טכניקות דעתנית עצב לספק כלי רב עוצמה כדי לבחון פתופסיולוגיה ושינויים biophysical שקודמים אירועים ניוונית בלתי הפיך. כתב יד זה מדגים את השימוש של טכניקות אלה על עצם הגומד של חולדות מורדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של עצב הגומד עכברוש עם הבדיקות דעתנית עצב
במאמר זה
סיכום
תקציר
אלקטרופיזיולוגיה מאפשר את הערכה אובייקטיבית של פונקציה במערכת העצבים ההיקפית vivo בתוך. גיאן מסורתי אמצעים כגון משרעת וההשהיה מזהים אובדן האקסון כרונית, demyelination, בהתאמה. דעתנית עצב טכניקות "מאת threshold מעקב" ותעגבה צעדים אלה על-ידי מתן מידע לגבי הפעילות של תעלות יונים, משאבות, מחליפי להתייחס לפונקציה חריפה, עשוי להקדים אירועים ניוונית. ככזה, השימוש של עצב דעתנית במודלים חייתיים של הפרעות נוירולוגיות עשוי לספק אמצעי שימושי ויוו כדי להעריך את הרומן התערבויות טיפוליות. כאן נתאר התקנה ניסיונית אמצעים מרובים של טכניקות דעתנית עצב מוטורי עכברוש של עצם הגומד.
בעלי החיים הם מרדימים עם איזופלוריין, פיקוח בקפידה כדי להבטיח עומק קבוע והולם של הרדמה. טמפרטורת הגוף, קצב הנשימה, קצב הלב, הרוויה של החמצן בדם מנוטרים באופן רציף. דעתנית עצב מחקרים מבוצעים באמצעות מלעורית גירוי של עצב הגומד, הקלטה של השרירים hypothenar של הכפה forelimb. עם מיקום האלקטרודות הנכון, נרשם פוטנציאלי פעולה ברור מתחם שריר זה מגביר משרעת עם הגדלת עוצמת הגירוי. תוכנית אוטומטית ואז הוא מנוצל כדי לספק סדרה של פולסים חשמליים המניבות 5 צעדים ספציפיים דעתנית ברצף הבא: גירוי תגובה התנהגות, כוח משך זמן קבוע, סף electrotonus, זרם-סף הקשר, מחזור השחזור.
הנתונים המובאים כאן מציינים כי צעדים אלה הם הדיר ולא להראות דמיון בין העצבים הגומד ישר ושמאלה כאשר העריך באותו יום. מגבלה של טכניקות אלה בהגדרה זו היא ההשפעה של מינון וזמן תחת הרדמה. זהירות על הקלטות של משתנים אלה צריך להתבצע עבור שיקול בזמנו של ניתוח.
מבוא
השימוש בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות הוא כלי חיוני עבור ויוו חקירת פונקציה במערכת העצבים ההיקפית בהפרעות נוירולוגיות. עצב קונבנציונאלי הולכה שיטות לנצל גירויים supramaximal להקליט משרעת פוטנציאל פעולה מוטורית וזמן ההשהיה. טכניקות אלה ולכן לספק מידע שימושי על מספר ניצוח סיבים ועל את מהירות הולכה של הסיבים המהירים ביותר. כלי משלים חשוב הוא זה של בדיקת עצב דעתנית. טכניקה זו משתמשת דפוסים מתוחכמים גירוי אלקטרופיזיולוגיות להערכת בעקיפין את המאפיינים ביופיזיקלי של העצבים ההיקפיים, כגון הפעילות של תעלות יונים, משאבות תלויי-אנרגיה, תהליכי חילוף יונים ו קרומית אפשרית 1.
בדיקות דעתנית עצב בדרך כלל מנוצל בסביבה קלינית לחקור את התהליכים הקשורים pathophysiological ואת ההשפעות של התערבויות טיפוליות על הפרעות נוירולוגיות שונות. חשוב, אמצעים דעתנית עצב רגישים התערבויות טיפוליות המשפיעות על תפקוד העצבים ההיקפית כגון טיפול תוך ורידי אימונוגלובולינים (IVIg)2,3 כימותרפיה וטיפול מעכב (CNI) calcineurin 4. למרות מחקרים אלה סיפקו תובנות חשובות, מחקרים קליניים לעיתים קרובות למנוע חקירה של תכונות בתחילת המחלה, אפשרויות טיפוליות הרומן5. לכן, השימוש בשיטות אלה במודלים חייתיים של הפרעות נוירולוגיות לאחרונה צבר המתיחה6,7,8,9. אכן, שיטות אלה מספקים הזדמנות להבין את השינויים דעתנית עצבים ספציפיים הקשורים בהפרעות אלה, ובכך לקדם את המחקר translational.
