הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56226

⸱

10 באוגוסט 2017

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

תקציר

מתחם שינויים בביטוי הגנים מתווכים בדרך כלל חלק גדול של תגובה תאית. כל הגן עשויים להשתנות הביטוי קינטיקה ייחודי כמו הגן מוסדר על ידי עיתוי מסוים אחד של גירויים רבים, איתות המסלולים או השפעות משניות. כדי לתפוס את הגן כולו ביטוי בתגובה היפוקסיה ב שמרים cerevisiae ס, ניתוח ה-RNA-seq שימש כדי לנטר את רמות ה-mRNA של כל הגנים במועדים ספציפיים לאחר חשיפה היפוקסיה. היפוקסיה הוקמה על ידי גידול תאי גז2 ~ 100% N. חשוב, בניגוד מחקרים אחרים שתקבעו, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות לא נוספו לכלי התקשורת כי מטבוליטים אלה משפיעים על ביטוי גנים. נקודות זמן נבחרו בטווח של 0 - 4 שעות לאחר היפוקסיה כי תקופה זו לוכדת את השינויים העיקריים בביטוי הגנים. בכל נקודה בזמן, היו תאים ובשפתיים יומן אמצע במהירות מסונן, קפוא, הגבלת החשיפה O2 ו הנלווה שינויים בביטוי הגנים. RNA הכולל היה שחולצו מן התאים, משמש כדי להעשיר את ה-mRNA, אשר לאחר מכן הוסב cDNA. CDNA זו, נוצרו ספריות מולטיפלקס, דגימות 8 או יותר היו וסודרו בנתיב אחד של ברצף הדור הבא. צינור שלאחר רצף מתואר, אשר כוללת חיתוך בסיס איכות, לקרוא מיפוי וקביעת מספר קריאות לכל הגנים. DESeq2 סביבת סטטיסטי של R שימשה לזיהוי גנים לשנות באופן משמעותי בכל אחד של נקודות זמן שתקבעו. ניתוח של משכפל ביולוגי שלושה גילה הפארמצבטית גבוהה, הגנים של קינטיקה שונות ומספר רב של ציפה O2-מוסדר גנים. שיטות אלה שניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התאים של אורגניזמים שונים מגיבים היפוקסיה לאורך זמן ו הותאם ללמוד ביטוי גנים במהלך תגובות אחרים התאית.

מבוא

אורגניזמים רבים מגיבים היפוקסיה או O נמוך2, על ידי שינוי גנטי ביטוי 1,2,3. תגובה זו מסייעת להתמודד עם חוסר קריטי עבור נשימה אירובית, כמה תגובות biosynthetic הוחלף נגזר מצע, אלא גם עם מצב חמצון-חיזור המשתנים 4תאים. מספר מחקרים microarray הופיעה cerevisiae ס מראים כי רמות ה-mRNA של מאות גנים שינוי בתגובה היפוקסיה 5,6,-7,-8,-9 , 10 , 11 , 12. לאחרונה, ה-RNA-seq שימש לאפיין שינויים בביטוי הגנים לאורך זמן במהלך היפוקסיה 13. כאן מוצגים הפרטים ניסיוני ודן.

היפוקסיה יכול להיעשות בדרכים שונות, כל אחת לייצר רמה שונה של O2. . הנה, היפוקסיה הוקמה על ידי זורם באופן רציף אולטרא-גבוה-טוהר N2 לתוך מבחנות, אשר מוריד את [O2] התפרקה באופן מיידי עם קינטיקה לשחזור 10. זה אפשרי כי ישנם כמה O2 מולקולות נוכח שתורמים ביטוי חילוף החומרים, ג'ין אבל סביבה זו נחשבת מאוד קרוב אנאירובית. בהיעדר O2, תאי שמרים לא biosynthesize heme, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות 4,12,14. לכן, מחקרים קודמים כללו מטבוליטים אלה כאשר גדל שמרים ללא חמצן 5,10,15. עם זאת, תגובות ובשפתיים רבים הם מתווכת על ידי דלדול של מטבוליטים אלה, ובכך חידוש אותם מפלות 12,16תגובות ביטוי גנים ובשפתיים. כדי לחקות היפוקסיה טבעי, מטבוליטים אלה לא נוספו לכלי התקשורת. בזמן הקצר כי תאים נחשפו היפוקסיה ללא הנוכחות של מטבוליטים חיוניים אלה, היה ללא עלייה ניכרת מוות תאי (נתונים לא מוצג) ולא של מתח ממושך בתגובה 13.

