כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה
במאמר זה
סיכום
תקציר
רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.
מבוא
הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1-הכנת תרביות חיידקים.
- לגדול כל התרבויות Erlenmeyer מבחנות עם יחס נפח תרבות/הבקבוקון של לכל היותר 1/6. הגדרה ניסויית טיפוסית, צומחים התרבויות ב 37.0 ° C, ומנענע ב 160 סיבובים לדקה morpholinepropanesulfonic חומצה (MOPS) מינימלי בינוני 18 בתוספת מקור פחמן מועדף, לדוגמה 0.2% גלוקוז, במשך לפחות 10 דורות רצופים לפני הקטיף רנ א.
- יום לפני הקציר RNA, לדלל תרבות outgrown של המתח הרצוי במדיום מינימלי המגבים באופן כזה כי הוא יגיע OD הרצוי של 436 בזמן הרצוי ביום המחרת. חישוב הנפח של תרבות גדולים מדי לשימוש עבור חיסון באמצעות הנוסחה:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.
Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראונין µg/mL, לאוצין, ארגינין, µg 5/mL היסטידין ב 37 מעלות צלזיוס רועדת 160 סיבובים לדקה. ארגינין הרעבה הוצג על-ידי סינון של התרבות, resuspension ט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שונות, ו- 3) על מנת להבטיח את sp ecificity של הגששים שנבחר עבור tRNAs עניין. נקודות אלה מופנים בנפרד למטה.
tRNA טיהור
TRNAs כבר טהור של e. coli בצורה עדינה מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אוריאה | Merck | 57-13-6 | טוהר >99% |
| פוליאקרילאמיד | Serva | 79-06-7 | |
| Bis (N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| חומצה טריכלורואצטית (TCA) | Sigma | 76-03-9 | |
| Phenol | Merck | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| גלוקוז | |||
| נתרן אצטט | |||
| EDTA | |||
| אתנול | |||
| טריס | |||
| חומצה | |||
| נתרן כלורי | |||
| NaH2PO4 | |||
| נתרן ציטראט | |||
| SDS | |||
| הרינג זרע | DNA סיגמא | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| פוליוויניל פירולידון | |||
| פיקול | |||
| P32 וגמא; ATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (בדיקות) | TAG קופנהגן | ||
| Hybond N+ ממברנה | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| טייפון FLA 7000 סורק | GE Healthcare | 28955809 | |
| ספקטרופוטומטר | |||
| תנור | |||
| Geiger-Mü ller tube | |||
| זרחן הדמיית מסך | |||
| Hybridization צינור | |||
| תרבות צלוחיות | |||
| 1.5 מ"ל צינורות | |||
| 20 מ"ל צינורות צנטריפוגה | |||
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| ImageQuant | GE Healthcare | ||
| Excel | Microsoft |
מקורות
- Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
- Sorensen, M. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
