מאמר שיטה

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

DOI:

10.3791/56100

⸱

3 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צינורות multicellular, יחידות היסוד של האיברים הפנימיים הכל, מורכבים של תאי אפיתל או אנדותל מקוטב, עם ממברנות הפסגה רירית בקרום לומן, basolateral קשר עם אחד את השני ו/או של מטריצה חוץ-תאית. איך אסימטריה ממברנה הייחודי הזה הוא הוקם ומתוחזק במהלך מורפוגנזה איברים היא עדיין שאלה לא פתורות של ביולוגיה של התא. פרוטוקול זה מתאר את המעי C. elegans כמודל לניתוח של קרום מקוטב להן במהלך מורפוגנזה שפופרת, תוך שימת דגש על הפסגה להן קרום של לומן. C. elegans עשרים תאים הכוללים שכבה אחת מעיים האפיתל מסודר לתוך צינור נשימה סימטרית פשוטה, המתיר ניתוח ברמה תא בודד. ממברנה קיטוב מתרחשת/ת עם חלוקת התא מקוטב והעברה במהלך מופרה מוקדם, אבל דה נובו מקוטב להן קרום ממשיך לאורך כל התפתחות הזחל, כאשר התאים כבר לא להתרבות ולהעביר. ההגדרה השנייה מאפשרת להפריד subcellular שינויים בו-זמנית המתווכות שונים מהפכנית תהליכים אלה, קשה להבחין רוב הדגמים קוטביות. הפסגה, basolateral ממברנה-, מהחיבור-, cytoskeletal- ו endomembrane רכיבים שניתן שכותרתו, רחבי פיתוח על ידי GFP פיוז'ן חלבונים או לאומדן בחיי עיר מכתים נוגדן. יחד עם צדדיות הגנטי של האורגניזם, המעי C. elegans ובכך מספקת מודל ייחודי ויוו על ההמחשה, התפתחותית, ניתוח גנטי מולקולרי של קרום מקוטב, שפופרת להן. שיטות ספציפיות (הכל רגיל) המתוארים כאן כוללים כיצד: תווית מעיים רכיבים subcellular על ידי נוגדנים מכתימה; לנתח את הגנים המעורבים ממברנה מקוטב להן על ידי מחקרים אובדן-של-פונקציה מותאמת הגנים tubulogenesis בדרך כלל חיוני; להעריך את הקוטביות ליקויים בשלבים התפתחותיים שונים; לפרש פנוטיפים epifluorescence, התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), מיקרוסקופיה קונפוקלית; לכמת לקות. פרוטוקול זה ניתן להתאים כדי לנתח כל של מולקולות שנשמרת לעיתים קרובות מאוד מעורב קוטביות אפיתל, להן קרום, מורפוגנזה ובשעות לומן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדור של הסלולר, subcellular asymmetries, כגון היווצרות קרום מקוטב תחומים, חיונית מורפוגנזה והתפקוד של תאים, רקמות ואיברים1. מחקרים על קרום מקוטב להן ב- epithelia להישאר אתגר טכני, מאז כיוונית שינויים בחלוקת רכיבי subcellular תלויים מרובות רצופות, וצירוף חוץ-תאית, תאיים אותות? קשה להפריד בין רוב הדגמים ותלויות חריפה במערכת מודל. המודל המוצג כאן - את הכוללים שכבה אחת Caenorhabditis elegans המעי - הוא רקמה של פשטות משובח. יחד עם החד-תאיים C. elegans excretory תעלה (ראה המלווה נייר על קרום מקוטב להן בתוך התעלה excretory C. elegans )2, הוא מספק מספר יתרונות ייחודיים לצורך הזיהוי ו אפיון של מולקולות הדרושות להן קרום מקוטב. שימור רמזים קוטביות מולקולרית של שמרים לאדם להפוך איבר הגעה פשוטה זה מצוין"ויוו רקמות הקאמרית" שאלות לגבי אפיתל קוטביות שאינן רלוונטיות ישירות למערכת האנושית, שהיא עדיין יותר מדי מתחם כדי לאפשר את הקרע חזותי של אירועים אלה על הסינגל תא רמה בתוך vivo.

למרות מספר רמזים שנשמרת קוטביות מטריצה extracelluar (1), (2) קרום פלזמה, צמתי, והאטרקציות (3) vesicular וגדילת היה להיות מזוהה3, עקרונות היסוד של שילובם בתהליך של מקוטב להן קרום של רקמת אפיתל הוא ממעטים להבין4. קלאסית תא בודד ויוו הדגמים (e.g.S. cerevisiae וגם את הזיגוטה C. elegans ) סייעו בהגדרת עקרונות מקוטב חלוקת התא הקדמי-אחוריים קוטביות, זיהו קריטי ממברנה-הקשורים קוטביות גורמים (קטן GTPases/CDC-42, את PARs תקינה למחיצות)5,6, אבל הם תלויים סימטריה ייחודי שבירת רמזים (ניצן הצלקת, הזנת הזרע) וחסרי מאובטחת-צומת apicobasal ממברנה תחומים, ככל הנראה, את apicobasal תאיים המתאימים מיון מכונות. הידע הנוכחי שלנו אודות ארגון מקוטב בבני אדם epithelia, עם זאת, בעיקר מסתמך על monocultures 2D בתרבית של7, אשר חסרים פיזיולוגיים רמזים חוץ-תאית והפיתוחים שיכולים לשנות עמדות של קרום תחומים וכיוונים של מסלולי הסחר בבני אדם (מתג ועד לכרטיסי תלת-ממד in vitro לקשרי תרבות מערכות לבד מספיק כדי היפוך קוטביות הממברנה בתאי MDCK (מדין טומי הכלבי הכליה))8. In vivo מחקרים התפתחותיים על קוטביות אפיתל דגם הגעה אורגניזמים נערכו תחילה epithelia שטוח, למשל באפידרמיס דרוזופילה melanogaster , איפה הם זיהו את התרומה קריטי צומת dynamics נדידת תאים מקוטב, תנועה לתא גליון9, ואת endocytic סחר קוטביות תחזוקה10. תלת-ממד במבחנה וניתוח ויוו של לומן מורפוגנזה ב epithelia צינורי בתאים MDCK ו במעי C. elegans , בהתאמה, לאחרונה זיהו את הדרישה של וגדילת עבור דה נובו תחום (הפסגה) ו לומן להן והמיקום11,12,13. העובי של הכרישים (לעומת שטוח) לתאי האפיתל היא יתרון לניתוח 3D של subcellular asymmetries מאז היא מתירה הבחנה חזותית מעולה של קרום הפסגה-lumenal, apico-לרוחב צמתי, ממברנה לרוחב, ו עמדות organelles תאיים. יתרונות אלו חזותי, דגם C. elegans מוסיף vivo בתוך ההגדרה, ציר התפתחותית, שקיפות, הפשטות של תוכנית גוף, שושלת היוחסין של תאי קבוע ומוגדר, אנליטי (גנטית) ויתרונות נוספים המתוארים להלן.

