סמים מבוססי Cytometry זרימה מערכת הסינון לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים התמיינות של תאי גזע גליובלסטומה

סיכום

פרוטוקול הקרנה יעילים מוצג לצורך זיהוי מולקולות קטנות המקדמים astroglial התמיינות בתאי גזע glioblastoma (GSCs). וזמינותו מבוסס על עיתונאי התמיינות תאי גזע לפיה הביטוי GFP משופרת (eGFP) הוא מונע על ידי האמרגן GFAP האנושית.

תקציר

גליובלסטומה (GBM) הוא הגידול במוח העיקרי הנפוץ ביותר וקטלני ביותר אצל מבוגרים, גורם בערך 14,000 מקרי מוות בכל שנה בארצות הברית לבדה. חציון ההישרדות לאחר אבחון הוא פחות מ-15 חודשים עם כימותרפיה כריתה, קרינה, temozolomide כירורגית מקסימלי. האתגרים הכרוכים בפיתוח טיפולים יעילים יותר GBM הפכו ליותר ויותר ברורה, כולל invasiveness הלא מתפשר שלו, עמידותו טיפולים סטנדרטיים, שלה המורכבות הגנטית הסתגלות מולקולרית ואת subpopulations של GBM תאים עם דמיון פנוטיפי לתאי גזע נורמלי, במסמך זה מתייחסים כאל תאי גזע glioblastoma (GSCs). בגלל GSCs נדרש עבור התקדמות וצמיחה של גידול, טיפול המבוסס על בידול מייצג של קיימא לטיפול אפנות עבור אלה neoplasms חשוכת מרפא.

הפרוטוקול הבא מתאר אוסף של הליכים להקים על תפוקה גבוהה הקרנת פלטפורמה מכוון הזיהוי של מולקולות קטנות המקדמים GSC astroglial בידול. הליבה של המערכת הוא חלבון חומצי fibrillary (GFAP) גליה הבידול כתב-בונה. הפרוטוקול מכיל כללי ההליכים הבאים: (1) הקמת קווי הכתב של בידול GSC; (2) בדיקה/אימות הרלוונטיות של הכתב קיבולת העצמי-חידוש/clonogenic GSC; (3) קיבולת גבוהה cytometry זרימה מבוסס והתרופות הקרנה.

פלטפורמת ההקרנה מספקת גישה פשוטה וזולה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמים GSCs בידול. יתר על כן, ניצול של ספריות של תרופות שאושרו על-ידי ה-FDA מחזיק את פוטנציאל הזיהוי של סוכנים ניתן יהיה לשנות את ייעודו במהירות רבה יותר. כמו כן, טיפולים המקדמים התמיינות תאי סרטן צפויים לפעול בסינרגיה עם טיפולים שוטפים "סטנדרט של טיפול", אשר הוכחו היעד ולחסל התאים הסרטניים הבדיל יותר בעיקר.

מבוא

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גידולים מכילים אוכלוסיה קטנה של תאים, כינה את תאי הגזע הסרטניים (CSCs) או ייזום-גידול תאים, אשר אחראים על התקדמות הגידול, גרורות, עמידות בפני כימותרפיה-רדיו-טיפולים אלטרנטיביים ^{1, 2}. הנוכחות של תאי הגזע הסרטניים, שלהם progenies הבדיל יותר בתוך גידולים נחשב גורם חשוב בקידום intratumoral הטרוגניות, ובכך מייצג משוכה גדולה בטיפול סרטן³. גידול תאים היררכיה, שמספקת התיאוריה תאי סרטן, נתן השראה לפיתוח אסטרטגיות חדשות לטיפול סרטן ⁴. גישה אחת הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לזהות ומעכבות איתות המסלולים הידועים להידרש במהלך התפתחות של האיבר המושפע. אכן, אנחנו ואחרים בעבר פרסמו מסמכים מרובים המתארת את הדרישה מתמשך תאי גזע-רלוונטי איתות מסלולים עצביים סוניק הקיפוד, דרגה ב גליובלסטומה^5,6,7. עבודה זו סייעה תוך שהשרף מתהווה הרציונל מספר ניסויים קליניים GBM. הגישה השניה הכוונת תאי הגזע הסרטניים היא לקדם את הבידול שלהם. גישה זו קיבלה הרבה תמיכה בשל תוצאות חיוביות קליניים וקליניים בטיפול לוקמיה פרומיאלוציטית חריפה עם חומצות retinoic (ATRA, אנלוגי של ויטמין A). כאן ATRA נמצאה כדי להסיר את החסימה ההבשלה ולקדם סרטן התא בידול⁸. לאחרונה, Piccirillo ועמיתיו באלגנטיות הראו כי BMP-4 מקדמת GSC בידול לתוך האסטרוציטים משמעותית אנטי-GBM אפקטים במבחנה , ויוו⁹.

