הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56212

⸱

22 באוגוסט 2017

 ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

תקציר

רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.

מבוא

הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.

tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.

E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.

שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של "mischarging"; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג'לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.

עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.

דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של "משק", כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.

באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית "selC"). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1-הכנת תרביות חיידקים.

  1. לגדול כל התרבויות Erlenmeyer מבחנות עם יחס נפח תרבות/הבקבוקון של לכל היותר 1/6. הגדרה ניסויית טיפוסית, צומחים התרבויות ב 37.0 ° C, ומנענע ב 160 סיבובים לדקה morpholinepropanesulfonic חומצה (MOPS) מינימלי בינוני 18 בתוספת מקור פחמן מועדף, לדוגמה 0.2% גלוקוז, במשך לפחות 10 דורות רצופים לפני הקטיף רנ א.
  2. יום לפני הקציר RNA, לדלל תרבות outgrown של המתח הרצוי במדיום מינימלי המגבים באופן כזה כי הוא יגיע OD הרצוי של 436 בזמן הרצוי ביום המחרת. חישוב הנפח של תרבות גדולים מדי לשימוש עבור חיסון באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-1
    הערה: כאן, OD החדש מציין את יתר הרצוי 436 לאחר דגירה, V חדש מציין את אמצעי האחסון של התרבות מדולל, OD הישן מציין את יתר 436 של התרבות outgrown מדולל מ, G מציין את מספר דורות התרבות יגדל, החל הזמן של דילול (t 1) לזמן זה צורך יום אחרי (t 2), יכול להיות מחושב כמו: זמן ההפרש (בדקות) בין t 1 ו- t 2 חלקי הזמן דור (בדקות). כדי להבטיח צמיחה יציבה בזמנו של הדגימה, G צריך להיות ≥ 10; V הישן מציין את אמצעי האחסון של התרבות מבוגר יותר יש להעביר המדיום טריים. המשוואה הזו היא הערכה לא להסביר כל שלב לג; תופעה נצפתה לעיתים קרובות לאחר דילול של תרבות יותר בוגר בתקשורת טריים.
    1. תנאי הגידול ישתנו בהתאם מטרת הניסוי, אבל כדי להגביל לתא וריאציה ברמות tRNA וכדי להגדיל את הפארמצבטית של התוצאות, (מומלץ) לגדול התרבויות לייצב למצב שלפני דגימה 19.

2. הכנה של תאים ספייק

הערה: המתח e. coli MAS1074, אשר מבטאת את הגן selC קידוד tRNA selC תחת השליטה של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- יזם inducible משמש המתח ספייק-ב.

  1. Dilute תרבות outgrown של MAS1074 יתר 436 0.05 ב MOPS בינונית מזערי בתוספת 100 אמפיצילין µg/mL ו- 0.2% גלוקוז. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס רועדת-160 סיבובים לדקה.
    הערה: ראה את הדיון לשימוש של זן התייחסות חלופית.
  2. OD-436 ~ 0.1, להוסיף IPTG ריכוז סופי של 1 מ מ לזירוז הביטוי של tRNA selC. לגדול התרבות יתר 436 ~0.5 (~ 3-4 h של צמיחה) לעבור את הבקבוקון תרבות אמבטיית קרח. לשמור על התרבות התא ספייק-אין על הקרח עד כל דוגמאות לטיהור RNA נקצצו.

3. הקציר של דגימות ניסיוני.

