מאמר שיטה

בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

8.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56276

⸱

17 בפברואר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo, המהווה מודל חיה אידיאלית להערכת הגומלין שבין חלקיקי ללבישה, תאים שונים התרופפות אספטי.

תקציר

ללבוש חלקיקים-induced osteolysis הוא הגורם העיקרי התרופפות aseptic בכישלון שכיחיםהחלפת, אבל המנגנון הבסיסי נותר לא ברור. בשל זמן מעקב לצורך זיהוי, מופע ספורדי, זה מאתגר כדי להעריך את osteolysis של ofparticle-induced פתוגנזה במקרים קליניים. ומכאן, מודלים בעלי חיים אופטימלי יש צורך בלימודים. המודל מאתר של osteolysis calvarial נוסדה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי יעיל וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo קודם מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. אחרי שבועיים, העכברים הוקרבו, דגימות calvaria נבצרו; הערכות כמותיים בוצעו על ידי hematoxylin אאוזין מכתים ו טומוגרפיה מיקרו. נקודות החוזק של מודל זה כוללים פשטות ההליך, הערכה כמותית של איבוד מסת העצם, רגע, osteolysis, להשתמש הפוטנציאל הטרנסגניים או נוקאאוט מודלים ופיתוח בעלות נמוכה יחסית. עם זאת, מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את כוח מכני ואת ההשפעות כרונית של חלקיקי התרופפות אספטי. המודל מאתר osteolysis calvarial שנוצר על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo הוא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין ללבוש חלקיקים שונים תאים, למשל, מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם ובין osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

מבוא

התרופפות aseptic הוא הגורם הנפוץ ביותר של שכיחיםהחלפת היפ הכולל (THA) וכישלון שכיחיםהחלפת (TKA) ברך הכולל, אשר דורש ניתוח תיקון1. עם זאת, המנגנון הבסיסי נותר לא ברור2. מעקב ארוך נדרש לזהות חלקיקים-induced osteolysis, אשר מופע נדיר; לכן, זה מאתגר לחקור שלה פתוגנזה במקרים קליניים. לפיכך, מחקרים נוספים התמקדות מנגנונים מורכבים הסלולר ורקמות דורשים שני ניסויים ויוו ב ללבוש מודלים של חלקיקים-induced osteolysis, מבחני במבחנה בתאים הקשורים עצם הומאוסטזיס3. מודל בעלי חיים חוקי חשוב לחשוף את ההשפעות של חלקיקים ללבוש על איבוד העצם, מתן הוכחות נוספות הסלולר מבחני.

מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא שיטה יעילה וחוקית להערכת את האינטראקציות בין חלקיקי תאים שונים התרופפות אספטי. במודל זה, חלקיקי CoCrMo לגרום calvarial osteolysis על ידי גרימת ציטוקינים דלקתיים ב מקרופאגים, הפעלת osteoclasts, מעכבות התפשטות אוסטאובלסט קידום אוסטאובלסט אפופטוזיס.

זה לוקח רק שבועיים להקים מודל זה. Osteolysis יכול להיות דמיינו לכמת על ידי hematoxylin אאוזין (H & E) מכתים, מיקרו שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT)2. בנוסף, מודל זה יש עכבר יחסית בעלות נמוכה, הטרנסגניים ואת נוקאאוט מודלים יכול לשמש למסך מספר רב של תרכובות מינונים שונים3.

הנוהל כדי לבסס והערכה של מודל זה הוא פשוט. ראשית, חלקיקי CoCrMo מתקבל על ידי זרם גבוה-ואקום 3-אלקטרודה, resuspended בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל. לאחר מכן, µL 50 של ההשעיה וכתוצאה מכך הוחל לאמצע calvaria מאתר לאחר ההפרדה של קרום העצם הגולגולת על ידי חד לנתיחה. העכברים הוקרבו אחרי שבועיים ולאחר calvaria דגימות נבצרו; ניתוחים כמותיים בוצעו על ידי H & E מכתים andmicro-טי

מודל osteolysis calvarial מאתר שנבנה על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo היא כלי אידיאלי עבור הערכת את האינטראקציות בין חלקיקים CoCrMo תאים שונים, כגון מקרופאגים, fibroblasts, תאי העצם osteoclasts, ב התרופפות אספטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת נאנג'ינג.