C. elegans עצמו הוא התולעת העגולה של מבנה צינורי שקיפות של מי ואדריכלות פשוטה להפוך את האיברים הפנימיים בדומה צינורי נגישים ישירות לניתוח חזותי של לומן ובשעות מורפוגנזה. תאי עשרים שלו המעי (21 או 22 תאים מדי פעם)14 נגזרים מתוך תאים ובתאים יחיד (E) ולפתח של האפיתל שכבות כפול על ידי העיבור צעד לתוך צינור נשימה סימטרית של תשע טבעות INT (ארבעה תאי הטבעת הראשונה; איור 1 סכמטי)14,15,16. ניתוח שושלת היוחסין ורקמות של המעי, בתחילה נקבע על-ידי Nomarski אופטיקה באמצעות זהויות גרעיני17ולאחר מכן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ דרך ממברנות שכותרתו, סיפקה קריטי תובנות מורפוגנזה שלה, ב מסוים הדרישות תא-אוטונומי, תא-שאינם-אוטונומי שלו חלוקות תאים כיוונית, תנועות (למשל, העיבור, מימין asymmetries, סיבוב התחתית anterior ואת אחורי)14,18 . בתחילת תא endodermal מפרט את רשת גנטית שליטה על התפתחות איבר המשובטים מודל זה טוב מאופיין19,20בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. במוקד הדיון כאן, זאת, על הניתוח של קרום מקוטב ושל לומן להן בתאים צינורי יחיד, ושל את asymmetries תאיים של endomembranes, מבנים cytoskeletal organelles המלוות תהליך זה. הניתוח בהנחייתם של הפשטות של הרכבת התחתית, איפה כל הפסגה ממברנות (ברמה ultrastructural מכובד על-ידי microvilli) מול לומן עם ממברנות הבזליים כל הפנים השטח צינור חיצוני, עם ממברנות לרוחב פנייה אל אחד את השני, הופרדו קרום הפסגה על-ידי צמתים (מפרטים טכנייםאיור 1 ; ראה הפניות (16,21) עבור C. elegans-ארגון ספציפי חזק ורכיבים צומת adherens). ממברנה הפסגה להן היא לפיכך חופפת מורפוגנזה לומן. יתר על כן, גודל תאי המעי למבוגרים - התאים הגדול של חיה קטנה זו (עם חריג של התא excretory) - אומדן גודל תא יונקים, המתיר ויוו חזותי המעקב של אלמנטים subcellular, למשל מסלולים שלפוחית, זה בדרך כלל ניסיון במבחנה בקערה תרבות.

למטרת ניתוח זה הסלולר, subcellular, תיוג מתאים הוא קריטי. מעיים אנדו - או -קרום פלזמה תחומים, צמתים, cytoskeletalעל-ידי תיוג ומרכיביהם מולקולרי מסוים, ניתן לאבחן מבנים, גרעינים, organelles subcellular אחרים. רכיבים רבים כאלה כבר שאפיינו וממשיכים להתגלות (טבלה 1 נותן כמה דוגמאות, מתייחס משאבים). למשל, מולקולות שונים הבחנה התאים צינורי ו/או vesicular של המערכת endomembrane מעיים, מחדר המיון גולג'י דרך פוסט-גולג'י שלפוחית על קרום פלזמה, היה מזוהה22. ספציפי חלבונים (כמו גם שומנים, סוכרים) יכול גם להיקרא במישרין, או בעקיפין באמצעות איגוד חלבונים. פרוטוקול זה מתמקד בחיי עיר נוגדן מכתים של דגימות קבוע, אחד של שתי טכניקות תיוג סטנדרטי (לראות את הנייר הנלווה על תעלת excretory tubulogenesis לקבלת תיאור של אחרים בטכניקת2 - ויוו תיוג באמצעות חלבון פלואורסצנטי fusions - אשר חל ישירות המעי; טבלה 2 מספק דוגמאות של היזמים המעי ספציפי שיכול לשמש לנסוע ביטוי של חלבונים היתוך כזה המעי). זוגי - או תיוג מרובים עם גישה או, או עם שילוב של שניהם פלוס נוספים כימי מכתים, מאפשר יותר מעמיק רזולוציה ויזואלית, בחינת שינויים יכולות בלוקליזציה שיתוף בגיוס ספציפי מולקולות או מרכיבים subcellular (איור 2). את הקיבעון, צביעת בהליכים המתוארים תחת תמיכה בפרוטוקול שימור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג במהלך הליכי immunostaining. עבור הדמיה, מפתח נקודות הזיהוי ותיאר אפיון tubulogenesis פנוטיפים באמצעות הליכים סטנדרטיים מיקרוסקופיים (קרינה פלואורסצנטית ויבתר ו קונאפוקלית מיקרוסקופ) הם (איור 3, 4). אלה ניתן להרחיב ברזולוציה גבוהה יותר הדמיה גישות, עבור מופע superresolution מיקרוסקופ ושידור מיקרוסקופ אלקטרונים (לא המתוארים כאן).

בחוזק המפתח של מערכת זו הוא היכולת לנתח קוטביות בתאים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים, מן מופרה דרך לבגרות. למשל, ממברנה הפסגה לומן והתחום להן ניתן לעקוב במהלך פיתוח ברמה תא בודד באמצעות תיוג עם ממברנה שנשמרת מאוד-אקטין מקשר של אזרין-Radixin-Moesin משפחה23,24, ERM-1 . ERM-1 מדמיין להן קרום הפסגה (1) במהלך מורפוגנזה צינור עובריים, כאשר היא מתרחשת יחד עם חלוקת התא מקוטב, העברה (להעביר תאים apically סביב לומן בזמן העיבור)15; (2) במהלך מאוחר שלוחה שפופרת של זחל ממשיך בהיעדרו של חלוקת התא או ההעברה; (3) במעי למבוגרים, שבו קרום מקוטב תחומים נשמרות (איור 1). בתוך האפיתל זחל שלאחר mitotic מתרחבת, דה נובו מקוטב ממברנה להן ובכך ניתן להפריד מן מורפוגנזה רקמות מקוטב, שאינו אפשרי רוב הדגמים ב- vivo ו- in vitro לקשרי קוטביות אפיתל, כולל עם רזולוציה תא בודד (למשל 3D MDCK ציסטה דגם8). עם תיוג עבור רכיבים אחרים, הגדרה זו מספקת את ההזדמנות (במיוחד ב- L1 הזחל כאשר התאים יש יחס ציטופלזמה/גרעין גבוה יותר) כדי להבחין בין שינויים תאיים אלה שהינם ספציפיים מקוטב (להן קרום למשל ולהתפכחות של מסלולי הסחר בבני אדם) אלה/ת הנדרשים עבור חלוקת התא מקוטב והעברה.