  1. חם מראש (37 מעלות צלזיוס) אחד הכתיר 100 מ ל Erlenmeyer את הבקבוק (או דומה) המכילה 4 מ ל 10% (w/v) חומצת חומץ טריכלור (TCA) עבור כל דגימה על-ידי הצבתו באמבט מים מחומם.
    הערה: זהירות, TCA מפרקת על חימום, מפיק אדים רעילים, מאכל כולל מימן כלורי, כלורופורם. הפתרון במים הוא חומצה חזקה; הוא מגיב באלימות עם בסיסים, שמשחית מתכות רבות. נאות אמצעי זהירות יש לנקוט בעת שימוש הנוזל.
  2. מייד לפני הקציר תא, למדוד ולהקליט את יתר 436 של התרבות.
  3. למסוק את התאים, להעביר 4 מ"ל של תרבות בקבוקון ומחוממת מראש הכולל TCA.
  4. לערבב את הדגימה על ידי מתערבל את הבקבוקון בעבודת יד 5 ס' מיקסינג עם TCA מיד מבטלת פעילויות אנזימטיות הכל, ובכך שומרת על רמות טעינה של tRNAs.
    הערה: אם מספר דוגמאות יש לאסוף, לשמור דגימות שנקטפו ב- TCA על הקרח עד כל דוגמאות שנאסף.

4. תוספת של תאים ספייק

הערה: הכנה של תאים ספייק מתואר בשלב 2.

  1. כאשר כל דגימות להכנה RNA נאספו, להוסיף 5% ספייק תאים (מבוסס על יתר) כל דגימה.
    הערה: הנפח של תרבית תאים ספייק-אין צורך מחושבת באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-2
    שם V ספייק מציין את עוצמת הקול של תרבית תאים ספייק-אין צורך, V exp מציין את אמצעי האחסון של תרבית תאים ניסיוני שנקטפו (ללא TCA), OD exp מציין את יתר 436 של התרבות תאים ניסיוני בזמן הקציר לתוך TCA. OD ספייק מציין את יתר 436 של התרבות ספייק-בתא. אם מספר דוגמאות נקצרים-לקיחת שונים, הנפח של ספייק תאים נוסף צריך להיות מותאם על פי הנוסחה לעיל עבור כל דגימה.
  2. לכמת את התרומה מתאי ספייק-in המינים RNA של עניין, להכין מדגם בלבד המכילה תאים ספייק על-ידי ערבוב מ ל 4 תאים ספייק 4 מ ל TCA. להכין RNA מהדגימה הזה באותה הדרך הדגימות אחרים.
  3. אופציונלית, לקחת את הבקבוק אחר המכיל רק את הדגימה ניסיוני, ללא תאים ספייק, ולכלול אותו כדי לכמת את התרומה של המדגם ניסיוני ל tRNA רמות selC; הרמות אנדוגני של tRNA selC ב E. coli K-12 נמוכים החזרה.

5. הכנה של RNA

הערה: פרוטוקול הכנה RNA המתוארים כאן הוא בעיקרו המתוארת על-ידי. Varshney et al. 1; כדי להימנע deacylation של tRNAs aminoacylated במהלך טיהור, חשוב לשמור את הדוגמאות ב- pH חומצי ב-0 מעלות צלזיוס לאורך כל הקורס של טיהור. צינורות סטרילי נקי/צלוחיות להחזיק את דוגמאות ופתרונות ושימוש להכין כל הפתרונות עם הנדסה גנטית (18.2 MΩ·cm resistivity) מים-

