הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

24.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56191

⸱

9 באוגוסט 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.

תקציר

בתוך מערכת החיסון המולדת, לימפוציטים המכונה תאים הטבעיים (NK) רוצח ממלאות תפקיד חיוני בהגנה מארח נגד תאי סוטה, במיוחד חיסול tumoral ו לשווק נגוע תאים. פגמים monogenic ידוע כ-30, יחד עם שורה של מצבים פתולוגיים אחרים, לגרום מחסור התא NK תפקודית או קלאסי, מתבטא ב מופחתת או נעדר ציטוטוקסיות פעילות. מבחינה היסטורית, cytotoxicity נחקר בשיטות רדיואקטיביות, אשר הם מסוכנים, מסורבל ויקר. מאמר זה מתאר שיטה מבוססת cytometry זרימה יעילה, ישים קלינית לכמת פעילות ציטוטוקסיות התא NK. זה assay, תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) או מטוהרים ההכנות התא NK הם שיתוף incubated-יחסים שונים עם קו תא הגידול יעד ידוע להיות רגישים NK תאית cytotoxicity (NKCC). התאים היעד הם מראש עם תוויות עם הפלורסנט כדי לאפשר האפליה מתאי אפקטור (תאי NK). לאחר תקופת דגירה, התאים היעד ההרוגים מזוהים על ידי כתם חומצת גרעין, וחוקר במיוחד תאים מתים. שיטה זו היא נוטה גם אבחון המחקר והיישומים, הודות ליכולות פרמטר מרובה של cytometry זרימה, יש יתרון נוסף של פוטנציאל המאפשר ניתוח עמוק של פנוטיפ התא NK ותפקוד.

מבוא

תאים (NK) רוצח טבעי הם תת-קבוצה מתוחכם של לימפוציטים אנושיים מולדת אנושות מעורב חיסול של תאים נגועים לשווק, טרנספורמציה תאים אחרים איומים פתוגניים 1,2. תאי NK בגרגרים lytic בית חלבונים ציטוטוקסיות, כגון perforin ו- granzymes. בעת ההפעלה, תאי NK טופס באינטראקציה מורכבת עם המטרות שלהם הידוע בשם סינפסה חיסוניות, לפיה מולקולות cytolytic אלה מתפרסמים באופן מקומי, וכתוצאה מכך פירוק תא היעד הישיר אפופטוזיס, יחד עם שחרור ציטוקינים ו כימוקין, בסופו של דבר ב- אינדוקציה של דלקתיות המדינה 1,3,4.

הפעלת התא NK כרוך מחרוזת המורכבת של מפעיל, מעכבות האינטראקציות בין NK התא קולטנים ליגנדים באה לידי ביטוי על פני השטח של התאים היעד, ויוצרים מערכת מוסדרת בחוזקה. אחד המנגנונים הכי נחקרות של הפעלת תאי NK הוא חסר ה"עצמי". אכן, חוסר זיהוי של מחלקה שאני רס ן histocompatibility מורכבים (MHC), או מולקולות של אנטיגן (הלע) לויקוציטים אנושיים, על נגוע או טרנספורמציה המפעילים תאי NK תא cytotoxicity. גידול של תאים הנגועים בנגיף בדרך כלל downregulate אנטיגנים אלה כדי להימלט חסינות T תאית, וכך להפוך NK ראשי תא מטרות 1,3,4.

הערכה של תפקוד תאי NK היא בעיקר מחולקת degranulation או cytotoxicity מבחני. עם זאת, מבחני degranulation, כגון זרימת cytometric זיהוי של דה מרקר הקשורים degranulation CD107a, הם רק מעיד של הפעלת תאי NK ולא של תפקידם האולטימטיבי, ההרג הישיר של היעד תאים 5,6,7,8. לפיכך, מגבלה זו יש נמשך החוקרים מבחני cytotoxicity כתחליף לספר יותר, ישירה יותר.