התגובה היא גם תלויה במתח, גנוטיפ שלה. חשוב במיוחד הם אללים של הרגולטורים הידוע של תגובות ובשפתיים 2. רקע המתח S288C רצוי מאוד כך ניתן להשוות תוצאות המחקרים גנומית אחרים עם זן זה. עם זאת, S288C מכיל של אלל אובדן-של-פונקציה חלקית מתוך HAP1 ג'ין 17, הרגולטור תעתיק קריטיים על התגובה ובשפתיים. אלל הזה תוקן ב- S288C באמצעות wildtype העתק מן Σ1278b זן רקע 11.

ביטוי גנים הוא תלוי מאוד הסביבה התאית. לפיכך, בעת ביצוע ניתוח mRNA הגנום כולו, חשוב לשמור על סביבה מתמדת תוך שינוי פרמטר נוסף כגון זמן, גירוי או גנוטיפ. כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור, שקול שיטות עבודה מומלצות שלושה אלה לצורך המחקר ואת כל שלה ביולוגי או טכנית משכפל. קודם כל, experimenter(s) אותו צריך לבצע את המחקר, מאז שיטות טכניות עשויים להשתנות על פני ניסויים. שנית, מאותה אצווה של מרכיבים אמור לשמש בתקשורת צמיחה כמו כל אצווה יש קומפוזיציה שונה במקצת, אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. שלישית, כדי למזער את ההשפעות מחזור התא, כל נקודת זמן צריכה להכיל תאים אסינכרוני בשלב אמצע יומן של צמיחה (1-2 x 107 תאים/mL).

כאשר אפיון תגובה מורכבים כמו התגובה ביטוי גנים היפוקסיה, קורס זמן הוא יתרון בקביעת את קינטיקה של אירועים שונים. נקודות זמן מסוים צריך להיבחר כי ללכוד את השינויים העיקריים של התגובה. במחקר זה, נצפו נקודות זמן בין 0 ל- 4 שעות, כי ניסויים קודמים חשפו נרחבת שינויים בביטוי הגנים במהלך תקופה זו, 13.

כדי למדוד ביטוי גנים גלובלית, RNA-seq היה בשימוש 18,19. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי כדי לקבוע שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל. לעומת ניתוח microarray DNA, RNA-seq תערוכות רגישות גבוהה יותר (כדי לזהות תעתיקים פחות בשפע), טווח דינמי גדול (למדוד שינויים קיפול גדול), הפארמצבטית סופריור (לעקוב במדויק ביטוי גנים לאורך זמן). בדרך כלל, רנ א ביותר הסלולר היא ribosomal RNA שפותחו שיטות רבות להעשרת RNA ספציפיים מינים 20. . פולי-T חרוזים שימשו לטיהור poly-A-המכיל mRNA תעתיקים, למרות השונות מסחרית - ערכות דלדול rRNA זמינים גם יכול להיות יעיל ב- mRNA העשרה.

כאן, התאפיינה התגובה ביטוי cerevisiae ס גנים היפוקסיה. התאים היו חשופים היפוקסיה, ואז לטעום-8 נקודות זמן (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 דקות). כדי לאשר הפארמצבטית וכדי לזהות תעתיקים סטטיסטית שהשתנו, משכפל ביולוגי שלוש בוצעו. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית וטיהור עמודה ולאחר מכן מעובד לניתוח RNA-seq. הצינור שלאחר רצף מתואר, תכנות סקריפטים ניתנים לאפשר שכפול מדויק של הניתוחים שבוצעו. באופן ספציפי, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, את הסביבה סטטיסטי R 24, ו DESeq2 חבילה 25 שימשו כדי לעבד את הנתונים RNA-seq לזיהוי גנים ועוד 607 חסימות לשנות באופן משמעותי במהלך היפוקסיה. ניתוח גורמים ראשיים (PCA), ביטוי גנים של משכפל ציינו את הפארמצבטית של הטכניקה. שירות האשכולות, heatmaps גילה ביטוי נרחב קינטיקה, בעוד מפענוח אונטולוגיה (קדימה) הראה כי תהליכים תאיים רבים, כמו נשימה אירובית, מועשרים בערכה של גנים מוסדר חמצן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גרימת היפוקסיה

