פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג'ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג'ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג'ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.
מבוא
Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג'ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.
השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסוי זה נערך היחידה לחקר הגנטיקה של דגים, אי מעטפת וו הדיג מרכז מחקר, אוניברסיטת אובורן, AL. כל הפרוטוקולים ניסיוני השתמשו בניסוי זה אושרו על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (AU-IACUC) לפני הניסוי היה יזם. רשימה של ציוד ואספקה השתמשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת חומרים. להלן הצעדים ואת הנהלים והכנה microinjection של שפמנון ערוץ אחד-תא עוברי כמופיע באיור1.
1. בחירת מניות והובילו להרהר
- לבחור בריא שפמנון ערוץ המניות שבוחרים זן או קו הגנטית של עניין. ערוץ שפמנון זכרים ונקבות צריך להציג מאפייני המין המשניים טוב.
- בחר גברים שיש להם ראש שרירים רחבה רחבה יותר שאר גופם מפותח pap....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג'ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected.
טיקם 1
רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרים PCR במאגר, משובטים חשף מוטציות ויאסין המושרה בטיקם 1 ג'ין. שיעור מוטציה היה 79% ב- 24 אנשים שנותחו. דוגמאות של מוטציות מומחשים איור 4.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג'ין עם דגים 30 , 42. בפרוטוקול הנוכחי הוכיח כדי להיות מוצלחת וגורם indels של שפמנון ערוץ 1 טיקם ו RBL גנים. הליכים אלה אמין ויעיל להניח את הבסיס ליצירת הגן העתידי הסתרה בתוך הערוץ שפמנון. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג'ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שתל Reproboost | מרכז ביוטכנולוגיה | הורמון משחרר הורמון אנלוגי (LHRHa) לאינדוקציה של ביוץ בנקבות שפמנון תעלה | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | להרגעה של דגי דגים במהלך הזרקת הורמונים והפשטת ביציות. | |
| פנול אדום | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, |
| מיקרוסקופ סטריאו | סטרילי Olympus | 213709 | להדמיית הביציות במהלך מיקרו-הזרקה |
| מיקרו-מזרק | ASI-Applied Scientific Instrumentation | דגם MPPI-3 | לאספקת חומר ההזרקה לעוברים |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | דגם MM33 | לאחיזה ובקרה על תנועת מחט ההזרקה. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | להעמסת תמיסת הזרקה למחטי מיקרו-הזרקה. |
| חולץ מחט אנכי | דיוויד קופף מכשירים | דגם 720 | למשיכת מחטי מיקרו הזרקה |
| חלבון Cas9 | PNA Bio Inc. | CP01 | חלבון Cas9 רקומביננטי מסטרפטוקוקוס פירוגנס. |
| הרחב את מערכת High FidelityPLUS PCR | Roche Diagnostics, ארה"ב | ל-PCR והגברה של תבניות DNA לשימוש בהכנת gRNA | |
| נימי זכוכית בורוסיליקט | פישר סיינטיפיקט | קוטר חיצוני 1 מ"מ (OD), לייצור מחטי מיקרו-הזרקה. | |
| צלחת פטרי | VWR | 25384-302 | להחזקת העוברים במהלך המיקרו-הזרקה. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | קיצור ירקות לציפוי מחבתות הטלה וצלחות פטרי. | |
| הפתרון של הולטפרטר | תוצרת | 59 מ"מ NaCl, 0.67 מ"מ KCl, 2.4 מ"מ NaHCO3, 0.76 מ"מ CaCl2, 1.67 מ"מ MgSO4 כדי לדגור על העוברים המוזרקים עד לבקיעה. | |
| דוקסיציקלין היקלאט USP (מונוהידרט) | אנטיביוטיקה של Letco Medical | 690904 | הוסיפה לתמיסה של הולטפרטר ל-10 חלקים למיליון למניעת זיהומים חיידקיים. |
מקורות
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