ותיק "תקן הזהב" להערכת פעילות ציטוטוקסיות תאית של תאי T ו- NK היא וזמינותו שחרור כרום (CRA). CRA כרוך radioactively תיוג של התאים היעד עם 51Cr משותפת המקננת בהם עם תאים אפקטור. זה וזמינותו ספוגים העיקרון שהזה פירוק התא תוצאות במהדורה של חלבון מכורך 51Cr לתוך תגובת שיקוע, אשר נמדד על ידי סופר גמא. זה וזמינותו, בזמן יעיל, הוא בעייתי עבור מגוון סיבות: עלויות חומרים גבוה, טיפול, סילוק של רדיואקטיבי 51Cr, לשחרור ספונטני של 51Cr ו תקינה קשה - שהופך אותו לגמרי מעשי 9,10.

מאז פותחו מספר מבחני שאינו רדיואקטיבי, מעורבים תיוג פלורסנט, שחרור אנזים ו ביולומינסנציה אפילו, כחלופות CRA 11,12,13,14. נתאר כאן שיטה מבוססת cytometry זרימה למדידת NK תא ציטוטוקסיות פעילות התאים היעד K562 פשוט, רגיש, וניתן לשחזור. K562 תאים הם תא אנושי erythroleukemic קו עם ביטוי מופחתת של הכיתה הלע ביטוי מוגבר של ליגנדים עבור רצפטורים NK activatory, מה שהופך אותם רגישים במיוחד NK cytotoxicity תאית 15ואני. זה assay, K562 תאים מסומנים מראש עם אסתר succinimidyl diacetate carboxyfluorescein (CFSE) תרבותי משותף-יחסי שונים עם תאי תאי או דם היקפיים (PBMCs) או מטוהרים תאי NK 1. CFSE הוא צבע פלורסנט יציב, מחייב חלבון המאפשר אפליה של התאים היעד מ 16,של תאי NK אפקטור17. לאחר שיתוף הדגירה, כתם חומצת גרעין, במיוחד המגובש הקרום של תאים מתים, משמש לזיהוי תאי היעד נהרג (ראה טבלה של חומרים). הדגימות נרכשים ואז על cytometer זרימה כדי לקבוע את אחוז המלח (קרי, הכתם +) CFSE + התאים היעד.

Assay הזה יכול לשמש הקרנה אבחון שגרתי על פגמים monogenic להשפיע על תא התא NK, אשר יש כ 30 פגם ידוע גורם תפקודית או קלאסי NK תא מחסור, ועל lymphohistiocytosis hemophagocytic ראשית או משנית. זה שימושי גם לחקור את פעילות תאי NK בחולים עם זיהומים נגיפיים הרפס חוזרים ונשנים, חמור, כדי להעריך את שיחזור המערכת החיסונית לאחר השתלת תא hematopoietic או פוסט immunomodulatory טיפול 18,19,20, ועבור שורה של יישומי מחקר בסיסי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הדגימות נאספו בהתאם להנחיות האתיות שנקבעו על ידי התוכנית להגנה על מחקר אנושי של UCLA ואושרו על ידי IRB.

1. הכנת ריאגנטים

הערה: אלא אם צוין אחרת, יש לאפשר לכל הריאגנטים להתאזן בטמפרטורת החדר לפני השימוש. כל הריאגנטים חייבים להישאר סטריליים.

  1. הכן תמיסת עבודה פי 2 של Tween-20 (כלומר, 0.2%) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת Tween-20 ל-5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ללא סידן ומגנזיום עם פיפטה p20.
    1. בהתחשב בצמיגות הגבוהה של Tween-20, בצע את הצעדים הבאים כדי להבטיח דיוק: אסוף לאט כדי למנוע היווצרות בועות, אל תטבול את כל הקצה כדי למנוע העברה, ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים ב-PBS כדי לשטוף את כל Tween-20 מהקצה.
  2. הוסף 2 μL של תמיסת מלאי IL-2 (2.1E6 IU/mL) ל-198 μL של מדיה שלמה (כלומר, דילול 1:100), שהוא RPMI עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS), ולאחר מכן המשך לדילול נוסף של 1:100 על ידי הוספת 2 μL של תמיסת ביניים IL-2 ל-198 μL של מדיה שלמה להכנת פתרון עבודה פי 7 (210 IU/mL).
  3. הוסף 2 μL של תמיסת מלאי CFSE (5 mM) ל-500 μL של מדיה רגילה (RPMI). מערבולת, סובב כלפי מטה כדי להסיר טיפות מהמכסה, ואז המשך בדילול נוסף של 1:20 על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת הביניים CFSE ל-950 מיקרוליטר של RPMI רגיל כדי לקבל פתרון עבודה פי 2 של 1 מיקרומטר. מערבולת היטב ושמירה מוגנת מפני אור.

