שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
בתוך מערכת החיסון המולדת, לימפוציטים המכונה תאים הטבעיים (NK) רוצח ממלאות תפקיד חיוני בהגנה מארח נגד תאי סוטה, במיוחד חיסול tumoral ו לשווק נגוע תאים. פגמים monogenic ידוע כ-30, יחד עם שורה של מצבים פתולוגיים אחרים, לגרום מחסור התא NK תפקודית או קלאסי, מתבטא ב מופחתת או נעדר ציטוטוקסיות פעילות. מבחינה היסטורית, cytotoxicity נחקר בשיטות רדיואקטיביות, אשר הם מסוכנים, מסורבל ויקר. מאמר זה מתאר שיטה מבוססת cytometry זרימה יעילה, ישים קלינית לכמת פעילות ציטוטוקסיות התא NK. זה assay, תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) או מטוהרים ההכנות התא NK הם שיתוף incubated-יחסים שונים עם קו תא הגידול יעד ידוע להיות רגישים NK תאית cytotoxicity (NKCC). התאים היעד הם מראש עם תוויות עם הפלורסנט כדי לאפשר האפליה מתאי אפקטור (תאי NK). לאחר תקופת דגירה, התאים היעד ההרוגים מזוהים על ידי כתם חומצת גרעין, וחוקר במיוחד תאים מתים. שיטה זו היא נוטה גם אבחון המחקר והיישומים, הודות ליכולות פרמטר מרובה של cytometry זרימה, יש יתרון נוסף של פוטנציאל המאפשר ניתוח עמוק של פנוטיפ התא NK ותפקוד.
מבוא
תאים (NK) רוצח טבעי הם תת-קבוצה מתוחכם של לימפוציטים אנושיים מולדת אנושות מעורב חיסול של תאים נגועים לשווק, טרנספורמציה תאים אחרים איומים פתוגניים 1,2. תאי NK בגרגרים lytic בית חלבונים ציטוטוקסיות, כגון perforin ו- granzymes. בעת ההפעלה, תאי NK טופס באינטראקציה מורכבת עם המטרות שלהם הידוע בשם סינפסה חיסוניות, לפיה מולקולות cytolytic אלה מתפרסמים באופן מקומי, וכתוצאה מכך פירוק תא היעד הישיר אפופטוזיס, יחד עם שחרור ציטוקינים ו כימוקין, בסופו של דבר ב- אינדוקציה של דלקתיות המדינה 1,3,4.
הפעלת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הדגימות נאספו בהתאם להנחיות האתיות שנקבעו על ידי התוכנית להגנה על מחקר אנושי של UCLA ואושרו על ידי IRB.
1. הכנת ריאגנטים
הערה: אלא אם צוין אחרת, יש לאפשר לכל הריאגנטים להתאזן בטמפרטורת החדר לפני השימוש. כל הריאגנטים חייבים להישאר סטריליים.
- הכן תמיסת עבודה פי 2 של Tween-20 (כלומר, 0.2%) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת Tween-20 ל-5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום עם פיפטה p20.
- בהתחשב בצמיגות הגבוהה של Tween-20, בצע את הצעדים הבאים כדי להבטיח דיוק: אסוף לאט כדי למנוע היווצרות בועות, אל תטבול את כל הקצה כדי למנוע העברה, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים ב-PBS כדי לשטוף את כל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני הגדרת וזמינותו, מומלץ מאוד כי תוכן התא NK להידרש באוכלוסייה אפקטור של בחירה. איור 1 מציג צביעת CD56 טיפוסית לפני (תכלת) ואחרי העשרה התא NK (אדום). תאי NK מהווים עד 15% PBMCs, צריך להיות לפחות 80% טהור לאחר העשרה.
ניתוח תזרים cytometric ב assay הזה כרוך גילוי של שני פרמטרים: CFSE, לזיהוי בערוץ אותו כמו FITC; כתם תא מת, לזיהוי בערוץ אותו כמו APC (איור 2 אב'
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המתוארת כאן מספק אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית מסורתי 51Cr שחרור הנועד להעריך התא NK פעילות ציטוטוקסיות. בשיטה זו הוא רגיש, הדירים פחות זמן רב יותר בשיטות הרגילות הקודם, כמו CRA, יכול לשמש עבור שניהם קליני, מחקר יישומי.
בעוד וזמינותו עובד עם PBMCs הכולל וגם תאי NK מועשר, האפשרות להשתמש PBMCs ללא הצורך לטהר תא אוכלוסיות הוא תועלת רבה בהתמודדות עם כמויות קטנות של דם שנאספו או איכות או המסכן כמה תאים מדגימות של המטופלים. זה וזמינותו מנצל רק CFSE של תאים מתים הדרה הכדאיות הכתם. מסתכל ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין התנגשויות עניין פיננסי.
תודות
ברצוננו להודות ג'יל Narciso, UCLA מרכז Immunogenetics, על הסיוע עם הכנת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (1x, w/o Ca2+ ו-Mg2+) | קורנינג (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| סרום בקר עוברי מומת | בחום Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | פתרון מלאי ב-10,000 U/mL |
| IL-2 | R& D Systems | 202-IL-050 | ליופיליזציה מ-0.2 μ m תמיסה מסוננת באצטוניטריל ו-TFA עם BSA כחלבון נשא. להקים מחדש עם 500 ul ב-100 μ גרם/מ"ל בחומצה אצטית סטרילית של 100 מ"מ המכילה לפחות 0.1% אלבומין בסרום בקר (2.1x10E6 IU/ml) |
| תאי K562 | ATCC | CCL-243 | קו תאי סרטן |
| צלוחיות תרבית תאים T-75 | Corning | 431464 | |
| ערכת התפשטות תאים CFSE | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstruct I בקבוקון עם 18 ul DMSO להכנת תמיסת מלאי של 5 מ"מ. אין להקפיא/להפשיר. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | מסופק ב-5 μ M ב-1 מ"ל DMSO. תמיסת ה-DMSO עשויה להיות נתונה למספר מחזורי הקפאה-הפשרה ללא השפלה של ריאגנטים. |
| צינורות איסוף דם נתרן/ליתיום הפרין | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96 בארות | צלחת קורנינג | CLS3897 | |
| פיפטות סרולוגיות | BD פלקון | ||
| פוליסטירן צינורות תחתונים עגולים (5 מ"ל) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן | BD Falcon | 352070 | |
| 15 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent Reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| קוקטייל העשרת תאי NK אנושיים | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
מקורות
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