  1. יוצקים 8 מ ל כל מדגם לתוך שפופרת קרח צונן צנטריפוגה. צנטריפוגה דגימות 10 דקות ב 9,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר תגובת שיקוע ו resuspend ב 0.3 mL קר 0.3 M סודיום אצטט, pH 4.5 ו-10 מ מ EDTA.
  2. להעביר כל מדגם צינור microcentrifuge קר 1.5 מ"ל ולהוסיף פנול 0.3 mL equilibrated עם המאגר אותו.
    הערה: זהירות, פנול מייצר גזים רעילים והוא מאוד שמשחית העור.
  3. מערבולת כל לדגום 10 x 15 s לפחות 1 דקות בין כל מערבולת. בין vortexing שומרים את הדגימות ב 0 מעלות צלזיוס להשתמש ההפסקות בתדירות גבוהה כדי להבטיח כי הדגימות יישארו קר.
  4. צנטריפוגה דגימות למשך 15 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. העברת השלב מים (שלב העליון) כדי microcentrifuge 1.5 mL החדש צינורות. הוספת פנול קר 0.3 mL ו- s מערבולת 4 x 15 כבעבר.
  5. צנטריפוגה 10 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. העברת השלב מים כדי microcentrifuge חדש, קר mL 1.5 צינורות המכיל פי 2.5 הנפח של 96% אתנול (µL ~ 750). לזרז את הרנ א מאת המקננת הצינורות עבור h 1 ב-20 ° C או ללון ב-80 מעלות צלזיוס
  6. צנטריפוגה דגימות למשך 30 דקות ב 20,000 g x-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע והוסף בזהירות 1 מ"ל אתנול 70% קר מבלי להפריע בגדר RNA. בעדינות ' היפוך ' פעם אחת כדי לשטוף את הקרביים של הצינורות עם אתנול.
    הערה: בגדר יכולה להיות קשה לראות בשלב זה.
  7. צנטריפוגה 10 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר עד אתנול לא נשאר. Resuspend בגדר מאת נמרצות vortexing ב- 20 µL קר 10 מ"מ סודיום אצטט pH 4.5 ו- 1 מ"מ EDTA.
    הערה: לא יתר לייבש בגדר כפי יהפוך שקשה resuspend.
  8. אופציונלית, להעריך את הריכוז של ה-RNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm.
  9. אופציונלית, להעריך איכות RNA מטוהרים agarose ג'ל אלקטרופורזה 20-
  10. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
< p class= "jove_title" > 6. הכנת מבחינה כימית deacylated הבקרה מדגם

הערה: כדי להבחין בין הלהקה של aminoacylated tRNA המקביל deacylated על הצפון כתם, מבחינה כימית deacylated aliquot מוכן על ידי טיפול אלקליין. עבור מרבית המטרות, זה מספיק כדי deacylate דוגמה אחת עבור כל כתם הצפוני.

מדגם
  1. להפשיר הרנ א על קרח. העברה של aliquot 4 µL המדגם RNA צינור חדש. הוסף µL 46 טריס-HCl pH 9.0. תקופת דגירה של 2 h ב 37 º C
  2. להוסיף 15 µL של 0.3 M סודיום אצטט ב- pH 4.5, להוסיף לאחר מכן µL 125 של 96% אתנול. לזרז RNA ב-20 ° C עבור ה 1
  3. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 20,000 g x 4 ° C. לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע ו resuspend ב 4 µL 10 מ מ קר סודיום אצטט pH 4.5 ו- 1 מ מ EDTA.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, אם המדגם מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס

7. ג'ל אלקטרופורזה החיוורים ומכתים בצפון

  1. µL לערבב 4 מדגם (ללא טיפול או כימית deacylated) עם µL 6 טעינת מאגר (0.1 M סודיום אצטט (pH 5.0), שמונה מ' שתנן, 0.05% bromophenol כחול, ו 0.05% קסילן cyanol).
    הערה: לזכור לכלול המדגם שמכילה רק ספייק תאים, מבחינה כימית deacylated מדגם (וגם את הדגימה בלי ספייק תאים, אם אחד לא היה מוכן).
  2. לטעון את הדוגמאות על 0.4 מ מ עבה 6.5% לזיהוי ג'ל (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) המכילה אוריאה 8 M 0.1 M סודיום אצטט מאגר (pH 5.0). השתמש ג'לים ארוך 60 ס מ על הפרדה נאותה של מינים tRNA.
  3. נפרד הרנ א על ידי אלקטרופורזה-ג'ל V/ס מ 10-4 מעלות צלזיוס, עד bromophenol הכחול מגיע לתחתית של הג'ל (~ 20 h).
  4. האזור של קסילן cyanol לצבוע ו- 20 ס מ למטה לכיוון הכחול bromophenol צבע משמש עבור סופג (המרחק בין שני צבעים צריך להיות 25-30 ס"מ). הפרד בזהירות את שתי הזכוכיות, כך הג'ל נשאר על אחד מהם. פיסת נייר סינון דק חתוך לגודל של blotting באזור הרצוי, הממוקמת מעל החלק של הג'ל שישמש עבור סופג. החלקים של הג'ל שאינם מכוסים על-ידי מסנן נייר חתוך, שנזרקו. להשתמש נייר הסינון בזהירות להרים את החתיכה ג'ל הרחק לוח הזכוכית.
    הערה: הג'ל גדול שברירית מאוד אז לטפל.
  5. קרום ניילון הטעון חיובית (למשל ממברנה N Hybond +) מונחת על גבי הג'ל וזה electroblotted בגיל 20 V במשך 90 דקות באמצעות 40 מ מ טריס-אצטט (pH 8.1), 2 מ מ EDTA כמו מאגר העברה.
  6. Crosslink הרנ א למוח באמצעות UV-אור (0.12 J/cm 2).
    הערה: ניתן לאחסן את הקרום עכשיו בטמפרטורת החדר, ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