  1. יום אחד או יותר לפני הקורס זמן היפוקסיה: הכנת החממה, תא הסינון מערכת ואקום, מיכל הדלק, מבחנות, פקקים, צינורות זכוכית, אבובים, כמו שולחן חומרים.
  2. הנח את N2 טנק, חממה, ואקום ומערכת סינון בסמיכות, כדי לאפשר עיבוד מהיר של תאים.
  3. הכן סטרילי מדיה YPD נוזלי (1% תמצית שמרים, peptone 2%, 2% גלוקוז) על ידי ערבוב המרכיבים בקבוק זכוכית, autoclaving.
  4. תכנון הפריסה של מבחנות בחממה.
    הערה: ממיכל2 N, הבקבוק הראשון תהיה מלכודת מים, הבקבוקון השני תהיה הנקודה בפעם האחרונה, הבקבוק השלישי יהיה נקודת זמן ברגע האחרון וכן הלאה עד הבקבוק האחרון אשר הוא מלכודת מים הסופי. איור 1 מציג את סדר והקשרים בין המבחנות.
  5. יום לפני זמן הקורס לחסן מושבה שמרים לתוך תרבות של 5 מ ל נוזל YPD בתוך מבחנה סטרילית. באופן ספציפי, להרים מושבה מלא מצלחת באמצעות מקל המוליך סטרילי. מקם את המקל לתוך YPD נוזלי ומנערים את המקל עד רוב התאים ההשעיה.
  6. לסובב את הצינורות ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה (h ~ 16).
    הערה: אחרי ה' 16, wildtype תאים ישתפרו רוויה (~ 2 x 108 תאים למ"ל), המצוין על-ידי תרבות מעונן מאוד. זנים אחרים עשויה להימשך זמן רב להגיע רוויה, צריך להיבדק על ידי מדידת ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים, כפי שמצוין בשלב 1.9.4.
  7. ביום של מסלול הזמן, לאחר 16 h של דגירה, לדלל את התרבות רווי 1:50 על-ידי שימוש של pipet מ למקום 4 מיליליטר לילה תרבות לתוך 196 מ של YPD נוזלי בתוך בקבוקון סטרילי 500 מ"ל. לגדול עם טלטול-~ 200 סל ד במשך 4 שעות ב- 30 ° C.
    הערה: לאחר 4h, תרבות wildtype תגיע ריכוז יומן אמצע של ~ 1-2 x 107 תאים/מ ל....
  8. במהלך 4 שעות, תווית המבחנות (ממלכודות היפוקסיה ומים), 50 מ ל אוסף צינורות. אם החממה בשלב 1.7 לעיל אינו בשימוש עבור הקורס זמן היפוקסיה, להפעיל את חממה אחרים ולהגדיר 30 ° C.
  9. לפני העמדת תאים היפוקסיה:
    1. להוסיף שתי המבחנות סטרילי 250 מ ל אשר ישמש המלכודות מים ~ 50 מ ל מים.
    2. ממלאים 1/3 של קרח דלי עם חנקן נוזלי ויציפו מתלה פוליסטירן מוקצף להחזיק 50 מ ל צנטריפוגה צינורות.
    3. להגדיר את מערכת סינון עבור איסוף תאים. להוסיף דיסק מסנן סטרילי אל יחידת התחתון של מערכת סינון באמצעות פינצטה סטרילי, נזהר רק לגעת קצות התקליטור מסנן. למקם את יחידת מסנן העליון על גבי יחידת התחתון מסנן ולאבטח עם המלחצות מסופק עם המערכת. ודא כי היחידות תחתון ועליון מיושרים, שהוא חותם צר, אין נזילה.
    4. מודדים את ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים. לדלל תאים כך הם ניתן למדוד טווח ספקטרופוטומטרים-OD600 בין ~0.2 - 0.6, בהתאם ספקטרופוטומטרים ליניארי.
      הערה: יחידה אחת של600 יתר היא ~ 3 x 107 תאים למ"ל, בהתאם ספקטרופוטומטרים ומורפולוגיה של תא. ריכוז של ~ 1-2 x 107 תאים למ"ל צפוי, המתאים OD600 של ~0.33 - 0.66.