ההליך המתואר כאן הוא שיטה פשוטה ואמינה למידות דעתנית עצב הרשומה על העצבים הגומד של העכברוש ללא פגע.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים ניסיוני המתוארים כאן תאמו את החיה אכפת ועדת האתיקה UNSW סידני, בוצעו בהתאם הלאומי לבריאות של המועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה תקנות ניסויים בבעלי חיים.
1. ניסיוני הגדר
הערה: חולדות לונג-אוואנס 12 בן שבועיים, נקבה שימשו בהליך זה.
- עזים ומתנגד החולדה בחדר אינדוקציה באמצעות 4% איזופלוריין ו- 1 ליטר לכל קצב הזרימה2 דקות O. לאשר הרדמה מספקת על ידי בודקים רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים ולהבטיח העדר שלה לפני הסרת החיה מן החדר אינדוקציה. שים לב סוכני הרדמה שונים יש השפעות דיפרנציאלית על עצב דעתנית10.
- באופן מאובטח מקום החוטם של החיה המצורף האף חרוט ולספק מנה תחזוקה של 2.5% איזופלוריין ו- 1 ליטר לכל קצב הזרימה2 דקות O.
- לאשר הרדמה נאותה על-ידי בדיקה נסיגה פדלים ורפלקסים הקרנית על ידי צובט האצבעות של החיה ונוגע בעדינות את העין.
הערה: יישום של הוטרינר משחה על העיניים, כדי למנוע יובש תחת הרדמה, היא מומלצת אבל מיותרת כמו ההליך בדרך כלל לוקח 30 דקות לכל חיה. - לשמור על טמפרטורת הגוף של העכברוש ב 37 ° C עם השימוש של שטיח חימום משוב מבוקר, מכשיר בדיקה חום לרקטום. הגדר את שטיח חימום ואת חיישן טמפרטורה גוף משולבת עד 40 ° C כדי למנוע נזק לעור המתרחשת עם טמפרטורות גבוהות יותר.
הערה: מומלץ צג ולהקליט פיסיולוגיים (קצב לב, חמצן, טמפרטורת הגוף, קצב נשימה) כל 10s עם השימוש של מערכת פיקוח פיזיולוגיים בעלי חיים. הקלטה אופטימלית הליכים צריך לכלול מדידה מקומיים של הטמפרטורה האיבר כמו הטמפרטורה ההיקפית יכול להיות קר יותר מאשר זו של טמפרטורת הליבה11 (איור 1). - יש ללבוש כפפות חיטוי, תמיד להשתמש בכלים אשר נמחקו עם 70% אתנול, כדי לשמור על סביבה ללא הפתוגן לאורך כל ההליך.
2. אלקטרופיזיולוגיות הגדר
- השתמש אימפדנס נמוך העוויתיים פלטינה (EEG) מחט אלקטרודות עבור הליך זה.
- להכין האלקטרודות המחט הקלטה על-ידי הוספת האלקטרודה המחט הקלטה (איור 1; סגול שמצוין) דרך השריר hypothenar, האלקטרודה הפניה דרך ההיבט הגבי של הספרה הרביעית (איור 1; שמצוין כתום) כדי להקליט פוטנציאל פעולה השריר מורכבים (CMAPs).
- במקום האלקטרודה הקרקע דרך העור על ההיבט מעולה של האמה בין גירוי הקלטה אלקטרודות (איור 1; ירוק שמצוין). . שמור על עצמך בעת הוספת האלקטרודות להימנע רקמת השריר.
- להכין האלקטרודות המחט מגרה מלעורית על-ידי הוספת הקתודה (איור 1; כחול שכותרתה ב) כ 4 מ מ דיסטלי כדי cubital המנהרה במרפק. הכנס האנודה (איור 1; רד שכותרתה ב) כ- 1 ס מ הציר הקרוב דרך העור של האזור axillar.