צדדיות גנטי של C. elegans הוא ידוע25והופכת אותו מערכת מודל רב עוצמה לניתוח מולקולרית של כל שאלה ביולוגית. מחקר על מורפוגנזה, למשל, יכול להתחיל עם זן פראי-סוג, זן מהונדס שבו המבנה של הריבית (למשל קרום) נקראת עם סמן פלורסנט, או עם מוטציה הפסד או רווח-של-פונקציה עם פגם בזה מבנה. מחקר גנטי הפוכה טיפוסי עשוי ליצור מוטציה איפה הגן עניין נמחק ב germline (למשל על ידי מחיקה יישוב), השתנה על-ידי מוטגנזה מכוונת (בדרך כלל לייצר מוטציות נקודה עם אובדן הסוגר, הפחתה או הגברה בפונקציה של הגן), או איפה התעתיק שלו הוא מופחת על ידי RNAi. הקלות של RNAi מאכילים ב- C. elegans26 גם משאיל את עצמו בעיצוב של מסכי יישוב לבחון קבוצה גדולה יותר של הגנים של עניין. הכוח החזק ביותר ניתן לטעון של אורגניזם מודל גנטי הוא היכולת לנהל ויוו קדימה המסכים (למשל מוטגנזה מכוונת, מסכי שיטתית או ברמת הגנום RNAi) כי היתר חקירה לא משוחדת על הסיבה מולקולרית הפנוטיפ של ריבית. למשל, לא משוחדת visual C. elegans RNAi tubulogenesis מסך, החל חיה הטרנסגניים עם ממברנות הפסגה ERM 1-שכותרתו, גילו של המרה קוטביות מעיים הפיך מסקרן פנוטיפ לומן חוץ רחמי, המשמש כאן כדוגמה עבור סוג זה של ניתוח. מסך זה זוהה דלדול של glycosphingolipids (GSLs; ממברנה גידול שומנים, מזוהה באמצעות אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר GLS שלהם) ורכיבים של clathrin המעיל של שלפוחית, מתאם AP-1 שלו הליקויים מולקולרי מסוים גורם קוטביות זו פנוטיפ ההמרה, ובכך אפיון אלה סחר מולקולות כמו ויוו רמזים עבור ממברנה הפסגה קוטביות ו לומן מיצוב12,13. כאשר החל הפנוטיפ מוטציה גנטית ספציפית/מורפוגנזה, מסכי כזה (או ניסויים יחיד האינטראקציה הגנטית/RNAi) ניתן גם לבחון פונקציונלי האינטראקציות בין גנים מרובים או עניין (ראה המלווה נייר על excretory תעלת לקבלת דוגמה של ניתוח כזה)2. פרוטוקול זה מתמקד RNAi אשר, בנוסף היכולת שלה ישירות לזהות את הגן אובדן אשר גורמת פנוטיפ של המסכים הקדמיים, מספק יתרונות ספציפיים לניתוח של מורפוגנזה. מאז הגן מוצרים בימוי מורפוגנזה לעיתים קרובות עובדים באופן תלוי מינון, RNAi הוא מצליח בדרך כלל יוצר קשת של פנוטיפים. היכולת להפיק פנוטיפים חלקית-אובדן-של-פונקציה אינפורמטיבי מסייעת גם לטפל בבעיה כי הרוב המכריע של גנים tubulogenesis חשוב הם חיוניים, כי ההפסדים שלהם לגרום עקרות, lethality עובריים מוקדם. פרוטוקול זה כולל אסטרטגיות RNAi מותנה כדי להתגבר על הקושי הזה, מציע דרכים כדי למטב את הדור של קשת רחבה של הפנוטיפים, כגון סדרות allelic המיוצר על ידי מוטגנזה מכוונת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תיוג המעי C. elegans

הערה: ראית את העיתון המלווה על ידי המחברים על הניתוח של תעלת excretory tubulogenesis 2 לבנייה של רקמות ספציפיות סמן פלורסנט פלסמידים, הדור של בעלי חיים מהונדס, כולל דיונים על גנים ברמת השעתוק והתרגום פיוז'ן חלבונים (האחרון נדרש עבור ההתאמה subcellular של מולקולה עניין). הליכים אלה ניתן להתאים באמצעות היזמים ספציפיים כדי להסיע את המולקולה עניין אל המעי. ראו טבלה 1 לדוגמאות של מולקולות הוכח שימושית ליצירת אפקטים של C. elegans מעיים אנדו - ו ממברנות פלזמה והצמתים שלהם, בטבלה 2 לדוגמאות של היזמים על נהיגה הביטוי אל המעי, טבלה 3 עבור משאבים עבור אוספים מקיף יותר של סמנים מעיים היזמים.