הרציונל שבבסיס המחקר הנוכחי מבוסס על גישה "הנדסה הפוכה" עבור מיקוד GSCs. בהתחשב את הטרוגניות עצום נוכח ב- GBM, עם בידול המסכן של גולת הכותרת של סרטן, שאלנו אם אנחנו יכולים לקדם את הפנוטיפ למענך - בידול לתוך מצב דמוי אסטרוציט. כאן, אין לנו ידיעה מוקדמת מסלולים איתות לשמור על GSCs הדגימה גידול נתון אך מעדיף מכוונים להשיג הפנוטיפ הרצוי (למשל GFAP חיוביות).

הדו ח מתאר את ההליכים המשמשים ליצירת GSC בידול כתב-קווים מן התמרה חושית של תרבויות מועשר-GSC GSC שבטים. הקווים neurosphere גליובלסטומה המשמשים הוקמו במעבדה של פרופסור אנג'לו Vescovi של חולים עם אבחנה של גליובלסטומה ראשי בבית החולים סן רפאלה - מילאנו, איטליה. קווים אלה נחקרו בהרחבה מספר פרסומים ^{6,10,11,12,13,14}. מומלץ מאוד כי אנשים המעוניינים ביישום טכניקות אלה במעבדה שלהם לקבוע את הרלוונטיות של הכתב קיבולת התחדשות עצמית תאי סרטן בתאים הם מתכננים ללמוד (זה נכון גם לגבי שום כתב). פרוטוקול מפורט לאחד במבחנה clonogenic מבחני מקובלים בתחום מסופק כדי להשיג את זה^15,16. לבסוף, פרוטוקול מפורט המתאר את הניצול של בידול הכתב-בשורות מסך סמים מבוסס cytometry זרימה מסופק בסוף. ראוי לציין, באופן דומה למערכת בידול astroglial המתוארים כאן, יש לנו בהצלחה הוקמה ואנו לאמת GSC כתב שורות שילוב של הכתב (בידול עצביים) MAP2:GFP. לכן, למתודולוגיות לתאר זה נייר ניתן להחיל ללמוד התמיינות לתוך שושלות תאים שונים.

כמה מן הדמויות בדו"ח זה ניתן למצוא בפרסום האחרונים:"Atracurium Besylate סוכנים אחרים חסימת עצב-שריר לקדם astroglial בידול, לרוקן glioblastoma תאי גזע¹⁸.

פרוטוקול

הערה: Astroglial ומערכות העיתונאי lentivirus עצביים נרכשו כמו ההכנות lentiviral ארוזים מראש, מרוכז. נדרש ידע בסיסי של טכניקת cytometry זרימה. כמו כן, לשימוש מלא של פרוטוקול זה המשתמש יהיה עליך גישה cytometer זרימה עם תפוקה גבוהה קיבולת (מקבל 96-ובכן צלחות כמקור לדוגמה).

1. lentiviral כתב תעתיק המערכת

הערה: בניתוח כל זרימה cytometric, השתמש תאים הורים, הלא-transduced, או transduced-וקטור תאים (שאינם פלורסנט) להקמת פלורסצנטיות בסיסית. כמו כן, שים לב לכך כל השלבים שבו נקרא trituration מכני, להיות עדין. Trituration קשים יכול להרוג מספר משמעותי של GSCs שברירי ולהשפיע לתוצאות cytometry זרימה.