איור 1: תרשים כללי של המיקומים אלקטרודה מחט ב forelimb החולדה. הקתודה (כחול) מוכנס כ 4 מ מ דיסטלי לתעלה cubital במרפק ונוסף האנודה (אדום) הוא כ 1 ס מ הציר הקרוב דרך העור של האזור axillar. האלקטרודה המחט הקרקע (ירוק) מוחדר דרך העור על ההיבט מעולה של האמה בין גירוי הקלטה אלקטרודות. הקלטה (סגול) ואלקטרודות המחט הפניה (כתום) מתווספים לשריר hypothenar ולפנים ההיבט הגבי של הספרהה 4. החללית טמפרטורה (אפור) מושם על ההיבט מעולה של שריר thenar. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
3. עצב דעתנית נהלים
- לבצע עצבים מוטוריים מכרסם את פרוטוקול TRONDNF באמצעות חצי אוטומטיים, תוכנית דעתנית עצב מבוקרת מחשב (ראה טבלה של החומרים) מקושרים ממריץ הנוכחי מתמדת, מגבר. להסיר את עודף 50 הרץ חשמל רעש בעזרת אלימינייטור רעש של 50/60 הרץ.
- להקליט את CMAP מן השריר hypothenar על-ידי להמחיש המורפולוגיה CMAP והחלת 1 בו זמנית ms דופק כיכר-גל על עצם הגומד עם האלקטרודה המחט הקתודה.
- להשיג הקלטות אופטימלית, בזהירות להתאים את זווית ו/או המיקום של הקתודה עד מעגל התגובה האופטימלית biphasic עם משרעת קבועה מושגת (איור 2 א.). ברגע המיקום האופטימלי נקבע, ייצוב הקתודה עם בעל אלקטרודה repositionable.
הערה: התוכנה ששימשה באופן אוטומטי מספק הגירויים הבדיקה המתוארת להלן, מגדיל או מקטין את הזרם הדרוש להשגת הסף.
- להשיג הקלטות אופטימלית, בזהירות להתאים את זווית ו/או המיקום של הקתודה עד מעגל התגובה האופטימלית biphasic עם משרעת קבועה מושגת (איור 2 א.). ברגע המיקום האופטימלי נקבע, ייצוב הקתודה עם בעל אלקטרודה repositionable.
- לרשום עיקול גירוי-תגובה על-ידי מצטבר הגברת את עוצמת הגירוי 1 ms דחף על ידי 1 אמא עד לתגובה המרבית מושגת.
הערה: קו סגול וירוק איור 2B ו- 2C מייצג גידול מצטבר את עוצמת הגירוי ואת המערכת האוטומטית בהתאמה. משרעת היעד על הסף מעקב מוגדר באופן אוטומטי 40% משרעת מקסימלי המתאים לאזור של המדרון התלולים בעקומה גירוי-תגובה. בשינוי 'סף' (כלומר הגירוי הנדרש כדי להפיק 40% CMAP) הנגרמת על ידי שונים גירויים המבחן הוא המשתנה של שהושג תוצרי הלמידה בפרוטוקול. - להקליט מספר פרמטרים דעתנית עצב, כולל סף electrotonus (TE), זרם-סף (אני / V) היחסים ושחזור מחזור (RC) כפי שמתואר הפניה12.
הערה: התוכנית דעתנית עצב מבוקרת מחשב מעריך את הסף (TE) עם subthreshold depolarizing, hyperpolarizing זרמי 100 ms מוגדר ב ± 20% ל- ±40% על הסף שליטה הנוכחי. שינוי סף אחרי זרמים הן depolarizing והן hyperpolarizing נרשם באופן אוטומטי זמן 14-נקודות במהלך 100 ms מקטב הנוכחי ו-12 נקודות לאחר מקטב הנוכחית. Electrotonus סף בעקיפין מעריך את conductances internodal, מהווה סמן של פוטנציאל הממברנה. I / V היחסים שקובעת עם זרמים מיזוג subthreshold 200 ms מדודה בעוצמתם של +50% ל-100% של הסף שליטה בדרגות של 10%. I / V מערכת יחסים שונה טה בכך הזרמים ארוכות. משך, האינטנסיביות של קיטוב בהדרגה היא שונה מן +50% ל-100% ואת השינוי הסף שקובעת בעוצמה כל 1 ms לאחר שחדל מקטב הנוכחית. I / V היחסים מספק תובנה המאפיינים מתקנתנ של האקסון1. RC שקובעת עם דופק לזווג פרדיגמה, שבו מוחל על גירוי מיזוג supramaximal הראשונית ואחריו סדרה של מבחן גירויים במרווחי זמן ספציפיים של 2.5 ms עד 200 גב פרמטר זה בדיקות של סדרת האירועים המתרחשים מוגדרים היטב קטרי אזור של הפעולה באקסון בעקבות גירוי supramaximal. אירועים אלו כוללים, איון של תעלות Na+ ממותגת מתח אשר מקשה יותר על מביאות לתגובה שלאחר מכן הוא לכמת על-ידי refractoriness של יחסי תקופת עקשן 1. זה ואחריו לחייב את internode ואת תקופת דעתנית מוגברת מתווכת על-ידי ערוצי אשלגן מהר, לכמת על-ידי superexcitability. לבסוף, לאט הפעלת ערוצי אשלגן מתווכים תקופה מאוחרת של רגישות מופחתת, לכמת כמו subexcitability.