2. בידוד PBMCs כתאי אפקטור

הערה: בדיקה זו אומתה לשימוש יעיל עם סך כל PBMCs מבקרות בריאות. עם זאת, מומלץ לאמת את תכולת תאי ה-NK עם כל תכשיר PBMC (איור 1). כמו כן, נפח הדם המלא לאיסוף מבוסס על תדירות תאי NK בדם מלא היקפי וזה עשוי להשתנות מאדם לאדם, במיוחד בין תורמים בריאים למטופלים.

  1. אסוף לפחות 4 מ"ל של דם מלא אנושי בצינורות איסוף דם נתרן או ליתיום הפריניזציה. יש לאחסן דגימות דם בטמפרטורת החדר בעת האיסוף ולהשתמש תוך 30 שעות מרגע האיסוף.
  2. יש לדלל דם מלא ב-4 מ"ל PBS (כלומר נפח שווה של PBS לדם מלא).
  3. הוסף 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות (ראה טבלת חומרים) לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שכב בזהירות דם מלא מדולל על תמיסת שיפוע הצפיפות על ידי הטיית הצינור.
  4. צנטריפוגה ב-650 x גרם למשך 24 דקות כשהבלם כבוי.
  5. אסוף בזהירות את שכבת התאים החד-גרעיניים, שהיא השכבה הלבנה הדקה מתחת לשכבה העליונה של פלזמה וטסיות דם, לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. הביאו את הנפח ל -15 מ"ל עם PBS.
  6. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 10 דקות עם הבלם. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-0.5 מ"ל של מדיה שלמה.
  7. השתמש במונה תאים אוטומטי או בהמוציטומטר כדי לספור את התאים, והתאם את ריכוז ה-PBMC ל-5x106 תאים/מ"ל עם מדיה שלמה.
  8. בדוק את תכולת תאי ה-NK על ידי זרימה ציטומטרית (ראה שלב 4).
  9. התחל את הבדיקה תוך 30 דקות. שמור את התאים בטמפרטורת החדר עד 10 דקות, או הניח באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש.

3. בידוד של תאי NK כתאי אפקטור

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מהווה חלופה לשימוש ב-PBMCs הכוללים כתאי אפקטור. התפוקה האופיינית מ-4 מ"ל דם מלא מאדם בריא היא כ-4x105 תאי NK, או כ-5-15% מה-PBMCs, אם כי תדירות זו משתנה בין התורמים 21. מומלץ לבצע בדיקת טוהר לאחר הבידוד.

  1. אסוף לפחות 4 מ"ל של דם מלא אנושי בצינורות איסוף דם נתרן או ליתיום הפריניזציה. קח 50 מיקרוליטר של דם מלא כדי להכתים כדגימת העשרה מוקדמת.
  2. מוסיפים את קוקטייל ההעשרה לדגימות דם ב-50 מיקרוליטר/מ"ל (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב ומדגרים 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף נפח שווה של PBS + 2% FBS כדי לדלל את הדגימה ולערבב היטב בעדינות.
  4. הוסף 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שכב בזהירות את הדגימה המדוללת על גבי מדיום שיפוע הצפיפות.
  5. צנטריפוגה ב-1,200 x גרם למשך 10 דקות כשהבלם כבוי.
  6. אוספים בזהירות את שכבת התאים המועשרים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. שטפו את התאים על ידי העלאת הנפח עד 50 מ"ל עם PBS + 2% FBS.
  7. צנטריפוגה בחום של 300 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה.
  8. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש תאים ב-0.5 מ"ל של מדיה שלמה.
  9. בעזרת מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר, ספרו את התאים והתאימו את הריכוז ל-5x105 תאים/מ"ל. קח 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים מטוהר לצביעה כדגימה לאחר העשרה.
  10. שמור את התאים בטמפרטורת החדר עד 10 דקות, או הניח באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש.