27 ,
  1. נוגדנים מכתים של המעי C. elegans 28
    1. קיבוע
      1. קח זכוכית נקייה ולהשתמש פולי-L-ליזין ל הפקת סרט דק תולעים לתקוע. מקום 30 µL 0.1-0.2% פולי-L-ליזין על שקופית ומניחים שקופית שנייה על המסירה פולי-L-ליזין כדי להפוך " כריך ". ואז לשפשף את השקופיות בעדינות מספר פעמים רטוב משטחים כולו של שניהם ולתת להם אויר יבש במשך 30 דקות תווית שבתוכי השקופיות עם עיפרון.
        הערה: 0.2% פולי-L-ליזין aliquots של 200 µL נעשו על ידי המסת אבקה dH 2 O; זה ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. שימוש משקל מולקולרי גבוה פולי-L-ליזין עבור שיפור דבק של התולעים. הריכוז של פולי-L-ליזין גם היא קריטית. ריכוזים נמוכים יותר מדי לא תאפשר תולעים להישאר אבל ריכוז גבוה מדי עשוי ליצור אות רקע זריחה. סרט עבה מדי עלולה להשתחרר בשלמותו.
      2. מקום גוש המתכת השטוחים בחוזקה בתחתית מיכל (למשל מיכל פוליסטירן) מלא עם חנקן נוזלי.
        הערה: ניתן יהיה להשתמש בקרח יבש במקום, אך חנקן נוזלי ממשיך גוש מתכת יציבה יותר בתחתית המיכל, מקפיא טוב.
      3. תולעים לאסוף גם באופן שוטף בעזרת M9 29 או לבחור במה שונים תולעים (גם ביצים, L1, L2, L3 L4 או הפרפרים והעשים תולעים) על כל שקופית. בדרך כלל, לבחור ~ 100 הזחלים של העוברים או מבוגרים ~ 20 לכל שקופית. מקום 10 µL נשטף תולעים אל האמצע של השקופית או לאסוף ביצים/תולעים לתוך 10 µL M9 או µL 10 1 x PBS 27 (buffered פוספט תמיסת מלח).
        1. שימוש פיפטה ץיפהל מספרים גדולים של תולעים כדי להימנע clumping.
          הערה: מעורב אוכלוסיות של נשטף תולעים, בשל הצפיפות ושונה עובי של שלבים, לא מקל טוב והם פחות ביעילות ההקפאה-סדוק (ראה להלן), לכן תולעים ספציפיות שלב האיסוף (או אוכלוסיות מסונכרן) נותן תוצאות משופרות. הזחלים מקל יותר טוב מאשר מבוגרים, בעלי החיים ניתן להציב לכל שקופית.
        2. לפני האיסוף תולעים על שקופיות, להעביר אותם צלחת בינונית צמיחה תולעים נימיות (NGM) 29 ללא חיידקים OP50. עודף חיידקים ו"היסטוריון התולעים יכול גם להפריע דבק. . שמור על עצמך כי תולעים לא יתייבש.
      4. בעדינות המקום (טיפה) 22 מ"מ × 22 מ"מ coverslip קרוס-דרכים על גבי שנאספו תולעים כזו הקצוות שלה התפחמלות בצד אחד לפחות של השקופית. ממשיכים ישר למטה בעדינות אך בחוזקה עם אצבע אחת או שתיים coverslip למנוע הטיה זה יגרום נזק רקמות תקינות.
      5. מיידית ובעדינות להעביר את השקופית גוש המתכת בחנקן נוזלי ולתת לו לשבת במשך כ- 5 דקות כדי להקפיא. ואז " קפיצי את " coverslip של סוויפט אחד להעביר באמצעות את קצה התלויים.
        הערה: שלב זה חייב להיעשות באופן מוחלט, ובזמן השקופית קפוא כדי להשיג " פיצוח " של הקוטיקולה. התראה: אנא פעל בהתאם להנחיות עיקרון השוויון הפוליטי (ציוד הגנה אישי) בעת עבודה עם חנקן נוזלי.
      6. לטבול את ההקפאה היא רגילה מחליק לתוך מתנול-מילוי רקע צנצנת זכוכית Coplin 5 דקות ב-20 ° C. ואז להעביר אצטון-מילוי רקע צנצנת זכוכית Coplin עוד 5 דקות ב-20 מעלות צלזיוס
        הערה: מתנול אצטון צריך להיות מאוחסנים ב-20 ° C במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש. לאחר קיבוע, ניתן לאחסן שקופיות ב-20 ° C. זהירות: מתנול, אצטון רעילים.
      7. להסיר את השקופיות הצנצנת ולתת להם אויר יבש בטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
    2. Staining
      1. להקיף שטח של תולעים קבוע עם שכבה דקה של ריבה נפט בשקופית. צייר עיגול מסביב לאזור זה על החלק התחתון של השקופית כדי לסמן את המקום.
        הערה: זה קריטי כי המעגל ג'לי נשאר שלם לאורך כל ההליך מכתימים כדי למנוע דליפה של פתרונות מכתימים.
      2. הכן " קאמרית רטוב " בתוך סל פלסטיק עם מכסה על ידי הנחת נייר רטובות לתוך זה. למקם את השקופית לתוך ארון זה " קאמרית רטוב " כדי למנוע את התייבשות של השקופיות במהלך צביעת.
        הערה: שקופיות לא צריך להיות במגע עם מים או עם אחד את השני.
      3. בעדינות פיפטה כ PBS 1 x µL 50 למעגל ג'לי, מספיק כדי לכסות את האזור. סגור " קאמרית רטוב " עם המכסה. תקופת דגירה-RT של 5 דק
        הערה: כדי למנוע איבוד תולעים בשלב זה, לא פיפטה PBS ישירות על גבי התולעים. בעדינות למקם פיפטה עצה בקצה העיגול ולאפשר נוזל להתפזר בצורה חלקה על התולעים.
      4. להטות את השקופית, לאט מחוק לגמרי מגניב עם פיפטה. מקם את השקופית שטוח בחזרה על המדף ולהוסיף 50 µL (או את הסכום הנדרש כדי לכסות את המקום) חוסם הפתרון בקפידה. דגירה זה בבית הבליעה רטוב-RT למשך 15 דקות. תוך כדי המתנה, לדלל את הנוגדנים העיקרי בחסימה פתרון (ראה טבלה של חומרים לדוגמאות של נוגדנים העיקרי וריכוזי).
        הערה: טרי להכין פתרון חסימה באמצעות x 1 PBS (10 מ"ל), 10% tween (50 µL) אבקת חלב (0.2 גרם). כמות אבקת וריכוז של חלב עשוי להשתנות בהתאם נוגדנים בשימוש, אולי צריך להיקבע מדעית. השאיפה של נוזל מתוך השקופית היא צעד נוסף לאבד בקלות תולעים. לבדוק את התקדמות על-ידי בדיקת השקופית מתחת למיקרוסקופ ויבתר, אבל תשמור על עצמך כי השקופית לא יתייבש.
      5. להטות את השקופית, תשאף משם את הפתרון חסימה, באמצעות אותם כפי שתואר לעיל. המקום שקופית במול לדרך מתלה ולהוסיף לאט 50 µL מדולל העיקרי נוגדן, באמצעות אותם. סגור " קאמרית רטוב " דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או לתקופות קצרות יותר-RT.
        הערה: זמן הדגירה ייתכן שתצטרך להיות מדעית שנקבע של נוגדנים ספציפיים.
      6. לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני כמו פתרונות אחרים. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עם פתרון חסימה למשך 10 דקות, 3 פעמים, הוספה והסרה של הפתרון באותו אופן כפי שתואר לעיל.
      7. הוסף נוגדנים משניים (fluorescently עם התווית) מדולל בפתרון חסימה, דגירה-RT לשעה. ראה טבלה של חומרים לדוגמאות של נוגדנים משניים וריכוזי.
      8. להסיר את נוגדנים משניים ואת שטיפת, כאמור לעיל, עם חסימת פתרון 2 פעמים, כדי לנקות את הפתרון חסימה, עם PBS 1 x, למשך 10 דקות כל אחד.
      9. תשאף משם כמה שיותר PBS ככל האפשר מבלי לאפשר את הדגימה להתייבש, הסר בזהירות את הג'לי סביב הדגימה.
      10. הוסף טיפה אחת הרכבה בינונית על גבי הדגימה, ו הנח coverslip בעדינות על העליונה. לאטום את הקצוות של coverslip עם לק. מקום שקופיות בתוך קופסה שקופית כהה לשמר מכתים ולאחסן 4 ° C.
        הערה: שומרים שקופיות בחושך בגלל רגישות לאור (קרינה פלואורסצנטית עלולה לדעוך עם הזמן) ולמנוע חשיפה אוויר על-ידי שמירתן אטום, מאותה סיבה. ניתן לאחסן שקופיות לתקופות ממושכות של זמן 4 ° C או-20 ° C.

2. הפרעות עם הפונקציה של גנים חיוניים tubulogenesis במעי C. elegans. דוגמה: RNAi.

הערה: C. elegans זנים מתורבתים על חיידקים OP50 נזרע על צלחות NGM לפי פרוטוקולים סטנדרטיים 29. עבור RNAi, C. elegans ניזונים HT115 RNAi חיידקים על צלחות RNAi בתוספת 25 carbenicillin µg/mL ו- 2 מ מ IPTG (איזופרופיל beta-D-1-thiogalactopyranoside) עבור אינדוקציה של האמרגן חיידקי שיוצר כפול תקועים RNA (dsRNA) מהציג הגן C. elegans. אנטיביוטיקה, ריכוז IPTG עשויים להשתנות, בהתאם RNAi שיבוט/ספריית וכוח הרצוי RNAi, ו ספציפיים RNAi שיבוטים ניתן להשיג זמינים מסחרית ברחבי הגנום RNAi האכלה ספריות (ראה ( 26 , 30 , 31) על רקע על האכלה RNAi ב C. elegans ו לטבלה של חומרים עבור חומרים/ריאגנטים וספריות RNAi).

