פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

תקציר

ניוון של נוירונים מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית בתגובה על פגיעה, מתח, מחלה. סימפטומים הסלולר של התנוונות העצבית דומים להפליא אצל בני אדם וחסרי חוליות כמו המנגנונים המולקולריים המניעים תהליכים אלה. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster , מספק אורגניזם מודל גנטי פשוט אך פשוט כדי לחקור את המורכבות הסלולרית של מחלות נוירודגנרטיבי. למעשה, כ 70% מכלל גנים אנושיים הקשורים למחלה יש homolog דרוזופילה וכן שפע של כלי מבחנים תוארו באמצעות זבובים כדי לחקור מחלות ניווניות אנושיות. באופן ספציפי יותר הצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הוכיחה להיות מערכת יעילה ללמוד מחלות neuromuscular בגלל היכולת לנתח את הקשרים המבניים בין הנוירון לשריר. הנה, אנו מדווחים על vivo המנוע assay פגיעה נוירון תסיסנית , אשרReproducibly גורם neurodegeneration ב NMJ על ידי 24 שעות. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו רצף זמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך ניוון נוירונים מוטוריים. שיטת הפציעה יש יישומים מגוונים יש גם נוצלו כדי לזהות גנים ספציפיים הדרושים neurodegeneration ו לנתח תגובות תמליל לפציעה העצבית.

מבוא

ניוון עצבי מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית יכול להיגרם על ידי תהליך ההזדקנות הטבעי, פציעה, מתח, או מצבי מחלה. תסיסנית melanogaster , זבוב הפירות המשותף, מספק אורגניזם מודל פשוט וחזק ללמוד neurodegeneration בשל הדמיון המדהים של המנגנונים המולקולריים המניעים את התנוונות של נוירונים. קווי דמיון אלה מודגשים על ידי העובדה כי כ -70% של גנים אנושיים הקשורים המחלה יש הומולוג תסיסנית . ¹ בנוסף, מבחני רבים וכלים טכנולוגיים ללמוד מחלות נוירודגנרטיביות אנושית פותחו וניצל תסיסנית . ^{2 , 3} בתוך תסיסנית , צומת neuromuscular (NMJ) מאפשר ניתוח של תכונות הסלולר והן אלקטרופיזיולוגיים הוכיח להיות מערכת חשובה ללמוד מחלות neuromuscular בשל n גלויחיבורי שריר יורון. ² במחקר זה, אנו מתארים את assay פגיעה vivo נוירון בזחלים תסיסנית המאפשר הפציעה לשחזור של עצבים סגמנטליים. זו פגיעה motoneuron התוצאות ברצף הזמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך neurodegeneration ב NMJ 24 שעות לאחר הפציעה. היכולת לשכפל מוטורונורונים פגמים וכתוצאה מכך neurodegeneration יש יישומים מגוונים כגון זיהוי גנים ספציפיים הנדרשים לתהליך ניוונית, דיסקציה של תגובות תעתיק פציעה עצבית, וניתוח של מפלים איתות מגן. ^{4 , 5 , 6} שיטה זו שימשה גם בשילוב עם microfluidics ללמוד ניוון העצב התחדשות בבעלי חיים. ⁷

אנו מנצלים assay כמותי הוקמה לבחון degenerat נוירון המנועיון ב NMJ תסיסנית לאחר פגיעה מכנית. Assay זה מבוסס על העובדה כי אובדן של קרום presynaptic וחלבונים קודמת פירוק של reticulum subsynaptic (SSR) המאופיינת על ידי foldynaptic קרום שרירי הקפלים. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} assay זה מאפשר כימות של "טביעות רגליים סינפטי" שבו נוירון מראש סינפטי איבד את הקשר השריר postsynaptic הסמוך. תהליך ניוונית הוכח להיות פרוגרסיבי לאורך התפתחות הזחל ¹² ולא ניתן להסביר על ידי שינוי סינפסה שינוי או נבטים. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} המודעההתצפית של שימוש פגיעה מכנית על מוטציות preexisting היא שזה מאפשר לנתיחה של רצף הזמני של אירועים סלולריים המוביל עד neurodegeneration ב NMJ. ¹³

פרוטוקול

1. הכנה של ריאגנטים וציוד

1. הכן 1x הצפת Dissection (70 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.02 מ"מ CaCl ₂ , 20 מ"מ MgCl ₂ , 10 מ"מ NaHCO ₃ , סוכרוז 115 מ"מ, 5 מ"מ טרילהוז, 5 מ"מ HEPES, pH 7.2).
2. הכן 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
3. הכן 1x PBT באמצעות 1x PBS עם 0.01% Triton X-100.
4. הכן מיץ פירות אגר צלחות. ¹⁴ בקצרה, לערבב אגר 30 גרם 700 מ"ל של H ₂ O ו החיטוי. ממיסים 0.5 גרם של Paraben מתיל 10 מ"ל של אתנול ולהוסיף פתרון 300 מ"ל של מיץ פירות להתרכז (ענבים או תפוח). מערבבים להתרכז פתרון אגר autoclaved ויוצקים לתוך המכסים של 10 מ"מ x 35 מ"מ צלחות פטרי.
   הערה: פריקקס אגר ענבים כוח ניתן גם לרכוש מחברות שונות (ראה Tabls של חומרים ).
5. השג גודל 5 מלקחיים המאפשרים אחד מכני לפגוע בזחלים.
6. השתמש תקן תסיסנית CO ₂ מכשיר הרדמה מבוסס.