    5. להשיג במהירות את דוגמת הזמן 0.
      1. להתחבר למערכת מסנן ואקום חזק (~ 10 mbar) דרך צינורות ואקום מלכודת הבקבוק 1,000 מ. הפעל את שואב האבק. שופכים את התרבות (בדרך כלל ~ 20 מ"ל) לתוך יחידת העליון ולחכות נוזלי להילקח דרך המסנן (~ 10 s, סומך על כוחו של שואב האבק).
      2. בזהירות הסר את התקליטור מסנן עם פינצטה נקייה ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. מיד למקם את צינור צנטריפוגה המדף שקועים חנקן נוזלי. חשוב לציין, לא מראש מקררים הצינורות לפני הוספת המסנן את כל הצינורות תתפוצץ.
      3. לאחר > 30 s, במקום הצינור בפריזר-80 ° C לחילוץ RNA מאוחר יותר. לאחר כל סינון, לנקות ולהרכיב מערכת סינון. לשטוף את המערכת על ידי משיכת מים 10 s ללא דיסק מסנן. לבסוף, לנגב היבש המערכת עם מגבת נייר.
    6. לדלל את התרבות 4 שעות לתוך מבחנות שונות על הנקודות זמן שונים, כך כל הבקבוק מגיע באמצע יומן ריכוז (~ 1-2 x 107 תאים/mL) בנקודת הזמן המצוין של היפוקסיה.
      הערה: טבלה 1 מציגה דילולים ששימשו המתח הפלואידי פראי-סוג S288C HAP1+ . מומלץ לבחון כל הזנים בתנאים אלו תרבות ובשפתיים ולהתאים את דילולים בהתאם.
    7. ברגע תאים ומדיה מתווספים מבחנות, החלף את רדיד האלומיניום המכסה את הבקבוק עם פקק המכיל שני צינורות זכוכית מוכנס.
    8. הצב המבחנות בחממה בפריסה נקבע קודם לכן.
    9. להתחבר באופן מאובטח לאורך צינור כמוצג באיור1.
    10. בדוק כל פקקים יידחפו בחוזקה לתוך הפתחים הבקבוק.
  10. בזמן 0, פתח את השסתום הרגולטור. לאחר מכן הגדר את מד זרימה 3 L/min.
    הערה: מבעבעים יתקיימו בשני בקבוקי מים, המציינת את זרימת הגז המתאים. אם זה לא המקרה, בדוק כי כל פקקים הדוקות אבובים מחובר כראוי.
  11. סגירת החממה ולהגדיר את מהירות חזק ~ 200 סל"ד. להפעיל טיימר.
  12. לפני כל נקודת זמן, להגדיר את מערכת הסינון כפי שמתוארות למעלה בשלב 1.9.3.
  13. בכל פעם נקודה (למשל, 5 דקות, 10 דקות, וכו '), יש שני אנשים לעבד במהירות את התאים כדלקמן:
    1. האדם הראשון: להסיר את הבקבוק המתאים ממחזיק ולהוציא את הפקק (עם צינורות זכוכית מצורף).
      הערה: זה לא ישברו את הזרימה של N2 לכל המבחנות תרבות שנותרו אך זמנית ישבור את זרימת למלכודת המים האחרון.
    2. המשתמש השני: Pipet 1 מ"ל של תרבות ונותנות לתוך cuvette. חבר מחדש את הצנרור מן הבקבוק תרבות זה עכשיו בסוף השורה האחרונה מלכודת מים (שפופרת אחת ווויל פקק אחד ניתן להסיר בתהליך.). לאחר מכן, למדוד ריכוז תא cuvette, כפי שתואר לעיל בשלב 1.9.4.
    3. האדם הראשון: שופכים את השארית של התרבות לתוך מערכת סינון אבק, ולאחר מכן לבצע הקפאה כמתואר לעיל בשלב 1.9.5 וסינון.
  14. לאחר סיום כל נקודות זמן, לכבות את הגז2 N. תחילה סגור הרגולטורים ולא לחכות הלחץ לשחרר, ולאחר מכן כבות מד זרימה. לבסוף, לפרק את המערכת ולנקות כל החומרים עם מים, ולאחר מכן 70% אתנול.