  1. RNAi סטנדרטי על ידי האכלת 26 , 31
    1. תוציא צלחת ספריית RNAi מ-80 מעלות צלזיוס, שים את זה על קרח יבש. הוצא את הקלטת איטום ולהשתמש פיפטה סטרילי עצה להעביר חיידקים חסיד של שיבוט של האינטרס פלטות אגר ליברות (מרק לוריא) 29 בתוספת 100 אמפיצילין µg/mL ו- µg/mL 15 טטרציקלין. פס החוצה חיידקים על גבי צלחת אגר. חותם RNAi ספריית לצלחת עם קלטת איטום חדשה. לגדל את החיידקים בין לילה-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: פלטות אגר אלה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. חיידקים חדשים יכולים להיות בתרבית ישירות מהם להגן על הספרייה המקורי RNAi.
    2. ביום למחרת, לחסן RNAi חיידקים מן צלחת אגר LB לתוך 1 מ"ל בינוני נוזלי LB 29 המכיל 50 אמפיצילין µg/mL, כל אחד, לנער 14 h (8-18) או למשך הלילה ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש חיידקים טריים בכל פעם. ראה התייחסות ( 30) להשוואה מהתנאים תרבות אחרת (למשל התזמון של תרבות).
      3. יום
    3. הבא, µL זרע 200 לכל שיבוט של החיידק RNAi בתרבית על צלחות RNAi נפרדות. תן הצלחות יבש ולהשאיר RT ללילה עבור אינדוקציה של האמרגן חיידקי.
    4. להעביר את הזחלים L4-שלב 4-6 על כל צלחת RNAi. תקופת דגירה הלוחות RNAi הזריעה RT או 22 ° C של 3-5 ימים.
      הערה: תבחרו L4 הזחלים קודם על גבי צלחת NGM ללא חיידקים כדי להסיר מחסידי OP50 להתערב עם RNAi, או באופן סדרתי להעביר אותם ל צלחת NGM חדשה ללא OP50 שלוש פעמים. ודא זנים לא מזוהמים, כמו חיידקים מזהמים - כמו OP50 העדיפו מזון לתולעים - יפריע גם RNAi. להתאים את הטמפרטורה כנדרש: למשל פיתוח מאיצה עם הטמפרטורה גבוהה יותר; זני עשוי להיות רגיש לטמפרטורה.
    5. ללימודים התפתחותית, בדוק פנוטיפים צאצאים F1 מיום 2 ואילך.
      הערה: חשוב לבדוק חיות לעתים קרובות כדי להימנע חסר את המראה או התקדמות של הפנוטיפ (למשל סמן הזחה) כאשר הערכת להן קרום מקוטב במהלך הפיתוח. העשרה של האוכלוסייה F2 בשביל פנוטיפים חזקה (למשל על-ידי בחירת אנדרוגינוסים האב אל צלחת RNAi חדשה ביום 2 כדי לבחור עבור ביותר בחום מושפע באמצע החלק של הצאצאים שלהם) הוא לעיתים רחוקות נחוץ, מאז קשת בין מתון כדי חזק פנוטיפים רצוי.
  2. RNAi מותנה
    הערה: RNAi תנאים שניתן לשנותם כדי להפחית חמורה, או להגביר תופעות לוואי מתונות או להתערב במה-במיוחד; שינויים מועילים על הערכה מלאה של השפעות פנוטיפי לעיתים קרובות גנים tubulogenesis קטלני.
    1. RNAi זחל - הערכה של RNAi אפקטים באותו דור (מתון, שלב ספציפי RNAi)
      הערה: להתגבר על עקרות או עובריים קטלני, או כדי לשבש את תפקוד הגן-מופרה פוסט בשלב מסוים, RNAi מושרה ב הזחלים, פוסט embryonically. מניחים ביצים ללא טיפול (2.2.1.1), מבוגרים gravid (2.2.1.2) או מסונכרן L1 (או, אם רצונך בכך, בשלב מאוחר יותר) הזחלים (2.2.1.3) על צלחות RNAi; להעריך את ההשפעות RNAi בדור זהה, למשל יומיים מאוחר יותר, השהיות הזחלים ו/או מבוגרים.
      1. פיק 30-50 מבוגרים gravid לתוך אחד ירידה הלבנת פתרון (פתרון 1: 4 של 10 M NaOH, משק הבית נתרן תת-כלורי) ממוקם מימין לקצה צלחת RNAi. תן יבש ולאפשר L1s בוקעים ולעבור אל הדשא חיידקי.
        הערה: הלבנת פתרון, בדרך כלל בשימוש לטיהור, יהרוג הכל חוץ עוברי ב מקליפתם ביצה. לכן, אל תמקם את הפתרון הלבנת אל או קרוב החיידק RNAi.
      2. לבחור או זרע ~ 20 gravid צעירים ללא צלחת RNAi ולתת להם להטיל ביצים במשך 2-3 שעות, או עד ישנם בסביבות 300 ביצים בצלחת, ואז תבחר את המבוגרים.
        הערה: שיטה זו עלולה לגרום זיהום של החיידק RNAi על-ידי OP50. כדי להפחית סיכון זה, קודם להעביר מבוגרים לצלחת NGM ללא חיידקים כדי להסיר מחסידי OP50 את התולעים. . שמור על עצמך כי מבוגרים ולא נשארים זמן רב מדי על צלחות RNAi להימנע RNAi השפעה על עוברי.
      3. לבחור או למקם L1 הבמה תולעים ישירות על צלחות RNAi (ראה חומר עזר ( 29)-עבור סינכרון פרוטוקולים).
        הערה: אחד תוכל להשתמש פרוטוקול סינכרון מקוצר (למשל עבור מלכודת בקנה מידה בינוני גדול) ע י שטיפת תולעים של צלחות מיושבים בצפיפות עם M9 עבור מספר פעמים עד ביצים היחידה להישאר. לאחר 2-3h הבקיעה L1s ואז ניתן לאסוף ב- M9 של הצלחות האלה, על-ידי שוטף נוספים כדי להסיר חיידקים (3 x ב- M9), יש לנקות נזרע על גבי לוחות RNAi.
    2. דילול של RNAi חיידקים עם וקטור ריק RNAi חיידקים (מתון RNAi)
      הערה: הפחתה בסכום של dsRNA על ידי דילול כמות החיידקים RNAi עשוי להספיק כדי לגרום מתונה יותר תופעות, ייתכן שתצמצם lethality עובריים בלי המבטלת כל האפקטים עובריים. דילול של חיידקים RNAi משמש גם לניסויים RNAi כפול וכדי titrate תנאים לניסויים גנטיים אינטראקציה (למשל כדי ליצור תופעות לוואי מתונות להערכה של שיפור ואפקטים חזק על ההערכה של דיכוי).
      1. לגדול RNAi, empty וקטור HT115 RNAi חיידקים בינוני 1 מ"ל ליברות עם 50 אמפיצילין µg/mL, כפי שנעשה עבור תנאים סטנדרטיים RNAi.
      2. לדלל את החיידקים RNAi בחיידקים RNAi וקטור ריק כדי להשיג מגוון של ריכוזים שונים, לדוגמה, של 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. מערבבים את החיידקים על ידי pipetting למעלה ולמטה. פיפטה µL 200 מעורב חיידקים על גבי צלחת RNAi.
      3. לבחור 4-6 L4 הזחלים שהלוח RNAi. בדוק את פנוטיפ מיום 2 ואילך.
    3. RNAi זנים רגישים (RNAi חזק)
      1. להשתמש זנים רגישים RNAi זמין, לדוגמה, ערי-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) או ערי-1 (mg366) לין-15 ב (n744) (supersensitive האחרון) ובצע נהלי RNAi שמתואר 31 , 2.1 32 , 33.
        הערה: זנים רגישים RNAi (למשל rrf-3 וערי-1) ייתכן התחתון גדלים שבוחרים מבהמות פראי-סוג, יהיה עקר ב 25 º C. הם יכולים גם להיות רקע נמוך של פנוטיפים עצמו, למשל נמוך penetrant הקטלניות עובריים, חייב להילקח בחשבון בעת הערכת השפעות ספציפיות RNAi.