4. אימונופנוטיפ להערכת תכולת תאי NK

  1. באמצעות 50 מיקרוליטר PBMCs מבודדים, העשרה מוקדמת של דם מלא או תאי NK מטוהרים, צביעה בנוגדנים מצומדים נגד CD56 פלואורוכרום כסמן תאי NK. ניתן לכלול גם סמנים לסוגי תאים ושושלות אחרים (כלומר תאי CD3+ T, תאי CD19+ B) כדי להעריך את מקור הזיהום, אם בכלל.
  2. יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולשטוף על ידי הוספת 2 מ"ל PBS + 2% FBS.
  3. צנטריפוגה ב 450 x גרם למשך 5 דקות.
  4. עבור תאי PBMC או NK, שאפו תאים סופרנטנט והשעו מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS + 2% FBS.
  5. עבור דגימות דם מלאות, בצע ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC):
    1. לאחר צנטריפוגה, יש לשאוב את הסופרנטנט ולהשעות מחדש במאגר ליזה של תאי דם אדומים בנפח 2 מ"ל (31.75 גרם אמוניום כלוריד + 4.16 גרם בסיס טריס + 6.65 גרם EDTA, מומס ב-5000 מ"ל מים נטולי יונים).
    2. דוגרים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. חזור על הכביסה פעמיים, שאב את הסופרנטנט והשהה מחדש את הדגימה הליזה ב-100 מיקרוליטר PBS + 2% FBS.
      הערה: ניתן לבצע ליזיס RBC גם לפני הצביעה.
    4. המשך בניתוח זרימה ציטומטרי.

5. הפשרה, תרבית וקציר של תאי מטרה K562

  1. הכניסו 10 מ"ל של מדיה שלמה לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל והניחו להתחמם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. להפשרה ותרבות של תאי K562, השתמש רק במדיה שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס עבור כל השלבים.
  2. הניחו בקבוקון אחד של תאי K562 קפואים באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס עד שרובו מופשר.
  3. העבירו את תאי K562 המופשרים למחצה למדיה השלמה, שחוממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס, בצינור החרוטי של 15 מ"ל. שטפו את החלק הפנימי של הבקבוקון הקריוגני עם מעט מדיה מחוממת מראש, והוסיפו את הכביסה לצינור של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב-140 x גרם למשך 7 דקות עם הבלם. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה שלמה.
  5. בחר כמות מתאימה של תרחיף תאים לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
  6. התאם את הריכוז ל-1x10 5-2x105 תאים/מ"ל ותרבית בחממה לחה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפחות לפני השימוש. שמור על התרבית בטווח צפיפות זה לא יותר מ-3 חודשים, ולאחר מכן הפשיר מנה חדשה. לעולם אל תחרוג מריכוז תאים של 1x106 תאים/מ"ל בתרבית.
  7. לשימוש בבדיקה, ערבבו היטב את תרבית התאים K562 עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל והסירו אליקוט כדי לספור ולהעריך את כדאיות התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר וצביעה של טריפן בלו.
    1. אם הכדאיות נמוכה מ-85%, המשך בשלבים הבאים להסרת תאים מתים.
      1. הוסף 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל, לפי הצורך. אסוף את כל התאים מהתרבית וכסה לאט את תרחיף התא על תמיסת שיפוע הצפיפות על ידי הטיית הצינור.
      2. צנטריפוגה במהירות 650 x גרם למשך 24 דקות עם בלם כבוי. אוספים בזהירות את שכבת התאים החיים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. הביאו את הנפח ל-50 מ"ל עם PBS.
      3. צנטריפוגה ב-450 x גרם למשך 10 דקות עם הבלם. הסר את ה-supernatant והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיה שלמה. ספור את התאים ובדוק את כדאיות התאים (כמו ב- 5.7).
      4. תרבית באינקובטור לחות של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפחות לפני השימוש.
  8. אסוף 5x105 K562 תאי מטרה וצנטריפוגה ב-140 x גרם למשך 7 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר במדיה עם 1% FBS.

6. תיוג של תאי יעד K562

הערה: ודא שתאי K562 מושעים היטב לפני הוספת פתרון העבודה של CFSE.