2. בחירת זחלים תסיסנית

1. קח בקבוקון או בקבוק תסיסנית המכיל זחלים instar השלישי נודדים כי כבר מתורבת ב 25 ° C.
2. בחר 10 בודדים 2 ^nd או 3 ^rd insta הזחלים מבוסס על המראה. הזחלים instar השלישי יכול להיות מזוהה על ידי המראה של spiracles מסועף הקדמי, בעוד הזחלים instar השני הם קטנים יותר יש יותר כמו מועדון spiracles הקדמי.
   הערה: ניתן לזהות את שלבי הזחל גם על ידי תזמון. ב 25 ° C, הזחלים instar השני מופיעים כ 48 שעות לאחר הבקיעה, ואת השלישי זחלי instar זחילה כ 24 שעות מאוחר יותר. אם מעוניינים לבחון neurodegeneration ב NMJ, הזחלים instar השני צריך להיפגע.

הכנת זחלים תסיסנית עבור פגיעה מכנית

1. בזהירות לבחור זחלים בודדים על ידי מלקחיים או מכחול, להיות זהיריםלא לדחוס אותו בכל מקרה.
2. מקום ישר עשר זחלים לתוך צלחת זכוכית המכיל קר 1X PBS או חיץ לנתיחה להסיר כל פסולת מזון כדי להאט את תנועת הזחל.

4. מכני פגיעה וטיפול של זחלים תסיסנית

1. מניחים כל זחל בודדים על מנגנון הרדמה CO ₂ .
2. תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות לגלגל כל זחל על הצד הגבי שלהם כדי לדמיין את עצבי הסגמנטלי דרך לציפורן.
3. מיקום בגודל 5 מלקחיים כ 1/2 ל 2/3 דרך לאורך הזחל החל בפה ווים. לאחר מיקומו, קמצוץ כ 1/3 של לציפורן הגחון המכיל את העצבים הסגמנטליים עם גודל 5 מלקחיים.
   1. כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפצעו, להחיל כוח מספיק כדי למחוץ את עצבי הסגמנטלי אבל לעזוב את לציפורן ללא פגע. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של כוח, לרסק 10 זחלים ולהבטיחשיעור התמותה לאחר 5 שעות מתחת ל -50%.
4. לאחר פגיעה, בזהירות להעביר זחלים לצלחת אגר מיץ פירות המכיל כ 0.5 גרם של שמרים להדביק. מניחים כל זחל כך הקצה הקדמי שלה על הדבק שמרים, להמשך האכלה למרות תנועתיות משובשת.
   הערה: כדי להבטיח עצבים סגמנטליים הזחל נפגעו, תנועתיות הזחל שיבשו ניתן לראות לאחר העברת צלחת אגר. הזחל נפגע משותק למעשה האחורי לאתר הפציעה, אבל עדיין יכול להזיז את הפה ווים שלהם להאכיל. שיעור תמותה גבוה של בעלי חיים לאחר פגיעה הוא נפוץ ולכן עדיף לפגוע 20-50% יותר בעלי חיים ממה שנחוץ לניסוי.
5. מקום צלחות אגר המכיל להדביק שמרים 10 זחלים פצע לתוך תחתית של צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ ריקה. מכסים את צלחת פטרי, המכיל עכשיו את הזחלים הפגועים על צלחת אגר עם מגבת נייר לחה, להבטיח כי מגבת נייר לא לגעת הזחלים או צלחות אגר. מקום זהצלחת פטרי לתוך מיכל חזק יותר אוויר, ב RT.
6. אחזר זחלים לנתיחה לאחר תקופות שנקבעו (6, 12, או 24 שעות) שלאחר הפציעה.
   הערה: כדי לבחון את ההשפעות המיידיות של פגיעה על השלד של axonal, הזחלים ניתן לגזור ישירות לאחר הפציעה. כדי לבחון פגמים הובלה אקסונל, הזחלים ניתן לגזור כ 6 שעות לאחר הפציעה. בערך 12 שעות לאחר הפציעה הצטברות של חלבונים אוביקטיניטד ניתן לראות, ו 24 שעות לאחר הפציעה, ניוון של נוירונים המנוע ב NMJ ניתן לצפות.