8. תכנון ואימות של הגששים

הערה: זהיר תכנון ואימות של הגששים חשופה הצפוני הוא חיוני כדי להשיג תוצאות אמינות והימנע הצלב-הכלאה בלתי רצויים עם מינים אחרים רנ א.

  1. שימוש oligonucleotides סינתטי קצר כמו הגששים. לעצב את רצף בדיקה בדרך כי זה משלים את החלק הייחודי ביותר של הרצף של tRNA עניין - בדרך כלל מדובר הלולאה anticodon.
    הערה: רשימת רצפי tRNA החזוי של אורגניזמים שונים ניתן למצוא את סינתזת גנומית מסד נתונים (GtRNAdb) 21-
  2. התאם אורך הרצף להשיג החזוי של נמס בטמפרטורה של 55-65 מעלות צלזיוס.
  3. הפיצוץ (בסיסי מקומי חיפוש הכלי יישור) הנבחר רצף נגד רצף הגנום של המתח בקטריאלי בשימוש הניסוי, כדי לוודא כי הרצף הוא ייחודי tRNA שנבחר, כמתואר ב- 22-
    הערה: טבלה 1 מציגה רצפי בדיקה המוצע עבור מספר tRNAs שונים של e. coli K12. אם המכשיר הוא ספציפי tRNA עניין, רק שתי להקות גלויים על האבן החשופה הצפוני (tRNA טעון, לא טעונים), הלהקה היחיד הוא גלוי בנתיב עם הדגימה deacylated (tRNA לא טעונים). אם יותר משתי להקות קיימים או אם נוסף רצוי אימות היחודיות בדיקה, ראה דיון.

9. הכלאה של כתם בצפון

הערה: בשלבים הבאים, הקרום ברצף hybridized עם הגששים משלים tRNAs הספציפי הרצוי, כולל בדיקה מסוימת עבור ההפניה tRNA selC.