  1. פיפטה 500 מיקרוליטר של תמיסת העבודה CFSE ל-500 מיקרוליטר של תאי K562 לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר. בעזרת אותו קצה של 1000-1250 מיקרוליטר, מערבבים מיד על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה 3-5 פעמים.
  2. דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס או בחממה לחה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך><. הערה: מכיוון שזמן השהיית שיווי המשקל בטמפרטורה ארוך יותר בחממה בהשוואה לאמבט המים, ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן הדגירה במיוחד לנפחים > 1 מ"ל.
  3. הרוו את תגובת התיוג עם 10 מ"ל של מדיה שלמה למשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה את תאי K562 המסומנים ב-140 x גרם למשך 7 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש ב-1 מ"ל של מדיה שלמה.
  5. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר והביא את הריכוז ל-1x105 תאים/מ"ל במדיה שלמה.
  6. יש להניח תאים בחממה לחה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש. ניתן לשמור את התאים בטמפרטורת החדר עד 10 דקות, או באינקובטורCO2 לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש. אין לשמור בקירור.

7. ציפוי

הערה: אם תאי NK מגבילים, ניתן להפחית בחצי את הריכוז של תאי K562 ו-NK, כך שמחצית מהתאים מצופים בבדיקה. הבדיקה מניבה תוצאות דומות עם מחצית מכמות התאים (כל עוד היחסים נשמרים עקביים).

  1. אם אתה משתמש ב-PBMCs כוללים, סמן צלחת עם 96 בארות, תחתית U, שטופלה בתרבית רקמות עבור התנאים הבאים לכל באר: (1) אפקטור (E): יעד (T) = 50: 1 + IL-2 - בקרה חיובית לציטוטוקסיות של תאי NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12.5 : 1; (5) E : T = 6.25 : 1; (6) T - תאי מטרה בלבד - בקרה שלילית למוות K562; (7) E - תאי אפקטור בלבד; (8) T + Tween - בקרה חיובית למוות K562
  2. אם משתמשים בתאי NK מטוהרים, סמן צלחת מטופלת בתרבית רקמה עם 96 בארות, תחתית U עבור התנאים הבאים לכל באר: (1) אפקטור (E): מטרה (T) = 5: 1 + IL-2 - בקרה חיובית לציטוטוקסיות של תאי NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2.5 : 1; (4) E : T = 1.25 : 1; (5) E : T = 0.625: 1; (6) T - תאי מטרה בלבד - בקרה שלילית למוות K562; (7) E - תאי אפקטור בלבד; (8) T + Tween - בקרה חיובית למוות K562
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה שלמה לתנאים 3, 4, 5, 6, 7. לשם כך ולכל השלבים הבאים, (מומלץ) השתמש בפיפטה רב-ערוצית.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר של תאי אפקטור (PBMCs ב-5x106 תאים/מ"ל או תאי NK מטוהרים ב-5x105 תאים/מ"ל) לתנאים 1, 2, 3. הוסף תאי אפקטור לתנאים 4-7 על ידי דילול טורי. אל תשנה טיפים ממצב למצב.
    1. מערבבים את מצב 3, לוקחים 100 מיקרוליטר ומעבירים למצב 4.
    2. מערבבים את מצב 4, לוקחים 100 מיקרוליטר ומעבירים למצב 5.
    3. מערבבים את מצב 5, לוקחים 100 מיקרוליטר ומעבירים למצב 7; למצב 6 אין תאי אפקטור.
  5. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מוכנה 2x 0.2% טווין למצב 8 (ריכוז סופי: 0.1% Tween-20); למצב 8 אין תאי אפקטור.
  6. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת עבודה IL-2 למצב 1. יש להוסיף IL-2 לתרחיף תאי האפקטור לפני הוספת תרחיף תאי המטרה (ריכוז סופי: 27 IU/mL).
  7. הוסף 100 מיקרוליטר של תאי מטרה (מסומנים תאי K562 ב-1x105 תאים/מ"ל) לתנאים 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. תנאי 7 אינו כולל תאי מטרה.
  8. מערבבים את כל הבארות עם פיפטה רב ערוצית וצנטריפוגה את הצלחת בחום של 120 x גרם למשך 2 דקות.
  9. דגירה בחממת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. בתום הדגירה, הניחו את הצלחת על קרח והמשיכו להכתים את הכדאיות תוך 30 דקות.