2. RNA החילוץ

  1. להכין מאגר RLT RNA עמודות טיהור, כפי שמתואר בטבלה חומרים.
  2. להכין הפתרון עובד של DNase על-ידי הוספת 10 µL של הפתרון מניות DNase µL 70 מאגר לקט לבוא איתך לכל דגימה (ראה טבלת חומרים).
  3. להסיר את הצינורות 50 מ ל המכיל מסנני ותאים מהמקפיא-80 ° C ומניחים על הקרח להפשיר (~ 15 דקות). בצע את השלבים הבאים עם צינורות על קרח.
  4. תווית 2 mL צינורות כובע בורג ומניחים אותם על קרח, שפופרת אחת עבור כל דגימה. להוסיף ~0.6 מ"ל של חרוזים המחומצנים כל שפופרת, באמצעות צינור microcentrifuge 1.5 mL סקופ ולמדוד את החרוזים.
  5. להוסיף 0.6 מ"ל של מאגר RLT קר הצינורות 50 מ.
  6. Pipet למעלה ולמטה כדי להסיר תאים ממסנן והשהה לתוך פתרון. הימנע נותן את המסנן נשארים בתמיסה כפי המסנן לספוג את הפתרון. להסיר כל פתרון נספג את המסנן על-ידי שימוש בקצה pipet לסחוט את המסנן הקיר של הצינור.
  7. העברה כל הנוזל מהצינור 50 מ ל הצינורות בורג-כיפה המכילה חרוזים.
  8. למקם את הצינורות בורג-קאפ מהמגן מיל חרוז ולרוץ מין אחד.
    מיד במקום הצינורות על קרח למשך שלוש דקות. שוב, למקם את הצינורות מהמגן ולרוץ מין אחד.
  9. הסר את הצינורות מהמגן והמקום בקרח במשך 5 דקות. החרוזים יסדר לתחתית של הצינורות.
  10. בצע את שאר השלבים בטמפרטורת החדר.
  11. עם pipet, להעביר רק את lysate (~ 350 µL), הימנעות את החרוזים, אל צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  12. Microcentrifuge למשך 2 דקות מהירות מקסימלית, ואז העברת תגובת שיקוע צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
  13. להוסיף נפח 1 של 70% אתנול (ייוצרו מאתנול הוכחה לביולוגיה מולקולרית כיתה 200). מערבבים היטב בעזרת pipetting.
  14. להעביר את הפתרון וכל precipitate לעמודה ה-RNA הושם בתוך צינור אוסף 2 מ"ל.
  15. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 x g , להשליך הזרימה דרך (הנוזל בצינור).
  16. µL 350 מאגר RW1 להוסיף העמודה. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 גרם x, להשליך הזרימה דרך.
  17. להוסיף 80 µL DNase אני הדגירה מיקס למוח עמודה (לא לעלות על צידי הצינור) מאפשרים לשבת למשך 15 דקות.
  18. להוסיף 350 µL מאגר RW1 עמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g , להשליך הזרימה דרך.
  19. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g ו להשליך זרימה דרך.
  20. להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge למשך 2 דקות ב≥12, 000 x g.
  21. בזהירות להסיר את העמודה, למקם את צינור אוסף 2 מ"ל. Microcentrifuge במלוא המהירות עבור 1 דקות (כדי הקרום יבש לחלוטין).
  22. למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 30 µL של מים נטולי RNase קרום עמודה.
  23. Elute את הרנ א מן העמודה על-ידי microcentrifuging עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g. בעת טעינת העמודים לתוך microcentrifuge, ודא שהמכסים של הצינור אוסף פונות לכיוון לצנטריפוגה ספינים, כדי למנוע את המכסים מנתק מגע.
  24. להוסיף עוד 30 µL של מים נטולי RNase ממברנה עמודה, תוך שמירה על העמודה בצינור microcentrifuge אותו.
  25. Microcentrifuge עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g, כך שאמצעי האחסון eluate הסופי 60 µL.
  26. לאחסן כל שפופרת 1.5 mL המכיל 60 µL של RNA במקפיא-80 ° C.