  1. למקם את הקרום בשפופרת הכלאה, להוסיף 6 מ ל הכלאה פתרון (0.9 M NaCl, 0.05 M NaH 2 PO 4 (pH 7.7), 5 מ מ EDTA, 0.5% (w/v) מרחביות, 100 מ"ג/מ"ל של לכסנתם, שפגע בסימני הרינג זרע DNA ו 5 x Denhardt ' פתרון s (100 x Denhardt ' s פתרון = אלבומין שור 2%, פוליוינילפירולידון 2% 40 ו- 2% Ficoll)).
  2. Hybridize מראש את הקרום במאגר עבור h 1 מסתובב ב 42 ° C. להוסיף 30 pmol רדיואקטיבי oligo-DNA בדיקה 5 ' - end - שכותרתו עם 32 P (שהוכן כפי שתואר על ידי. Sambrook et al. 23)
    הערה: זהירות, פליטת אנרגיה גבוהה בטא 32 P יכול להציג על העור ניכר, עין במינון הזארד. נאות אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר באמצעות 32 פסולת רדיואקטיבית פ צריך להיות מסולק לפי הפרוטוקולים בטיחותי מוסדי מתאים.
  3. דגירה החללית עם קרום לילה מסתובב ב 42 ° C. הסר המכשיר באמצעות פיפטה של 10 מ"ל חד פעמיות-
    הערה: אם לאחסן במקפיא המכשיר ניתן להשתמש בהם.
  4. בצינור הכלאה, לשטוף את הקרום זמן קצר ב 50 מ של 0.3 M NaCl, 30 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות בטמפרטורת החדר.
    הערה: זו שטיפת הראשון מכיל הרבה לא מאוגד בדיקה, חייבים להיות מטופלים כמו רדיואקטיבי.
  5. חזור על צעד 9.4 פעם אחת ולאחר מכן להעביר את הקרום מיכל פלסטיק שטוחים או מגש כולל מכסה. מכסה את הקרום עם הפתרון כביסה (0.3 M NaCl, 30 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות), דגירה זה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לשנות את הפתרון כביסה ולהמשיך את הכביסה עד אות מספק יחס הרעש התקבל (לעיתים קרובות שינויים 3-4 פתרון לרחוץ). להשתמש שפופרת גייגר-מילר כדי לזהות כיצד הרעש אות יחס משתנה על ידי מדידת הקרינה של אזור ריק של הקרום ולהשוות אותם לאזור שבו המכשיר יש hybridized במיוחד כדי tRNA.
  7. כדי להיות מסוגל לפרק את המכשיר מהקרום לאחר החשיפה, ודא כי (חשוב) הקרום לא יתייבש לפני ההליך חשפנות. למקם את הקרום דק שקית פלסטיק או לעטוף אותו בחוזקה באמצעות פלסטיק לעטוף ויסגור שזה יהיה אוויר חזק על ידי קלטת או ריתוך. מקם את הקרום אטום על מסך phosphorimaging.
    הערה: זמן החשיפה הדרוש על המסך phosphorimaging נקבעת על-ידי פעילות ספציפיים של החללית, הכמות של RNA ובחן for, ואת היעילות הכלאה של החללית, וכן יכולים להשתנות במידה רבה; בין מספר דקות עד מספר ימים. עם ניסיון, עוצמת הקרינה זוהה על הקרום עם שפופרת גייגר-מילר נותן סימן טוב זמן החשיפה הדרוש. על כימות אמין, זה חשוב כי המסך לא חשיפת.
  8. לסרוק את המסך phosphorimaging משתמש בסורק לייזר ולשמור את הקובץ ב- " הג'ל " תבנית.
    הערה: אות גבוהה יחס הרעש הוא הכרחי עבור כימות אמין. בודק את tRNA יביא שתי להקות; אחד aminoacylated המכיל tRNA (העברה איטי), אחד deacylated המכיל tRNA (העברה מהירה יותר). ראה איור 2-

10. מפשיטים את הקרום

הערה: לפני הקרום פתור עבור tRNA אחר, המכשיר הקודם קודם להסירו על ידי הפשטת את הקרום.

  1. חום מספיק הפשטת מאגר (15 מ"מ NaCl, 1.5 מ מ סודיום ציטרט, 0.1% (w/v) מרחביות) כדי לכסות את הקרום ואשפוך אותם הקרום. דגירה זה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. חזור על שלב 10.1 עד אין קרינה יכולה להתגלות עם שפופרת גייגר-מילר; הקרום עכשיו יכול להיות מחדש hybridized ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 9-