3. In vivo הדמיה של המעי C. elegans על-ידי קרינה פלואורסצנטית לנתח מיקרוסקופ

  1. לפני להמחיש חיות תחת אור זריחה, בדוק RNAi צלחות תחת אור בוהק על כל מיקרוסקופ ויבתר. להעריך (ואת פוטנציאל להקליט) פנוטיפים לעין תחת אור בהיר שעשויים להשפיע על הניתוח, כגון הקטלניות, עקרות (מספר נמוך יותר של רומא), התפתחותיים (למשל מעצר הזחל) ו פנוטיפים גלויים אחרים שעשויים לעזור לאפיין את הפונקציה של גנים המעורבים מורפוגנזה להן, לומן ממברנה מקוטב.
    הערה: הצלחות הציון היחידות שיש מספיק רומא להערכה (לפחות 50), נסה אחרת תנאים RNAi חלופי. עבור הערכה כמותית לוודא כי הצלחות לא מזוהמים או לגדול OP50 (המפריעות RNAi).
  2. להמחיש חיות תחת אור ניאון, להסיר את המכסה ומניחים את הצלחת RNAi ישירות תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות ויבתר.
    הערה: כדי לזהות פנוטיפים מעיים עדין אחד יהיה עליך מיקרוסקופ ויבתר עם צרופת פלורסצנטיות סטריאו גבוהה יותר כוח המאפשר מגוון מספיק ההגדלה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש טווח עם 1.5 ו- 10 x אובייקטיבית, טווח זום מ 3.5 קמ ש.
    3. קודם כל
  3. למצוא חיות תחת אור בהיר להתמקד. בשלב הבא, לבחון חיות תחת אור ניאון בהגדלה נמוכה (למשל תחת המטרה 1.5 x), תוך שימוש במסנן המתאים. לבחון באופן שיטתי מן השמאלית העליונה הימנית התחתונה כדי לסרוק את כל הצלחת. בשביל פנוטיפים את לוחית.
  4. בחר בעל חיים עניין ושנה אובייקטיבית x 10. להתמקד המעי ולהשתמש זום כדי להעריך tubulogenesis/לומן מורפוגנזה פנוטיפ. ראה סעיף 5 עבור ניקוד של פנוטיפים. קודם כל, קחי תמונות בהגדלה נמוכה. ואז תעבור בהגדלה.
    הערה: מאז בעלי חיים בריא לזוז מהר, יפעלו במהירות, עם יד אחת על עכבר המחשב עבור ייבוא תמונות תוך מיקוד המיקרוסקופ עם היד השנייה. האטה חיות (למשל הנחה ארעית של הלוחות עד 4 ° C ע) לא ייתכן שתידרש בעת עבודה עם tubulogenesis פנוטיפים ב בעיקר נעצר עוברי וזחלים מוקדם. ניתן ללכוד מצלמת CCD רכוב מיקרוסקופ ותמונות התמונה תוכנה ללכידת.

4. הדמיה המעי C. elegans ברזולוציה גבוהה יותר על ידי לייזר סורק מיקרוסקופיה קונפוקלית 34 , 35

  1. וביטול הנייח
    1. שימוש קצה האצבע להפיץ דק כמות קטנה של שומן או וזלין במעגל על משטח זכוכית (~ 6-8 מ מ בקוטר).
      הערה: עובי מעגל גריז הוא קריטי עבור הרכבה. לטוב הדמיה תוצאות, תמונה אחד או במספר הזחלים במועד ועושים שימוש עיגול גריז ודק במיוחד עם נוזלי קטן ככל האפשר כך החיה ישירות תקוע בין שקופיות זכוכית מכסה (אם נעשה בצורה מושלמת, חיה להיות מרותק למיטה בלי הרדמה). הרכבה של ביצים, של בוגרים בעלי החיים דורשים מעגל מעט עבה יותר כדי למנוע הרס מדגם בעת הוספת מכסה.
    2. להוסיף טיפה של µL בדרך כלל 3.5 מ מ 10 פתרון אזיד הנתרן לאמצע המעגל ולבחור תולעים לתוכו תחת המיקרוסקופ ויבתר.
      הערה: להכין 1 מ' נתרן אזיד מניות פתרון על ידי המסת מ"ג 65.01 NaN3 1 מ"ל dH 2 O; להוסיף 200 µL של פתרון 1 מ' זה לתוך מאגר M9 20 מ. לבחור תולעים במהירות לתוך טיפה של פתרון אזיד הנתרן כדי למנוע פתרון להתייבש. לבחור שלבים בנפרד להרכבת אופטימלית, מכוון העוברים על 50 לכל שקופית וזחלים כ-20 כשבוחנים אוכלוסיות גדולות יותר. אחד באפשרותך להשתמש M9 במקום פתרון אזיד הנתרן בבחירת עוברי. אם משתמש אזיד הנתרן, חיות חייב לדימות בתוך 30 דקות כדי למנוע נזק לרקמות של זה חומר כימי רעיל.
      התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל.
    3. הנח בעדינות coverslip 22 מ"מ × 22 מ"מ בשקופית. יש להיזהר לא לרסק את התולעים. הפעלת לחץ מתון, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתולעים קבועים היטב בין שקופיות מכסה לנתח. תווית השקופית.
      הערה: הסכום הנכון של לחץ הוא קריטי כדי למנוע פגיעה הדגימה (מדי לחץ), לא מתקן אותו היטב (לחץ קטן מדי: חיות לצוף במקום נדבקות השקופית). חיות צף בעיקרו למנוע הדמיה המתאימה.
  2. הדמיה
    1. המקום שקופיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. חיפוש של תולעים עם 10 x אובייקטיבית, מיקוד-
      הערה: השתמש אור בהיר להתמקד במידת האפשר להימנע photobleaching.
    2. שינוי 60 x או 100 x אובייקטיבית, דגש על המעי.
      הערה: המעי ניתן לזהות בקלות תחת אור בהיר על ידי שלה לומן העובר באמצע של החיה, מן הלוע עד פי הטבעת סמוך לקצה הזנב. היה זהיר בעת החלת שמן עבור 60 x או 100 x שמן אובייקטיבי. ערבוב סוגים שונים של שמנים עלולים להפריע הדמיה נוספות. המקום קטן טיפה של שמן על גבי השקופית בעת שימוש במיקרוסקופ זקופה או אל המטרה בעת שימוש טווח הפוכה, מקפיד לא לזהם אחרים מטרות או חלקי המיקרוסקופ.
    3. להקים קולר DIC/Nomarski תאורה עבור המטרה כדי לשמש לסריקה 36. לבדוק את חיה תחת אור ניאון עם הערוץ המתאים לבדיקת תיוג של המעי ו/או לבדוק פנוטיפ, לשם בחירת הדגימה המתאימה עבור הדמיה. עבודה במהירות כדי למנוע הלבנת.
    4. מתג לייזר סורק כדי להגביל את התמונה פוטנציאליים אל המעי על-ידי הגדרת סריקה גבולות בצד הגבי של הגחון שלו.
      הערה: תיחום המעי בדרך זו היא קריטית, אם fluorophore גם תוויות מבנים מחוץ המעי. במהלך זו סריקה פיילוט, עבודה עם תנאים סריקה מהירה כדי למנמזהה האובייקט photobleaching.
    5. עוצרים סריקה כדי לבחור פרמטרים סריקה עבור הניסוי. הגדר 6-20 מקטעים עבור סריקה מעיים לאורך ציר z, למשל במרווחי זמן 0.2 µm, בהתאם חקירה, שלב של שיקולים בעלי חיים ו/או טכני. הגדרת מסגרת בממוצע לכל תמונה בהתאם למורכבות תיוג ו נדרש פתרון כדי להפחית את הרעש.
      הערה: הגדרת פרטים משתנים בהתאם מיקרוסקופ ולהתנסות. אחד ייתכן שיהיה עליך להקטין את המקטעים כדי למנוע הלבנת אם מבצע סריקה רציפה של שלוש fluorophores שונים. התאם מספר המסגרות למספר סעיפים (צריך להיות נמוכה יותר מספר קטעים כדי למנוע עיוות תמונה; גם שוקל בעליה ב- photobleaching). 4-6 מסגרות הן בדרך כלל מספקות.
    6. לחזור סריקה עם סריקת תנאים לייזר (איטי) סופי ולהתאים: בהירות (שימוש מינימלי רווח כדי להפחית את הרקע); לייזר כוח (גבוה ככל האפשר נדרש, המתחילים - עליות photobleaching; בדרך כלל הגדרת המינימום היא נאותה); נקב (למנוע פתיחה אם לא נדרש, כדי לשמור על רזולוציית).
      הערה: סריקת תנאים תלויים הדגימה ויש צורך מדעית להיקבע בתחילת הפעלת סריקה. ודא כי הבהירות לא תחרוג רוויה (יהיה להגביל את היכולת לשנות את התמונה לאחר מכן על ידי הדמיה תוכנה). בעת הגדרת סריקה תנאים, גם לשקול כי יש להשתמש בתנאים זהים עבור כל הדמיה בניסויים המשווים חיות ניסוי עם פקדים.
    7. לכידת התמונה סדרות. מיזוג תמונות לתמונה הקרנה בודד.
      הערה: ייתכן שיהיה עליך לשמור תמונות הקרנת ו/או כיסויי בנפרד בהתאם מיקרוסקופ.
    8. בעת לקיחת תמונות רב ערוצית להשתמש סריקה רציפה כדי למנוע דימום-דרך בין ערוצים (קריטי ללימודי הסבת שיתוף).
      הערה: הגדרות תמונה אולי צריך להשתנות בהתחשב photobleaching מוגבר קשור עוד סריקה זמן.
    9. תמיד לרכוש תמונות DIC/Nomarski המקביל (סעיפים) ציוני דרך, הכוללת מדינת מורפולוגיה של חיה סרוקה.