1. CoCrMo חלקיקים הכנה

  1. לקבל CoCrMo חלקיקים באמצעות זרם ישיר של שלוש-אלקטרודה גבוהה-ואקום מפוברק4. המקום CoCrMo סגסוגת בכלי תחת 10-3 הרשות הפלסטינית ואקום, 0.04 ארגון MPa ו מימן 3:2 (v/v), 650 קטודית A הנוכחי.
  2. למדוד על הקוטר של חלקיקים CoCrMo.
    1. להוסיף 1 מ ג של CoCrMo חלקיקים לתוך 1.5 מ"ל אתנול נטול מים.
    2. Resuspend CoCrMo חלקיקים באתנול נטול מים ע י ניעור אולטראסוניות-28 kHz ו- 600 W עבור 5 דקות.
    3. החל טיפה אחת (כ- 20 µL) של ההשעיה המתקבלת על השולחן אובייקטיבית של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). לכידת סדרת תמונות TEM ב 200 מתח ההאצה kV והרזולוציה nm 0.24.
    4. להשתמש בתוכנה המצורפת כדי לחשב את מתכוון קוטר חלקיקים בגודל והפצה ב TEM micrographs.
  3. Decontaminate endotoxins
    1. אוטוקלב 50 גרם של חלקיקים למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi.
    2. לאתר endotoxins על ידי Assay כמותית Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0.25% האיחוד האירופי/mL נחשבת לציון אנדוטוקסין היעדרות)5.
  4. Resuspend החלקיקים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)-ריכוז של 50 מ"ג/מ"ל בתור פתרון מניות6.

2. בניית דגם Calvarial Osteolysis

  1. עזים ומתנגד C57BL/J6 6 בן שבועיים עכברים (שישה עכברים לכל קבוצה) withpentobarbital (50 מ"ג/ק"ג). השתמש במבחן קמצוץ כדי להעריך את רמת ההרדמה. למנוע ייבוש של העיניים עם תמיסת מלח.
  2. הצב עכברים במצב שכיבה. הסר את הפרווה על הגולגולת עם מכונת הגילוח, לחטא את העור באמצעות כדורי צמר גפן רפואי המכיל 75% אתנול.
  3. עבור נקודת לוקליזציה, לזהות שתי נקודות, כולל את האמצע בין שתי העיניים והאוזניים, בהתאמה. לאחר מכן, לקבוע את הגבול בין השניים מעל נקודות, פצעים וחתכים בעור לאורך הקו לעיל עם מספריים (איור 1 א').
  4. הסר קרום העצם הגולגולת calvaria עם האזמל (איור 1B)6.
  5. תפר עור בשני קצותיו בתפר פשוט קטע.
  6. הפיכת קו תפר דרך האמצע של החתך ללא knotting. החזק את שני הקצוות של קו התפר.
  7. הטבע µL 50 CoCrMo חלקיקים השעיה (50 mg/mL, ב- PBS) באמצע מכונות (איור 1C)2.
  8. מקמי תפר האחרון בתוך בתפר פשוט קטע (איור 1D).
  9. לשמור על עכברים עוד 2 שבועות.

3. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על-ידי סריקה מיקרו-CT

  1. להקריב העכברים עם פחמן דו-חמצני. לערוף העכברים במישור האופקי. להסיר את רקמת המוח בתוך העור, פרווה בחוץ. לקצור את מכונות לניסויים נוספים.
  2. לנקות בעדינות את כל הרקמות הרכות על calvaria עם פינצטה. לתקן מכונות שנוקה ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 Immerse את מכונות ב- PBS 24 h לפני סריקת CT-מיקרו.
  3. לנתח את מכונות עכברים ידי מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה של פתרון איזומטרי של מיקרומטר 18 ו רנטגן הגדרות האנרגיה של 45 kV, 550 mA.
  4. לבצע שחזור תלת מימדי של מיקרו-CT נתונים עם התוכנה.
  5. איכותי וניתוח כמותי.
    1. ראשית, בחר את אזור ריבוע מסביב התפר קו האמצע אזור בעל עניין.
    2. שנית, למדוד צפיפות המינרלים של העצם (BMD), עצם נפח/סה כ נפח (BV/טלוויזיה), trabecular (Tb.N), עובי trabecular (Tb.Th), ההפרדה/ריווח trabecular (Tb.Sp) ומספר אחוז נקבוביות סה עם התוכנה שסופקה לסי-מיקרו
    3. שלישית, השווה לשלוש הקבוצות למדידות שונים מאת אנובה בכיוון אחד. עבור הוק לאחר ניתוח השונות, להחיל את שיטת Bonferroni2.