11. לכימות tRNA וטעינה רמות

  1. לטעון הקובץ הג'ל לתוך ההדמיה תוכנה (ראה את הטבלה של חומרים). לצייר קו אנכי לאורך כל אחד המסלולים מדגם בצורה כזו כי זה משתרע על פני רוב רוחב השביל אך אינה כוללת את הקצוות של הלהקות שבו האות יכול להיות אחיד, כפי שמוצג איור 3 א.
  2. Visualize נחשב ליין כל על ידי לחיצה " ניתוח "-> " ליצור גרף ". להגדיר באופן ידני את שתי הפסגות המייצגים את הטעון של tRNA לא טעונים כל ליין, כפי שמוצג באיור 3B.
  3. לקבל ספירות מפסגת כל על-ידי לחיצה על " ניתוח "-> " הדו ח ", ולהקליט את האזור תחת כל אחד שתי הפסגות.
  4. כאשר יש כבר ובחן את האבן החשופה tRNA selC, סינתזת אחד לפחות של עניין, לנרמל את הרמות של tRNA עניין tRNA selC.
    1. לחשב את הפרופורציה של tRNA שמקורם התאים ספייק-אין כל ליין ולחסר האות הכולל בנתיב הזה באמצעות המשוואה:
      figure-protocol-3
      הערה: הנה, לטעום tRNA = האות המתקבל נתיב אחד קרום ובחן עבור סינתזת הרצוי; מדגם selC = האות המתקבל באותו הנתיב של קרום זהה ובחן עבור tRNA selC; Ref tRNA = האות המתקבל השביל המכיל רק ספייק-ב תא RNA של קרום זהה ובחן עבור סינתזת הרצוי; Ref selC = האות המתקבל השביל המכיל רק ספייק-ב תא RNA של קרום זהה ובחן עבור tRNA selC.
    2. לנרמל, לחלק את הערך tRNA מתוקן כל ליין ע י האות selC tRNA מ באותו הנתיב.
      הערה: התרומה של האות selC tRNA מתאי שנדגם הוא זניח (ראה איור 2, ליין הנקרא "-selC ").
  5. לחשב את סינתזת טעינה ברמת עבור כל ליין על-ידי חלוקת האות השיא המייצג tRNA טעון עם הסכום של האות מ שתי הפסגות (טעון + לא טעונים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.

Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראונין µg/mL, לאוצין, ארגינין, µg 5/mL היסטידין ב 37 מעלות צלזיוס רועדת 160 סיבובים לדקה. ארגינין הרעבה הוצג על-ידי סינון של התרבות, resuspension ט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שונות, ו- 3) על מנת להבטיח את sp ecificity של הגששים שנבחר עבור tRNAs עניין. נקודות אלה מופנים בנפרד למטה.

tRNA טיהור

TRNAs כבר טהור של e. coli בצורה עדינה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אוריאהMerck57-13-6טוהר >99%
פוליאקרילאמידServa79-06-7
Bis (N,N'-מתילן-ביס-אקרילאמיד)BIO-RAD161-0201
חומצה טריכלורואצטית (TCA)Sigma76-03-9
PhenolMerck108-95-2
IPTG
גלוקוז
נתרן אצטט
EDTA
אתנול
טריס
חומצה
נתרן כלורי
NaH2PO4
נתרן ציטראט
SDS
הרינג זרעDNA סיגמא100403-24-5
BSA
פוליוויניל פירולידון
פיקול
P32 וגמא; ATPPerkin Elmer
DNA oligos (בדיקות)TAG קופנהגן
Hybond N+ ממברנהGE HealthcareRPN203B
Crosslinker
ElectroblotterBIO-RAD
טייפון FLA 7000 סורקGE Healthcare28955809
ספקטרופוטומטר
תנור
Geiger-Mü ller tube
זרחן הדמיית מסך
Hybridization צינור
תרבות צלוחיות
1.5 מ"ל צינורות
20 מ"ל צינורות צנטריפוגה
שםחברהCatalog NumberComments
Software
ImageQuantGE Healthcare
ExcelMicrosoft
הידרוכלוריתהידרידיזציה GE Healthcare מיקרוצנטריפוגה

מקורות

  1. Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
  2. Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
  3. Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
  4. Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
  5. Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
  6. Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
  7. Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
  8. Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).
  9. Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
  10. Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  11. Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
  12. Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
  13. Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
  14. Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).
  15. Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
  16. McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
  17. Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
  18. Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
  19. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  20. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  21. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  22. Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
  23. Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA tRNAtRNARNANorthern BlottingSpike inRNAtRNAtRNA
כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.