5. כימות של קרום מקוטב להן פגמים במעי C. elegans

הערה: דוגמה: Basolateral תזוזה של ERM הפסגה-1::GFP חוץ רחמי לומן לרוחב היווצרות שנגזרות לתת-767 ו aps-1 RNAi.

  1. הבקיע פנוטיפים תחת המיקרוסקופ ויבתר ( איור 5 A, D, E)
    1. הגדר קטגוריות עבור מניה. דוגמה: (i) פראי-סוג (WT), (ii) basolateral תזוזה של היווצרות לומן חוץ רחמי ERM-1::GFP (קוטביות פגם), וכן (iii) (מפתחת מיד לאחר העקירה basolateral).
      הערה: ניתוח חזותי הגדלה נמוכה משאיל את עצמו ניקוד מספרים של חיות עם או בלי פנוטיפ ספציפי. כאן בחרנו דוגמא לשלוש קטגוריות פנוטיפי שונה הנמצאות באותו הזמן אבל הראשון להחמרה של פנוטיפ קוטביות זה ניתוח. עם זאת, מגוון פנוטיפים שונים כמותיים can be הבקיע, כמו למשל לומן מורפוגנזה פגמים, היעדרות/נוכחות (או מספרים) של וקואלות cytoplasmic חיובי GFP, לומן קוטר, גודל או מספר ציסטות intralumenal (ראה < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 3 לדוגמאות).
    2. Depending על סדר הגודל של ההבדלים הצפויים, ציון כ 100 תולעים בשידור חי על פלטות אגר שלהם תחת המיקרוסקופ ויבתר סט כפול או triplicate של ניסויים.
      הערה: אחד חייב ציון כל חיה שעולה תצוגה בעת סריקת הלוחות באופן שיטתי, למשל מפינה שמאלית להוריד נכון של הצלחת (ודא תולעים יש מאוכלס לוחות אחיד).
    3. חזור על הפעולה עבור 3 קבוצות עצמאית של ניסויים. ליצור גרף, להעריך את המשמעות של התוצאות.
  2. רישום נקודות פנוטיפים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי ( איור 5 B)
    1. להגדיר קטגוריות עבור ניקוד, למשל מספר של לומן חוץ רחמי לכל חיה
      הערה: הגדלה גבוהה יותר ניתוח ויזואלי משאיל את עצמו ניקוד של סמן לכימות או פנוטיפ לכל חיה ומאפשר בדיקה נוספת של סמנים subcellular לא עשוי להיות ניכרת על ידי לנתח מיקרוסקופ. הדוגמה הנוכחית של ספירת לומן חוץ רחמי לכל חיה בקבוצת משנה של תולעים של הניסוי אותו בעבר שהוערכו לנתח מיקרוסקופ (5.1.1, קטגוריה 3) מזקק את ההערכה של פנוטיפ קוטביות הרעה, זה נבדק כאן. עם זאת, מגוון פנוטיפים או פרמטרים אחרים can be הבקיע, למשל מספר של שלפוחית, נוכחות/היעדרות או מספר רכיבים subcellular להתאים לשפה משותפת, עוצמת קרינה פלואורסצנטית (לכמת האחרון מאת ImageJ; לראות ליווי נייר על תעלת excretory) 2-
    2. תלוי בעוצמה של הבדלים הצפוי, לכמת סמן פנוטיפי (כאן, חוץ רחמי לומן) בבעלי חיים כ-20 סט כפול או triplicate של ניסויים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
    3. אני חוזר ל- 3 קבוצות עצמאית של ניסויים. ליצור גרפים בר, להעריך את המשמעות של התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד מולקולרי נתח והמחש להן קרום מקוטב מורפוגנזה לומן במעי C. elegans , תא בודד, רמת subcellular. עשרים תאים הכוללים שכבה אחת. C. elegans המעי נוצרת על ידי חלוקת התא מכוונת והעברה במהלך אמצע מופרה. זה הזמן, מקוטב קרום תחומים להפוך הוקמה, אך דה נובו להן קרום מקוטב ממשיכה בוגרת אך הרחבת אפיתל ברחבי ארבעה שלבים זחל עד לבגרות, ומאפשר להתמקד בניתוח מקוטב ממברנה להן (איור 1 א').

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב גישות (תיוג ו מיקרוסקופיים) כדי לנצל אפיתל המעי של C. elegans כמודל עבור visual ומולקולרית ניתוח ויוו רגיל אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi והדמיה להן קרום ו לומן מקוטב.