1. צלחת עונה 1 פרק 10⁶ תאים ב- 2 מ של תאי גזע עצביים מלאה מדיום הגידול לתוך צלחת 6-multiwell.
2. מגלי תאים על-ידי הוספת כתב lentivirus-ריבוי של זיהום (moi) שווה ל- 5.
3. להוסיף 2 µL של polybrene עבור ריכוז סופי של 8 µg/mL.
4. דגירה התאים-CO של 37 ° C ו- 5%-₂ בלילה.
5. למחרת, החלף את מדיום הגידול להסיר וירוס לא מאוגד. מקם את הצלחת בחזרה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO₂ ולאחר תקופת דגירה של 24 שעות.
6. קציר 0.5 mL מהנפח הכולל; ספין למטה תאים ב- g x 360 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר צינור חרוטי 15-mL, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. להוסיף 0.5 מ של מדיום הגידול תאי גזע עצביים טרי בתאי שנותרה וחוזרים את הצלחת החממה עבור המשך הרחבתה.
7. להוסיף 200 µL של דיסוציאציה ריאגנט ולאחר תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
8. מביצועם תאים על-ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
   הערה: trituration קשים עלולה לגרום משמעותי הריגת GSCs, דיסוציאציה מלאה מושגת בדרך כלל לאחר 20 - 30 פעמים.
9. כדי למזער את התא מצורף או צבירת, להוסיף 800 µL מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) עבור אמצעי אחסון הסופי של 1 מ"ל.
10. העברת µL 200 של השעיה תא כל טוב של צלחת 96-multiwell.
11. עבור הליך זה, להשתמש cytometer זרימה של benchtop עם יכולת 96-ובכן צלחת מצויד עם לייזר כחול על עירור, עם היכולת של זיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק. לבצע ניתוח תזרים cytometric עם עשרת התאים קיימא עבור כל רכישה.
12. לקבוע את אחוז תאים GFP-חיוביות על ידי cytometry זרימה.

2. subclone ובחירת, הרחבה, אימות

1. צלחת בתאים µL 100 תאי גזע עצביים בינוני-צפיפות של תאים 0.7 לכל טוב של צלחת 96-multiwell.
2. תרבות שיבוטים למשך 11 ימים-CO 37 ° C ו-5%₂. שלב זה הוא מאוד תלוי סוג התא, סביר להניח יחייב התאמה המבוססת על הקו תא בשימוש. ככלל, מיקרומטר 100 קוטר ≥ כדור היא אינדיקציה טובה נוכחות של clonogenic GSCs, neurospheres.
3. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד עם מסנן FITC, מארק הבארות המכילים neurosphere יחיד איפה ~ 1-5% של התאים GFP-חיוביות.
   הערה: קביעת שהאחוז המדויק של תאי ה-GFP-חיובית אינה קריטית גם בנקודה זו. כל אחד subclones מאוחר יותר יוערך על ידי cytometry זרימה. שלב זה מבוצע כדי להפחית את הסכום הכולל מספר שיבוטים כדי להיות מנותח בדגש על neurospheres שמקורן מאת מובחן, GFAP-שלילי, GSC.
4. הרחב שיבוטים שנבחרו כתב עד ישנם מספר מספיק של תאים עבור ניתוח לפי cytometry זרימה. טוב תת confluent של צלחת 6-multiwell המכיל ≤ 1.5x10⁵ תאים למ"ל צריך לספק מספר מספיק של תאים.
   הערה: הליך מפורט עבור בידוד ו הרחבה של GSCs הוא זמין ¹⁷.

3. קביעה של הביטוי GFAP:GFP על ידי Cytometry זרימה

1. הקציר של aliquot של תאים (0.5 מ ל) של כל כתב שיבוט ופקדים שאינם transduced כדי לקבוע את האחוז המדויק של תאים GFP-חיוביות. בהתחשב שיבוטים כתב הכוללות תאים GFP-חיוביות ~ 1-5%.
2. לסובב תאים ב- g x 360 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
3. כל גלולה, להוסיף 200 µL של ריאגנט דיסוציאציה תא, דגירה הצינורות בתוך אמבט מים מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
4. Triturate תאים בעדינות כדי להשיג השעיה תא בודד (בדרך כלל בין 20-30 פעמים).
5. כדי למזער את התא מצורף או צבירת, להוסיף 800 µL HBSS נפח סופי של 1 מ"ל.
6. העברת µL 200 לאדם טוב של צלחת 96-multiwell מהשעיה בכל תא.
7. עבור הליך זה, להשתמש cytometer זרימה של benchtop עם יכולת 96-ובכן צלחת. לבצע ניתוח תזרים cytometric עם עשרת התאים קיימא עבור כל רכישה.