- להקליט את CMAP מן השריר hypothenar על-ידי להמחיש המורפולוגיה CMAP והחלת 1 בו זמנית ms דופק כיכר-גל על עצם הגומד עם האלקטרודה המחט הקתודה.
איור 2: נתונים גולמיים ילדי דעתנית עצב פאנל A מדגים עקומת בתגובה CMAP abiphasic לאחר גידול מצטבר של גירוי עצם הגומד. לוחות B ו- C מייצגים את עוצמת הגירוי (mA), משרעת של CMAP (mV), בהתאמה. הרכיב הירוק של B ו- C מתארת הירידה מצטבר אוטומטיות עוצמת הגירוי, המשויך סיגמואיד בצורת הירידה CMAP נדרש סף מעקב.
4. להציב Electrophysiology נהלים
- להעביר את החולדה לכלוב נפרד עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. אין להשאיר חיה ללא התערבות, בחברה של בעלי חיים אחרים עד זה שיחזר מלאה מן ההרדמה. ברגע החולדה יש החלימו לחלוטין מן ההרדמה, להעביר אותו בחזרה לכלוב המקורי שלה.
- בעת סיום המחקר, המתת חסד העכברוש ללא כאב בהזרקות בעלי חיים, למשל קטלני בקרום הבטן ברביטורט (למשל lethabarb).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מדדים אלקטרופיזיולוגיות של עכברוש של עצם הגומד התקבלו עם פרוטוקול הנוכחי. איור 3 מדגים נציג הקלטה מ עצם הגומד הימנית של 12 בת שבוע הנשי אוונס ארוך חולדה. פוטנציאל הפעולה השריר מורכבים מתייחס המספר של ניצוח סיבים אשר מופעלים בו זמנית. התגובה שיא supramaximal (mV) (איור 3 א) מדגים את התגובה הפסגה מושגת כאשר מצטבר להגדיל את הגירוי עד הנה לא חל שינוי בתגובה (איור 2B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך המתואר מדגים פשוטה ואמינה, טכניקה מינימלית פולשנית המאפשר הערכה של מאפייני ביופיזיקלי ואת הממברנה פוטנציאל הפעולה באקסון בתקופה קצרה של זמן. לעומת טכניקות אחרות פולשניים יותר, אשר דורשים את החשיפה של העצב, השיטה הנוכחית של דעתנית עצב בדיקות גורם נזק מינימלי לרקמות ובכך מאפשר הערכת ויוו ששומרת את התנאים הפיזיולוגיים החוצפה של עניין ומאפשר מדידות חוזרות ונשנות.