תיוג

פרוטוקול זה מתמקד נוגדן מכתים. בחיי עיר תיוג באמצעות נוגדנים היא גישה חלופית ספציפי מאוד כדי תיוג פלורסנט פיוז'ן חלבונים (שמתואר הנייר הנלווה על תעלת excretory ממברנה להן)2. למרות נוגדן מכתים אינו מאפשר הד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מריו דה בונו (MRC מעבדה לביולוגיה מולקולרית, קיימברידג ', בריטניה), קנת ג'יי Kemphues (אוניברסיטת קורנל, איתקה, ארה ב), מישל Labouesse (Institut de Seine בפריז Biologie, אוניברסיטת פייר et מארי קירי, פריז, צרפת), מישו Grégoire (אוניברסיטת deRennes 1, רנה, צרפת), CGC, במימון משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440), זנים, נוגדנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH GM078653, 224570 הוא MGH, SAA 223809 כדי כלל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<צביעת נוגדנים חזקה>
פולי-L-ליזיןסיגמאP5899
מתנולפישר סיינטיפיקA452-4
אצטוןפישר סיינטיפיקA949SK-4
טוויןפישר סיינטיפיק50-213-612
פרמאונטפישר סיינטיפיקSP15-100
אבקת חלבסיגמאMT409-1BTL
<חזק>נוגדנים ראשוניים
MH27 (עכבר)ריכוז: 1:20 משאבים: מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה.
MH33 (עכבר)ריכוז: 1:10 משאבים: מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה.
anti-ICB4 (ארנב)ריכוז: 1:5 משאבים: מתנה ממריו de בונו (מועצת המחקר הרפואי, אנגליה)
anti-PAR-3 (ארנב)ריכוז: 1:50 משאבים: מתנה מקנת ג'יי קמפוז (אוניברסיטת קורנל)
<נוגדנים משניים חזקים>
Alexa Floor 568 (נגד ארנב)ABCamAB175471ריכוז: 1:200
Cy5 (נגד עכברים)טכנולוגיות חייםA10524ריכוז: 1:200
TRITC (נגד ארנב)InvitrogenT2769ריכוז: 1:200
FITC (נגד עכברים)SigmaF9006ריכוז: 1:100
כימיקלים
טקסס אדום-פלואידיןריכוז: 1:100 משאבים: בדיקות מולקולריות-T7471
חומרים
שומן ואקום סיליקוןבקמן335148
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק4448
כיסויי מיקרוסקופ (22x22-1)פישר סיינטיפיק12-542-B
C. elegans קשורראה הפניה29 לתקן C. elegans נהלי תרבית ותחזוקה.
LB בינוני ולוחותראה הפניה29 לפרוטוקולים.
TryptoneAcros Organics611845000
תמצית שמריםBD Biosciences212750
NaClSigmaS7653
Bacto AgarBD Biosciences214040
AmpicillinSigmaA0116
טטרציקליןפישר מדעיBP912
<חזק>M9 בינוניראה הפניה29 לפרוטוקולים.
NaClSigmaS7653
KH2PO4SigmaP0662
Na2HPO4SigmaS7907
MgSO4SigmaM2773
NGM platesראה הפניה29 לפרוטוקולים.
NaClSigmaS7653
PeptoneBD Biosciences211677
TryptoneAcros Organics611845000
Bacto AgarBD Biosciences214040
MgSO4SigmaM2773
CaCl2SigmaC3881
כולסטרולסיגמאC8667
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
RNAi platesראה הפניה30 לפרוטוקולים.
NaClSigmaS7653
PeptoneBD Biosciences211677
TryptoneAcros Organics611845000
Bacto AgarBD Biosciences214040
MgSO4SigmaM2773
CaCl2SigmaC3881
כולסטרולסיגמאC8667
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
IPTGUS BiologicalI8500
CarbenicillinFisher ScientificBP2648
NaOHFisher ScientificSS266-1
נתרן היפוכלוריטפישר Scientific50371500
<חזק>חיידקים
OP50 חיידקיםCGC
HT115 חיידקיCGC
ספריות RNAi ברחבי הגנום ספריית הזנת RNAi בכל הגנום של Ahringer (ref 30,49,50)מקור: BioScience
C. elegans ספריית האכלה של ORF-RNAi (ref51)מקור BioScience
Imaging related
Sodium azideFisher ScientificBP9221-500
Equipment
מיקרוסקופ ניתוח מיקרוסקופניתוח NikonSMZ-U
מצויד בחיבור פלואורסצנטי סטריאו בעל עוצמה גבוהה (Kramer Scientific), מצלמת CCD עם תוכנת לכידת Q ומנורת פלורסנט X-Cite (פתרונות פוטוניים)OlympusSZX12
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזרLeica MicrosystemTCS SL
סריקת לייזר קונפוקלי המותקן על ECLIPSE Ti-E הפוך מיקרוסקופניקוןC2
מסומנים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
  2. Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE. , (2017).
  3. Rodriguez-Boulan, E., Macara, I. G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (4), 225-242 (2014).
  4. Mellman, I., Nelson, W. J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 833-845 (2008).
  5. Nelson, W. J. Adaptation of core mechanisms to generate cell polarity. Nature. 422, 766-774 (2003).
  6. Goldstein, B., Macara, I. G. The PAR Proteins: Fundamental Players in Animal Cell Polarization. Dev. Cell. 13 (5), 609-622 (2007).
  7. Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Organization of vesicular trafficking in epithelia. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (3), 233-247 (2005).
  8. Zegers, M. M., O'Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends Cell Biol. 13 (4), 169-176 (2003).
  9. Tepass, U. The apical polarity protein network in Drosophila epithelial cells: regulation of polarity, junctions, morphogenesis, cell growth, and survival. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 655-685 (2012).
  10. Shivas, J. M., Morrison, H. A., Bilder, D., Skop, A. R. Polarity and endocytosis: reciprocal regulation. Trends Cell Biol. 20 (8), 445-452 (2010).
  11. Bryant, D. M. A molecular network for de novo generation of the apical surface and lumen. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1035-1045 (2010).
  12. Zhang, H. Apicobasal domain identities of expanding tubular membranes depend on glycosphingolipid biosynthesis. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1189-1201 (2011).
  13. Zhang, H. Clathrin and AP-1 regulate apical polarity and lumen formation during C. elegans tubulogenesis. Development. 139 (11), 2071-2083 (2012).
  14. Asan, A., Raiders, S. A., Priess, J. R. Morphogenesis of the C. elegans Intestine Involves Axon Guidance Genes. PLoS Genet. 12 (4), e1005950(2016).
  15. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Dev. Biol. 216 (1), 114-134 (1999).
  16. Altun, Z. F., Hall, D. H. Alimentary system, intestine. WormAtlas. , (2009).
  17. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  18. Rasmussen, J. P., English, K., Tenlen, J. R., Priess, J. R. Notch signaling and morphogenesis of single-cell tubes in the C. elegans digestive tract. Dev. Cell. 14 (4), 559-569 (2008).
  19. Maduro, M. F. Gut development in C. elegans. Seminars in cell & developmental biology. , (2017).
  20. McGhee, J. D. The Caenorhabditis elegans intestine. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (3), 347-367 (2013).
  21. Pásti, G., Labouesse, M. Epithelial junctions, cytoskeleton, and polarity. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  22. Sato, K., et al. C. elegans as a model for membrane traffic. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2014).
  23. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  24. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  25. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  26. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  27. Shakes, D. C., Miller, D. M. 3rd, Nonet, M. L. Immunofluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 107, 35-66 (2012).
  28. JS, D. uerr Immunohistochemistry. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  29. T, S. tiernagle Maintenance of C. elegans. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  30. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  31. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  32. Simmer, F. Loss of the Putative RNA-Directed RNA Polymerase RRF-3 Makes C. elegans Hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12 (15), 1317-1319 (2002).
  33. Kennedy, S., Wang, D., Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Nature. 427 (6975), 645-649 (2004).
  34. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2006).
  35. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  36. Netherlands, S. Nomarski Differential Interference Contrast Microscopy. , Springer. Netherlands. (2008).
  37. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb. Protoc. 6, 498-520 (2013).
  38. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3, 356-369 (2002).
  39. Lee, Y. U., Son, M., Kim, J., Shim, Y. H., Kawasaki, I. CDC-25.2, a C. elegans ortholog of cdc25, is essential for the progression of intestinal divisions. Cell Cycle. 15 (5), 654-666 (2016).
  40. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods Cell Biol. 107, 93-149 (2012).
  41. Shi, A., Grant, B. D. In vivo analysis of recycling endosomes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 130, 181-198 (2015).
  42. Caenorhabditis Genetics Center (CGC). , http://cbs.umn.edu/cgc/home (2017).
  43. Wormbase. , http://www.wormbase.org/ (2017).
  44. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , The C. elegans Research Community. WormBook: http://www.wormbook.org. (2007).
  45. Transgeneome website. , https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017).
  46. C. elegans expression pattern. , http://gfpworm.org/ (2017).
  47. National BioResource Project (NBRP)::C. elegans. , https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017).
  48. Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB). , http://dshb.biology.uiowa.edu (2017).
  49. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  50. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  51. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ERM 1 GFP

מאמרים קשורים