4. ELDA Assay התחדשות עצמית כדי לאמוד את הקיבולת Clonogenic

הערה: עבור פקדים, הן הורים, שאינם transduced, כמו גם הבעת-GFP lentivirus transduced תאים, אמור לשמש כדי לקבוע את הפוטנציאל clonogenic היחסית של הקווים כתב בידול GSC לתרבויות GSC המקורי שממנו הם היו נגזר.

1. מביצועם בידול-כתב subclones לתוך תא בודד המתלים כמתואר לעיל.
2. צלחת בתאים הצלחות 96-multiwell 100 µL של תאי גזע עצביים מלאה מדיה הצמיחה ב צפיפויות תא הנע בין 5 ל 500 תאים לכל טוב.
3. תקופת דגירה תאים של 9 ל- 11 ימים-CO 37 ° C ו-5%₂.
4. ציון חיובי בארות על ידי פריט חזותי ישיר של neurospheres תחת מיקרוסקופ אור. גם להתייחס "חיובית" אם הוא מכיל לפחות neurosphere גדול יחיד.
5. חבר את הנתונים: סה כ בארות ניתח ואת מספר בארות חיובי באמצעות הממשק המקוון ELDA זמין ב http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. סמים ספריית דילול הכנה

1. להסיר לוחות ספריית אחסון ב- 80 ° C, מכסים ברדיד אלומיניום (להגן על תרכובות רגישים לאור). להפשיר במשך כ 30 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר.
2. השתמש pipettor רב-ערוצי של 12 ערוצים כדי לדלל תרכובות ספריה עד 0.2 מ מ בינוני מלא תאי גזע עצביים. לדלל דימתיל סולפוקסיד 10% צמיחה בינוני
   הערה: הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד צריך להיות 0.1% בעת הוספת תאים. ריכוז גבוה יותר של דימתיל סולפוקסיד בתרבות עלול לגרום רעילות. מסיבה זו, מומלץ לבדוק רגישות דימתיל סולפוקסיד בקו תא בשימוש, לפני הטיפול.
3. השתמש דימתיל סולפוקסיד כפקד הרכב לטיפול תאים הנמצאים בעמודות ימינה ושמאלה של כל צלחת (עמודים 1 ו- 12; וולס A עד H).
4. מכסה צלחות ספריית מדולל עם רדיד אלומיניום, להחזיר את הצלחות הספרייה המקורי למקפיא-80 ° C לאחסון לטווח ארוך.

6. סמים מסך

הערה: תאים שטופלו דימתיל סולפוקסיד צריך לשמש כדי להגדיר את פלורסצנטיות בסיסית ולהתאים gating.

1. צלחת 5 x 10³ תאים בצלחת 96-multiwell ב µL 99 של מדיום הגידול מלאה תאי גזע עצביים.
2. שימוש pipettor רב-ערוצי של 12 ערוצים, יטפל בתאים עם תרכובות ספריית מדולל-ריכוז סופי של 2 מיקרומטר (1 µL של 0.2 מ מ סמים לתוך µL 99 תא השעיה) או עם דימתיל סולפוקסיד (בקרה). דגירה הלוחות עבור 72 h-CO 37 ° C ו-5%₂.
3. שימוש pipettor רב-ערוצי של 12-ערוץ להוסיף 150 µL של התא דיסוציאציה ריאגנט מכל קידוח, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
4. מביצועם תאים על-ידי בעדינות triturating עם pipettor רב-ערוצי ערוץ 12 עד לתא בודד ההשעיה מושגת (בדרך כלל בין 20-30 פעמים). כמות הזמן הנדרשת מביצועם neurospheres לחלוטין משתנים בין GSC שורות. בעוד הכימית דיסוציאציה תא המומלץ (ראה חומרים) מוגנת דגירה עד 45 דקות לא היתה השפעה על יכולת הקיום מרובות שורות GSC נבדק, ודא עבור כל קו GSC לשמש ההקרנה.
   הערה: עוצמת הקול הסופי בכל אחד מהם צריך להיות בערך 250 µL (µL 100 של השעיה תא + µL 150 של ריאגנט דיסוציאציה תא)
5. לקבוע את אחוז התאים לבטא הכתב GFAP:GFP על ידי cytometry זרימה. להשתמש באסטרטגיה המגביל סטנדרטי. ראשית, העלילה קדימה ואת הצד מחליקי כדי לקבל תחושה כללית של גודל התא ואת הכדאיות. אז במקום שער על האוכלוסייה קיימא תא בודד. זוהי האוכלוסיה אשר ייקבעו פלורסצנטיות ירוק (eGFP). בכל תרכובת גורמת לעלייה באחוז GFP-חיוביות תאים על ידי מעל שלוש סטיות תקן השליטה (שטופלו דימתיל סולפוקסיד) נחשבת חיובית "להיט". הסף הזה צריך להיות מותאם על פי היישום הספציפי ולא את הרצוי לכתחילה.
   הערה: התפוקה גבוהה מסך מומלץ שימוש של subclone העיתונאית GSC יחיד. בעקבות זיהוי פגע, כל פגע לאמת נגד subclones כתב נוספים מ- GSC באותה השורה. כדי להגביר את הביטחון עבור כניסות נכון הוא גם ממליץ בדיקה תרכובות נגד הכתב subclones מבודד neurospheres GSC שונים קווים.