3. קביעת ריכוז ה-RNA ואיכות

  1. למדוד את הריכוז של RNA ו- DNA בכל מדגם ה-RNA, באמצעות fluorometer (a), צבע (b) DNA ו RNA-ספציפי פלורסנט וצינורות assay (ג), כפי שמפורט בטבלה חומרים. בצע את ההוראות של fluorometer ושל הצבעים.
  2. לחלופין, מודדים את ריכוז חומצת גרעין עם ספקטרופוטומטרים UV שוכן בגובה 260 ננומטר.
    הערה: קריאת260 A של 1.0 הוא שווה ערך ל RNA חד-גדילי ~ 40 µg/mL.
  3. מבחן RNA איכות על ידי הפעלת את הרנ א על מנתח מסחרי חומצת גרעין (ראה טבלת חומרים) או על תקן פורמלדהיד/agarose ג'ל 26.

4. RNA-seq ניתוח

  1. מן המלאי RNA הכולל, לפצות µL 21 של 100 ng/µL RNA במים נטולי RNase. השתמש µL 1 של זו µL 21 כדי לבדוק את ריכוז ה-RNA כמפורט לעיל. שלח את הנותרים 20 µL (2 µg) הכולל רנ א רצף חיצוני מרכז העשרה mRNA, הכנת ספריה ספציפית סטרנד (עם 8 או יותר ברקודים עבור ריבוב) ורצף (ראה טבלת חומרים). לחלופין, לבצע באופן מקומי mRNA העשרה והכנה ספריה, ולאחר מכן לשלוח לספרייה. רצף.
  2. בריכת 8 או יותר דוגמאות מרובבת ואת רצף בנתיב אחד של ברצף הדור הבא.
  3. הורד את הקובץ FASTQ המכיל את כל הקריאות רצף וקורא האינדקס המתאים. כמו כן, הורד את קובץ הטקסט המכיל את מולטיפלקס ברקודים.
    הערה: קריאות אינדקס עשוי להיות נוכח קובץ נפרד FASTQ. מקם את כל הקבצים האלה לתוך ספרייה אחת.
  4. במקום ה-script של מעטפת שסופק כאן, "fastq_pipeline.sh", באותה ספריה. ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
    הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, איכות התסריט שמקצרת את הקריאות ממפה את הקריאות הגנום, יוצרת קובץ מופרד באמצעות טאב המכיל את מספר קריאות לפי ג'ין עבור כל דגימה.
  5. להפקיד את FASTQ קבצים ונתונים גולמיים ספירת קריאה לתוך Omnibus ביטוי גנים של NCBI לפני פרסום 27. בצע את ההוראות עבור "Submitting נתונים תפוקה גבוהה רצף גיאוגרפי": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. ייבוא נתוני ספירת קריאה לסביבת סטטיסטי של R ולבצע ניתוח סטטיסטי, שימוש ב- script של R שסופק כאן, "time_course_script. R". ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב.
    הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, קובץ script זה מייבא את הנתונים קריאה, מווסת את הקריאות, מזהה את הגנים לשנות בצורה משמעותית במהלך הזמן, מבצע ניתוח PCA וגרפים את הביטוי של גנים שנבחרו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מסלול הזמן היפוקסיה וניתוח RNA-seq בוצעו באופן עצמאי שלוש פעמים. כדי לבחון את הפארמצבטית של משכפל שלוש, ג'ין ביטוי נתונים עבור כל הגנים היה נותחה באמצעות ניתוח הרכיב העיקרי (PCA). איור 2 מציג כיצד לשנות הדוגמאות על הרכיבים העיקריים שני הראשונים, אשר ביחד מייצגים 58.9% ההשתנות. ניתוח זה יצוין כי כל הזמן קורס נספחים שינויים דומים (כפי שמתואר על ידי