכים רבים בסדר לאחר 2 שבועות של תרבות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ארבעה שלבים בתוך הפרוטוקול הן קריטיות: 1) הכנת ריכוז HBEGF כדי בדיוק 5 ng/mL, מאז עליות קטנות הריכוז יכול להוביל תרבויות לא בוגר, למשל10 ננוגרם למ"ל HBEGF de-להבדיל האסטרוציטים4; 2) בועות הימנעות בפתרונות מכילים רקמה או תאים, אשר ניתן לשנות את ה-pH, לעכב אסטרוציט בריאות; 3) מראש equilibrating מדיה כדי להשיג את ה-pH האופטימלי ואת הטמפרטורה לגידול בריא האסטרוציטים; 4) החלפת רק חצי המדיום פעם בשבוע כי כל מיקרוגלייה הנותרים נוטים פחות להתרבות כאשר מספיק חומרים מזינים נוכחים המדיום המוחלפות בק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו להכיר במימון המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/260916), את אלכסנדר פון הומבולדט-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), פתוח (DE1951 ו- SFB889).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.05% טריפסין-EDTA | גיבקו | 25300054 | חם ב-37 & C אמבט מים לפני השימוש |
| 0.25% טריפסין-EDTA | Gibco | 25200-056 | חם ב-37 & אמבט מים C לפני השימוש |
| תוסף B-27 | Gibco | 17504-044 | מלאי 50X |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | מלאי 100X |
| פניצילין / סטרפטומיצין | Gibco | 15070-063 | 50 מלאי; פניצילין: 5000 U/ml; סטרפטומיצין: 5000 ומיקרו; גר'/מ"ל |
| נוירובזל בינוני | Gibco | 21103049 | ללא L-גלוטמין |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μ מסננת תאי ניילון M | BD | 352360 | |
| טריפן כחול | סיגמא | T8154 | |
| חממת תרביות תאים | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i חממת | |
| שייקר מעבדה | Heidolph | Rotamax 120 | השתמש בתוך חממת תרבית תאים |
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5810 R |
מקורות
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