כדי להבטיח תוצאות עקביות שם הם כמה שיקולים מתודולוגי החומר. גורם אחד כזה הוא ריכוז סוג של הרדמה. זה בעבר הוכח שכי איזופלו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
הפרויקט נתמך על ידי קרן לונדבק, קרן נובו נורדיסק, המועצה למחקר רפואי דנית, והכשלים של שרה Elsass קרן, הקרן לחקר נוירולוגיה Jytte וקרן Dahlboms המלכותי. R.A נתמך על-ידי מלגת הפוסט דוקטורט מוקדם הקריירה של בריאות לאומי רפואי מחקר המועצה של אוסטרליה (#1091006)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תוכנית QTracS | דיגיטמר בע"מ | תוכנית ריגוש אקסונלי | |
| AM-Systems 2200, מבודד גירוי אנלוגי, 2200V/50Hz | SDR | ממריץ | 850005 |
| מגבר AC בעל ביצועים גבוהים דגם LP511 | מגבר טכנולוגיות | ||
| Humbug 50/60Hz מסלק רעש | Quest Scientific Instruments | 726310 | מסלק רעש |
| עכבה נמוכה מחט תת-עורית מונופולרית פלטינה אלקטרודות | Grass Technologies | F-E2-24 | אלקטרודות הקלטה, אורך 10 מ"מ, 30 מד |
| עכבה נמוכה אלקטרואנצפלוגרפיה פלטינה אלקטרודות מחט | קפלון | 9013L0702 | אלקטרודות גירוי, אורך 10 מ"מ, 30 מד |
| מכשיר קלט/פלט רב תכליתי דגם USB-6341 | National Instruments | התקן קלט/פלט רב תכליתי | |
| לוחית בסיס ברזל IP | מעבדת מכשירים מדעיים של Narishige | משמשת להחזקת אלקטרודת מחט מגרה במקומה | |
| מעבדת מכשירים מדעיים של Narishige | משמשת להחזקת אלקטרודת מחט מגרה במקומה |
מקורות
- Krishnan, A. V., Lin, C. S. -Y., Park, S. B., Kiernan, M. C. Axonal ion channels from bench to bedside: a translational neuroscience perspective. Prog neurobiol. 89 (3), 288-313 (2009).
- Lin, C. S. -Y., Krishnan, A. V., Park, S. B., Kiernan, M. C. Modulatory effects on axonal function after intravenous immunoglobulin therapy in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch neurol. 68 (7), 862-869 (2011).
- Park, S. B., Goldstein, D., Lin, C. S. -Y., Krishnan, A. V., Friedlander, M. L., Kiernan, M. C. Acute abnormalities of sensory nerve function associated with oxaliplatin-induced neurotoxicity. J. Clin. Oncol. 27 (8), 1243-1249 (2009).
- Arnold, R., Pussell, B. A., Pianta, T. J., Lin, C. S. -Y., Kiernan, M. C., Krishnan, A. V. Association between calcineurin inhibitor treatment and peripheral nerve dysfunction in renal transplant recipients. Am. J. Transplant. 13 (9), 2426-2432 (2013).
- Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of motor axons in the maturing mouse. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (1), 45-53 (2009).
- Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant SOD1(G93A) model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle & Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
- Alvarez, S., Calin, A., Graffmo, K. S., Moldovan, M., Krarup, C. Peripheral motor axons of SOD1(G127X) mutant mice are susceptible to activity-dependent degeneration. Neurosci. 241, 239-249 (2013).
- Fledrich, R., et al. Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A. Nat. Med. 20 (9), 1055-1061 (2014).
- Vianello, S., et al. Low doses of arginine butyrate derivatives improve dystrophic phenotype and restore membrane integrity in DMD models. FASEB J. 28 (6), 2603-2619 (2014).
- Osaki, Y., et al. Effects of anesthetic agents on in vivo axonal HCN current in normal mice. Clin Neurophysiol. 126 (10), 2033-2039 (2015).
- Biessels, G. J., et al. Phenotyping animal models of diabetic neuropathy: a consensus statement of the diabetic neuropathy study group of the EASD (Neurodiab). J. Peripher. Nerv. Syst. 19 (2), 77-87 (2014).
- Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. A model of mouse motor nerve excitability and the effects of polarizing currents. J. Peripher. Nerv. Syst. 16 (4), 322-333 (2011).
- Arnold, R., Moldovan, M., Rosberg, M. R., Krishnan, A. V., Morris, R., Krarup, C. Nerve excitability in the rat forelimb: a technique to improve translational utility. J. Neurosci. Methods. 275, 19-24 (2017).
- Moldovan, M., Alvarez, S., Krarup, C. Motor axon excitability during Wallerian degeneration. Brain. 132 (Pt 2), 511-523 (2009).
- Madison, R. D., Robinson, G. A., Krarup, C., Moldovan, M., Li, Q., Wilson, W. A. In vitro electrophoresis and in vivo electrophysiology of peripheral nerve using DC field stimulation. J. Neurosci. Methods. 225, 90-96 (2014).
- Moldovan, M., Krarup, C. Evaluation of Na+/K+ pump function following repetitive activity in mouse peripheral nerve. J. Neurosci. Methods. 155 (2), 161-171 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