הצורה דומה של כל עקומה). בנוסף, משכפל שני היו דומה יותר אחד לשני מאשר שכפול הראשון. . זה עקבי עם העובדה כי משכפל ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, רמות ה-mRNA של כל הגנים נמדדה במהלך היפוקסיה ב ס cerevisiaeהשמרים. המטרה הייתה לבחון שינויים בביטוי גנים איך כלליים עקב גדילה בסביבה מבוקרת ליד-אנאוקסיים. מספר פעולות נעשו כדי להבטיח כי השיטה המתוארת כאן היה מבוקר ובזהירות לשחזור. ראשית, תאים נחשפו לסביבה ובשפתיים מוגדרים במדויק: 99.999% N2 במדיה עשירים (YPD). מחקרים אחרים של היפוקסיה סגרה הבקבוק או צינור האווירית, 32, היה. היפוקסיה-מימטי קובלט כלוריד 33או מועסק בתדר היפוקסיה אנאירובית צ'יימברס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים מכון לואיס-סיגלר על מתקן הליבה רצף גנומיקה אינטגרטיבית ב אוניברסיטת פרינסטון עצות טכניות ועל הכנה ספריית ה-RNA ורצף. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת רוואן ו NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חממה יבשה סגורהThermo ScientificMaxQ 4000סט ב-30 מעלות צלזיוס. שנה את הדלת כדי לאפשר כניסה של צינור טיגון אחד. לחלופין, השתמש בחממת ניו ברונסוויק G25, המכילה יציאת צינור. אל תשתמש בשייקר מים באוויר הפתוח, מכיוון שעיבוי יתאסף בצינורות בין צלוחות, אולי תרביות מזהמות צולבות.
מחזיק מסנן מיקרו-אנליזהMilliporeXX1002530 קוטר 25 מ"מ, תמיכת נירוסטה, מס' 5 תושבות פקק סיליקון מחוררות בבקבוק סינון סטנדרטי 125 מ"ל
ואקום חזקאדוארדסE-LAB 2" בית" הוואקום עשוי להיות חלש מדי. לחלופין, השתמש במשאבת ואקום ניידת חשמלית כמו זו המפורטת כאן.
1,000 מ"ללשמש כמלכודת ואקום.
~ 2 רגל אורכי צינורות ואקום קיר כבד, קוטר פנימי 3/8 אינץ', קוטר חיצוני 7/8ב-Tygon38TTשני חלקים: הראשון מחבר ואקום למלכודת, והשני מחבר מלכודת למערכת סינון.
דלק N2 בלחץ גבוה99.999% טוהר, >1,000 psi, עם ווסת ובקר זרימת גז
פתח בקבוק 500 מ"למכוסה בנייר אלומיניום. אחד לכל זן שמרים.
250 מ"ל חיטויפתחים מכוסים בנייר אלומיניום. אחד לכל נקודת זמן ועוד שניים למלכודות מים.
פקקי בקבוק (גודל 6, שני חורים בקוטר 5 מ"מ)מעוקר עם 70% אתנול. אחד לכל בקבוקון.
צינורות זכוכית, אורך 9 ס"מ או 17 ס"מ, קוטר פנימי 2 מ"מ, קוטר חיצוני 5 מ"ממעוקר עם 70% אתנול. שני צינורות לכל בקבוק. מניחים בחורים של כל פקק. ראה איור 1 למיקום צינורות 9 לעומת 17 ס"מ.
~25 ס"מ אורך צינורות פלסטיק, קוטר פנימי 5 מ"מTygonE-3603חתיכה אחת לכל בקבוק. מעוקר עם 70% אתנול.
דיסקיות סינון סטריליותMilliporeHAWP02500קוטר 25 מ"מ, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות, אחד לכל נקודת זמן
dH סטרילי2O (~100 מ"ל)
1 מ"ל קובטותלמדידת OD600 (כלומר, ריכוז תאים)
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהאחד לכל נקודת זמן
פינצטה
חנקןלהקפאת תאים
חרוזים שטופים בחומצהSigmaG8772שומרים על 4 מעלות; C לתאי ליזינג