5. ניתוח של Neurodegeneration ב NMJ

1. לנתח תסיסנית הזחל NMJ כפי שתואר לעיל. ^{15 , 16} בקצרה, הזחלים פין על צלחת Sylgard, לחתוך לאורך פני הגבי, ואת פילה עם סיכות בטיפה של חיץ לנתיחה לחשוף את שרירי הגוף בגוף. תקן הזחלים או paraformaldehyde 4% (PFA) או פתרון של בויין בהתאם אנטיגופים המשמשים לדמיין נוירונים ושרירים.
   הערה: קיבוע PFA יש להשתמש אם תגי חלבון ניאון, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוא להיות דמיינו כמו מקבע של בווין יכול להיות קשה מדי.
2. ביצוע immunofluorescence, אשר תוארה בעבר ^{11 , 13 , 16} , כדי לסמן בו זמנית נוירונים המנוע presynaptic ו סמינרי (SSR) סף שרירים. דמיינו קרום presynaptic ו אקסונים עם peroxidase חזרת פלואורסצנטי מצומדות (HRP) (1: 300) ¹⁷ אזורי פעיל יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים נגד ברוכפילוט (Brp) (nc82, 1: 100, מחקרים התפתחותיים היברידומה בנק). במקביל, תווית שרירים פוסט-סינפטיים עם נוגדנים נוגדי-דיכאון גדולים (D: 1) (1: 10,000). ¹⁸
3. בצע assay הוקמה לכימות neurodegeneration ב NMJ כפי שתואר לעיל. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} בקצרה, במקביל לדמיין NMJs בודדים הן לפני ואחרי תאים סינפטיים. כל boutons שכותרתו עם סמנים postsynaptic אבל לא סמנים presynaptic מצביעים על אתרים של neurodegeneration ( איור 1 ). המספר הממוצע של boutons לכל NMJ כמו גם את המספר הממוצע של NMJs לכל חיה ניתן לכמת.

תוצאות

באמצעות הנוהל המוצג כאן, יש לנו הוכיח כי פגיעה מכנית העצבית מאפשרת לנתיחה הזמני של אירועים נוירודגנרטיביים. ^{14 , 18} רצף האירועים כבר מאופיין בעבר ומתחיל עם הפרעה מיידית של השלד, ואחריו פגמים הסחר אקסונל, הצטברות של חלבונים הנמצאים ubiquitinated, ו neurodegeneration הבאים 24 שעות לאחר הפציעה. לפני הפציעה, WT NMJs להראות את האזור presynaptic פעיל סמן ברפ ב אפוזיציה סמן postsynaptic Dlg בכל NM...

דיון

פגיעה מכנית העצבית שתוארה קודם לכן הפגינו כאן יכול לשמש כדי לגרום לפציעה / מתח העצבים הסגמנטליים של הזחלים תסיסנית . ^{4 , 5 , 6 , 14} טכניקה זו ניסיוני כבר מועסקים בעבר לנתח את הרצף הזמני של אירועים המוביל neurodegeneration, כמו גם לבחון שינויים תעתיק בגופם התא הנייד נוירון שלאחר הפציעה. ^{5 , 14<...}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מספריים מיקרו-מנתחים	כלי מדע עדינים	15000-08
Dumont #3 מלקחיים	כלי מדע עדינים	11231-30	יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5
Dumont #5 מלקחיים	Fine Science Tools	11251-30	יש אנשים שמעדיפים מידה 3, בעוד שאחרים מעדיפים מידה 5
CO2 Air	Tank Tech Air	UN 1013	ניתן לרכוש גדלי מיכל שונים
CO2 מכשיר הרדמה	Genesee Scientific	59-114
סיכות נירוסטה, גודל 0.1	Fine Science	Tools 26002-10
SylGard 184 סיליקון אלסטומר, בסיס וחומר ריפוי	Dow Corning	3097358-1004	למזיגת צלחות חיתוך
Bouin's Solution	Sigma	HT 10132-1L	יש לבדוק נוגדנים ליעילותם ב-Bouin ו-PFA
4% Paraformaldehyde (PFA) בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)	Affymetrix	FLY-8030-20	יש לבדוק את יעילותם ב-Bouin ו-PFA
ניתוח סטריאו MIcroscope		AmScope SM-1BZ
מקור אור	AmScope	HL150-AY-220V
נוגדן נגד nc82	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	nc82-s
אנטי דיסקים נוגדנים גדולים	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	AF3
אלקסה פלואור אנטי חזרת פרוקסידאז	ג'קסון אימונוסקר	123-545-021; 123-585-021; 123-605-021	One can you Alexa Fluor® 488, 594 או 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix	Genesee Scientific	47-102
שקופיות מיקרוסקופ	Genesee Scientific	29-101
כיסויי זכוכית	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box	Fisher Scientific	03-484C	משמש ליצירת תא לח לשחזור זחלים