תוצאות

שלושה קווים neurospheres החולה-derived עצמאית היו transduced עם הכתב astroglial lentivirus קידוד עבור חלבון פלורסנט-ירוק (GFP) התמזגו במסגרת עם קלטת ההתנגדות Zeocin, מונע על-ידי הרכיב יזם GFAP האנושית ( איור 1). הבא שיבוטים בודדים היו מבודדים על ידי ציפוי 0.7 תאים לכל טוב בצלחת טוב 96 (איור 2), זאת בעקבות זרימת cytometric קביעת אחוז התאים לבטא GFP (איור 3). שיבוטים Neurosphere, שמקורם תאים בודדים, המ...

דיון

ואילו רוב המחקרים הקודמים של GSCs התמקדה בעיקר סמני שמגדירים אותם, במחקר זה החלטנו לנקוט בגישה הפוכה. אנו מתמקדים בעיקר progenies הבדיל שנוצר על ידי GSCs (למשל, תאים לבטא astroglial סמנים עצביים). כאן אנחנו מדגימים את הניצול של תרופה מבוססת תא תפוקה גבוהה מערכת, אשר מבוססת על הביטוי תלוי-יזם GFAP האנושי GFP הסינון. כל הניסויים בוצעו ניצול שורות תאים גליובלסטומה החולה נגזר neurosphere. פרוטוקול מפורט המתאר את הבידוד והרחבה של קווים אלה מתואר גאלי ואח¹⁷.

המערכת ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של האנק)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 מ"ל מגיב חד פעמי סטרילי מאגרים	קורנינג	4870
צלחת 6 בארות	Thermo Fisher Scientific	130184
96 צלחת באר	Falcon	353072
Biolite T25 cm² בקבוק מאוורר	תרמו פישר סיינטיפיק	130189
Biolite T75 cm² בקבוק מאוורר	תרמו פישר סיינטיפיק	130190
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל	Celltreat	229411
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	05-408-129
פיפטה רב ערוצית Ovation, 12 ערוצים, 0.5 - 20uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation רב ערוץ פיפטה, 12 ערוצים, 5-250uL	VistaLab טכנולוגיות	1060-0250
קצות פיפטה רב 12 ערוצים 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
קצות פיפטה רב 12 ערוצים 250 μ l	VistaLab Technologies	4060-9025
גויאבה easyCyte 5HT ציטומטר זרימה שולחני	EMD Millipore	0500-4005
NIH אוספים קליניים 1 ו-2 ספריות מולקולות קטנות	Evotec
שם	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
<חזק>להכנת מדיה של תאי גזע עצביים (500 מ"ל)			<חזק>ריכוז סופי
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	קורנינג	90-091-PB	1X
מלח נתרן הפרין	סיגמא אולדריץ'	H3149	0.0002%
HEPES 1M	סיגמא אולדריץ'	H4036	5.4 מ"מ
אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14.5 מ"מ
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
פרוגסטרון	סיגמא אולדריץ'	P8783	16 ננומטר
פוטרסין	סיגמא אולדריץ'	P5780	4.8 ומיקרו; M
Basic FGF (FGF2),	Human GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
מסנן בקבוק, 150 מ"ל, 33 מ"מ, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	השתמש לסינון חומרי עיקור