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104לטיהור עמודות RNA
מאגרהכן על ידי הוספת 10 ומיקרו; L של β-Mercaptoethanol לכל 1 מ"ל של מאגר RLT, יש לשמור על 4&°C.
צינורות איסוף 2 מ"לQiagenכלול ב-Qiagen Rneasy Mini
Kit Buffer RPEQiagenכלול ב-Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiagenכלול ב-Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I מלאי ופתרונות עבודהQiagen79254האנזים DNase I מגיע כאבקה ליופילית בבקבוקון זכוכית. בעזרת מחט סטרילית ומזרק יש להזריק 550 ומיקרו; L של מים ללא RNase (מסופק בערכת Qiagen) לתוך הבקבוקון. מערבבים על ידי היפוך עדין של הבקבוק. כדי להימנע מדנטורציה של האנזים, אל תתערבל. בעזרת פיפט, הוציאו את תמיסת המלאי הזו מהבקבוקון ואחסנו במקפיא (-20 ° ג) במכסים חד-פעמיים (80 ומיקרו; L כל אחד). אין להפשיר ולהקפיא את תמיסת המלאי.
מאגר RDDQiagenכלול בערכת Qiagen DNase
קר קרח 2 מ"ל צינורותהברגה לליזינג תאים במהלך מיצוי RNA
הומוגנייזר טחנת חרוזיםBiospec Mini-Beadbeater-24112011שמור בחדר קר
Bacto PeptoneBDDF0118למדיה YPD נוזלית
תמצית שמרים Bacto BDDF0886לנוזל גלוקוז מדיה YPD
FisherD16למדיית YPD
נוזלית צינורות בדיקת QubitThermo FisherQ32856למדידת ריכוז חומצות גרעין
Quant-iTTM dsDNA BR ערכת בדיקהThermo FisherQ32853למדידת ריכוז חומצות גרעין
ערכת בדיקת RNA Quant-iTTMThermo FisherQ32855למדידת ריכוז חומצות גרעין
קיוביט פלואורומטרתרמו פישרQ33216למדידת ריכוז חומצות גרעין
מערכת אלקטרופורזה מסחריתAgilentBioanalyzer 2100למדידת איכות חומצות גרעין
סיקוונסר מהדור הבאIlluminaHiSeq 2500לריצוף ספריות
מערכת אוטומטית לטיפול בנוזליםWafergenApollo 324ליצירה ספריות ריצוף
PrepX PolyA mRNA ערכת בידודWafergen400047לבידוד mRNA מסך ה-RNA
PrepX RNA SEQ עבור ערכת ספריית IlluminaWafergen400039ליצירת ספריות ריצוף ספציפיות לגדיל מ-RNA Barcode Splitter הכולל
https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, הכוללת את פקודתhttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (מותקנת לפני TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (הותקן לפני R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (גרסה חינמית)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
בקבוק מיכל צלוחיות סטריליים נקייה וסטרילית נוזלי Qiagen RLT מכסה gzip

מקורות

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106(2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13(2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תגובת היפוקסיה של שמריםמדידת רמות mRNAניתוח RNA-seqניסוי של סדרת זמניםהיפוקסיה בחנקן גזימיצוי RNA כוללהמרה ל-cDNAיצירת ספרייה מולטיפלקסיתריצוף הדור הבאניתוח DESeq2
מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.