4. הערכה של מודל Calvarial Osteolysis על ידי צביעת המטוקסילין

  1. Decalcify calvaria דגימות ב- 15% אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA)-PBS ב 4 º C. לשנות את הפתרון decalcification כל יום במשך 3 שבועות.
  2. להטביע את הדגימות decalcified פרפין עבור 2 ס"מ על 1 ס"מ x 1 ס מ קוביה, לחתוך אותם למקטעים 2 מיקרומטר באזור של חלקיקים התצהיר.
  3. כתם הסעיפים עם hematoxylin ותיאר אאוזין כאמור7.
  4. Micrographs של pathomorphism הכוללת מידיהם של מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חלקיקי ננו המיוצר ללא צורך במיקור חוץ CoCrMo היו בסביבות 50 ננומטר (שגיאת תקן של 3.56) בקוטר, כפי לכמת על ידי TEM (איור 2). לאחר חשיפה של העכבר מכונות CoCrMo חלקיקים, החיות (n = 6 לכל קבוצה) היו נשמרות רק בעוד שבועיים. בתוך השבועיים, החתך calvarial נרפא לחלוטין, התפר עלול ליפול. כל זיהום מקומי או מאי יתאחה משפיעים על הערכת אובדן עצם. אחרי העכבר הקרבה, נבצרו calvaria דגימות. לאחר מכן, כל הרקמות הרכות נוקה בעדינות, מיקרו-CT נעשה שימוש כדי לכמת את איבוד מסת העצם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנן שתי שיטות עיקריות עבור ללבוש חלקיקים-induced osteolysis בעכברים: המודל אוויר-נרתיק ודגם calvarial osteolysis. במודל כיס אוויר, אוויר-נרתיק subcutaneously שנוצר קודם נוסדה, ואחריו ללבוש חלקיקים מבוא השרשה לתוך רקמת העצם8. הקיר נרתיק מחקה קרום העצם, התרופפות אספטי. עם זאת, עצם ההשתלה הוא nonvascular עם אין פעילות ביולוגית, מה שהופך את זה קשה להעריך ישירה אינטראקציות בין חלקיקים לרקמת העצם. המודל calvarial osteolysis יש כמה יתרונות על פני לכנף אוויר-כיס. ראשית, ללבישה חלקיקים ישירות נחשפים calva...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81572111), קליניים מדע טכנולוגיה פרויקט קרן של מחוז ג'יאנגסו (BL2012002), מדעי למחקר פרוייקט של נאנג'ינג (201402007), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20161385), קרן מיוחדת התאגדות רופא סיני (2015COS0810).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סגסוגת CoCrMo מתותבתWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIחומר גלם להשגת ננו-חלקיקי CoCrMo
מיוצר זרם ישר עם שלוש אלקטרודות בוואקום גבוההמכללה למדע חומרים & הנדסה, האוניברסיטה הטכנולוגית של נאנג'ינגמכונה בעיצוב עצמי
W603
איזון מיקרואנליטישנזן Qun ארוך ציוד מכשירים ושות'. בע"מEX125DZH
שייקר אולטרסאונדשנחאי Yuhao מכשיר מדעי ושות', בע"מYH-200DHלהשעות ננו-חלקיקים CoCrMo
שידור מיקרוסקופ אלקטרוניםFEITecnai G20
SimplePCI תוכנהCompix Inc.גרסת 6.6לחישוב הקוטר הממוצע והתפלגות גודל החלקיקים.
מחבת עיקור ביד גבוההQIULONGYIQIKYQL-100DSלטיהור אנדוטוקסין
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) מבחןצ'ארלס ריברR13025לאיתור אנדוטוקסין 
15 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהTaizhou Suyi MedicalB122
תמיסת מלח חוצצת פוספטבוסטר טכנולוגיה ביולוגיתAR0030ממס של תמיסת מלאי ננו-חלקיקים של CoCrMo
Pentobarbital נתרןסיגמאP3761להרדמת עכברים
תמיסת מלח רגילהSACKLERSR8572EP-15למניעת ייבוש עיני עכברים
75% אתנולנאנג'ינג מגיבC0691560275חיטוי
כדור כותנה רפואיShuitao1278298933חיטוי
מכונת גילוחKemeiKM-3018לגילוח מספריים פרווה
RWD LIFE SCIENCES12005-10לחיתוך עור
תפרRWD LIFE SCIENCEF34001-01לתפירת
עור מחזיק מחטRWD LIFE SCIENCEF33001-01לתפירת עור
מחטRWD LIFE SCIENCER14003-12לתפירת
עור מלקחיים לכליRWD LIFE SCIENCEF22003-09לתפירת
עור אזמלRWD LIFE SCIENCES31010-01לקטיף קלבריה
פינצטהRWD LIFE SCIENCEF12006-10לקטיף קלווריה
100 ומיקרו; L פיפטותEppendorf3120000240להטמיע תרחיף חלקיקים בקלווטיות
100 ומיקרו; קצות פיפטה LAXYGENT-200-Yלהטמעת השעיית חלקיקים בקלבטיות
5 מ"ל מיקרו-צינורותTaizhou Weierkang ציוד רפואי ושות', בע"מW621
4% ParaformaldehydeServicebioG1101קיבוע
מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת SkyScanSkyScan1176
אתילן דיאמין חומצה טטראצטיתServicebioG1105הסרת אבנית
פרפיןServicebio#0001
מכונת חיתוך פרפיןLeicaRM2125RTS
זכוכית שקופיתServicebioG6004
כיסוי זכוכיתServicebio200
ערכת צביעה HEServicebio#1-5HE מכתים
מיקרוסקופ אורNikonE200
זכר בן 6 שבועות C57BL / 6J עכברים מודל מרכז מחקר בעלי חיים של אוניברסיטת נאנג'ינג N000013 100% אתנול נאנג'ינג ריאגנט C0691514023 ממס של ננו-חלקיקי CoCrMo להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה Taizhou Weierkang ציוד רפואי ושות', בע"מ דם

מקורות

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Micro CTH ETEM

מאמרים קשורים