8. צביעה לצורך כדאיות ורכישה

  1. הכן כתם תאים מתים (ראה טבלת חומרים) על ידי הוספת 3 מיקרוליטר מתמיסת מלאי 5 מיקרומטר ל-600 מיקרוליטר של PBS.
  2. הוסף 50 מיקרוליטר של כתם תאים מתים מדולל לכל באר לנפח סופי של 250 מיקרוליטר וריכוז סופי של 0.005 מיקרומטר. מערבבים היטב עם פיפטה רב-ערוצית.
  3. המשך בניתוח זרימה ציטומטרי. באמצעות ציטומטר זרימה, אסוף לפחות 1,000 אירועים בשער תא המטרה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2) לקבלת תוצאות מובהקות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לפני הגדרת וזמינותו, מומלץ מאוד כי תוכן התא NK להידרש באוכלוסייה אפקטור של בחירה. איור 1 מציג צביעת CD56 טיפוסית לפני (תכלת) ואחרי העשרה התא NK (אדום). תאי NK מהווים עד 15% PBMCs, צריך להיות לפחות 80% טהור לאחר העשרה.

ניתוח תזרים cytometric ב assay הזה כרוך גילוי של שני פרמטרים: CFSE, לזיהוי בערוץ אותו כמו FITC; כתם תא מת, לזיהוי בערוץ אותו כמו APC (איור 2 אב'

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת כאן מספק אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית מסורתי 51Cr שחרור הנועד להעריך התא NK פעילות ציטוטוקסיות. בשיטה זו הוא רגיש, הדירים פחות זמן רב יותר בשיטות הרגילות הקודם, כמו CRA, יכול לשמש עבור שניהם קליני, מחקר יישומי.

בעוד וזמינותו עובד עם PBMCs הכולל וגם תאי NK מועשר, האפשרות להשתמש PBMCs ללא הצורך לטהר תא אוכלוסיות הוא תועלת רבה בהתמודדות עם כמויות קטנות של דם שנאספו או איכות או המסכן כמה תאים מדגימות של המטופלים. זה וזמינותו מנצל רק CFSE של תאים מתים הדרה הכדאיות הכתם. מסתכל ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין התנגשויות עניין פיננסי.

תודות

ברצוננו להודות ג'יל Narciso, UCLA מרכז Immunogenetics, על הסיוע עם הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (1x, w/o Ca2+ ו-Mg2+)קורנינג (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
סרום בקר עוברי מומתבחום Omega ScientificFB-02
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140-163פתרון מלאי ב-10,000 U/mL
IL-2R& D Systems202-IL-050ליופיליזציה מ-0.2 μ m תמיסה מסוננת באצטוניטריל ו-TFA עם BSA כחלבון נשא. להקים מחדש עם 500 ul ב-100 μ גרם/מ"ל בחומצה אצטית סטרילית של 100 מ"מ המכילה לפחות 0.1% אלבומין בסרום בקר (2.1x10E6 IU/ml)
תאי K562ATCCCCL-243קו תאי סרטן 
צלוחיות תרבית תאים T-75Corning431464
ערכת התפשטות תאים CFSELife Technologies (CellTrace)C34554Reconstruct I בקבוקון עם 18 ul DMSO להכנת תמיסת מלאי של 5 מ"מ. אין להקפיא/להפשיר.
Sytox RedLife TechnologiesS34859מסופק ב-5 μ M ב-1 מ"ל DMSO. תמיסת ה-DMSO עשויה להיות נתונה למספר מחזורי הקפאה-הפשרה ללא השפלה של ריאגנטים.
צינורות איסוף דם נתרן/ליתיום הפריןBD02-687-95
U-bottom 96 בארותצלחת קורנינגCLS3897
פיפטות סרולוגיותBD פלקון
פוליסטירן צינורות תחתונים עגולים (5 מ"ל)BD Falcon14959-5
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןBD Falcon352070
15 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילןBD Falcon352097
Reagent ReservoirUSA Scientific2321-2230
קוקטייל העשרת תאי NK אנושייםStemCell Technologies (RosetteSep)15065
פתרון מלאי

מקורות

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

תגיות

NKPBMCK562
וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.