G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Summary

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

Abstract

טכניקות רבות פותחו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של שכפול ה-DNA באמצעות שלב S של מחזור התא. רוב שיטות אלה מכוונת כלפי הבהרה של המיקום והעיתוי של חניכה של שכפול גנום ולא להשלמתו. עם זאת, קריטי כי אנחנו מבינים אזורים בגנום כי הם אחרון להשלמת השכפול, כי אזורים אלה סובלים רמות גבוהות של כרומוזומלית, מוטציה, הם קושרו עם מחלה והזדקנות. כאן נתאר איך הרחבנו את טכניקה בה נעשה שימוש כדי לפקח על שכפול חניכה במקום לזהות אזורים אלה של הגנום אחרונה על שכפול מלאה. גישה זו מבוססת על שילוב של cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה. למרות הדו ח מתמקד היישום של טכניקה זו שמרים, הגישה ניתן להשתמש עם כל התאים ניתן למיין ב cytometer זרימה לפי תוכן ה-DNA.

Introduction

שכפול גנום האיקריוטים מאותחלת באתרים נפרדים מרובים, שנקרא מקורותיה של שכפול, בשכפול אילו מזלגות להמשיך בשני הכיוונים (שבתוך Fragkos. et al., 2015¹). המקורות נבדלים הן שלהם העיתוי ואת היעילות של ירי, מספר טכניקות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות מקור שכפול, להבהיר את הסיבות של וריאציה זו. הפעילות של המקורות הבודדים שניתן להסיק מן רמות של דנ א חד גדילי², המהווה סביב מקורות פעילים, או באמצעות דו-ממדית בג'ל כדי לפקח על שכפול ספציפי ביניים³, אשר שניהם להיות מזוהה עם הגששים רדיואקטיבי. שניהם של טכניקות אלה יוחלו ביתר קלות לפי cerevisiae ס מאשר בתאי יונקים, כי מקורות מוגבלים ספציפית ידועים רצפי לשעבר. עם כניסתו של מיקרו-מערכים, זה הפך אפשרי להעריך מקור ירי באופן גלובלי. זה נעשה לראשונה על ידי תיוג DNA עם איזוטופים כבדים, שחרור תאים בלוק G1 לתוך בינוני המכיל אור האיזוטופים, וניטור ואז היווצרות של כבד-אור היברידית DNA ברחבי הגנום⁴. המבוא של רצפי התפוקה גבוהה מותר הגנום כולו דומה ניטור של מקור פעילות ללא הדרישה של תיוג איזוטרופי יקר. התאים היו ממויין של cytometer הזרימה על פי תוכן ה-DNA ו- DNA שלהם נתון רצף עמוק. בגלל רצף כיסוי בהתאמה מ 1 x 2 x במהלך שלב S, תזמון שכפול יחסית יכול להיות מוערך על ידי השוואת בעומק קריאה של תאים בשלב S לאלה ב- G1 או G2^5,6. שיטות אלה, במיוחד שהוחל שמרים, הובילה הבנה עמוקה יותר של כיצד רצף הדנ א הכרומטין, חלבונים שכפול ה-DNA להסדיר מקור תזמון ויעילות.

הנאמן והעברת מידע גנטי במהלך ההפצה הסלולר מחייב חניכה לא רק מוצלח של שכפול ה-DNA, באישון מוצאו, אלא גם סיומו המוצלח של שכפול, אשר מתרחשת שבו נפגשים מזלגות שכפול. כמו חניכה של שכפול, העיתוי של השלמת השכפול משתנה לאורך הגנום עם אזורים מסוימים שנותרו unreplicated אפילו מאוחר במחזור התא. אזורים כאלה עשויים להיות רחוקים במיוחד ממוצא שכפול active או עשוי להכיל רצפים או מבנים כרומטין הפוגעים דנ א polymerases. מאוחר לבצע שיכפול אזורים עלולים להתבטא כמו אתרים שבירים, אשר משויכות כרומוזומלית וקצבי מוטציה גבוהה יותר, היו מעורבים בסרטן, הזדקנות-^7,-^8,-⁹. עם זאת, למרות החשיבות של השלמה נאותה של שכפול ה-DNA בתחזוקה של יציבות הגנום, ההבנה שלנו של איפה ואיך זה מתרחש יש פיגרה של שכפול חניכה. בעוד גנים בודדים שכפול מאוחר אשר שויכה המחלה נחקרו עם, למשל, qPCR¹⁰, מחקרים הכללית מכוונת שחקרתי את המיקומים, שבבסיס גורם של המנוח מחסירה שכפול. כאן נתאר טכניקה שאנו מתייחסים כאל "G2 seq" שבו אנו משלבים cytometry זרימה עם תפוקה גבוהה רצף לשפוך אור על השלמתו של שכפול גנום של שמרים¹¹. עם שינויים קלים, ניתן להתאים פרוטוקול זה תאים שניתן זרימה ממוין על פי תוכן ה-DNA.

Protocol

1. הכנת התאים עבור Flow Cytometry מיון

1. לחסן 15 מ"ל מבחנות המכילות 8 מ ל כל אחד YEPD מרק כזה התרבויות להגיע צפיפות של 5 x 10⁶ כדי 1.5 x 10⁷ תאים לכל mL לאחר צמיחה לילה (ראה דיון הערה 1).
2. ספין למטה תאי שמרים (1,400 x g, בטמפרטורת החדר או 4 ° C) בשפופרת צנטרפוגה בורג מכסה 15 mL במשך 5 דקות, resuspend תאים 1.5 מ ל-70% אתנול, העברת צינור microfuge מ ל 1.6, נותן זה שב h 1 בטמפרטורת החדר או לפחות 3 h בקרח ( ניתן לאחסן עד אין סוף ב 4 ° C) (ראה דיון פוינט (2)).
3. ספין למטה תאי שמרים microfuge (14,000 x g, 4 ° C) במשך 1 דקה, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (g 14,000 x, 4 ° C) במשך 1 דקה, תשאף תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2 , המכילה 0.25 מ"ג/מ"ל פתרון RNAse h 1 ב 50 מעלות צלזיוס או ללון ב 37 מעלות צלזיוס באמבטיה בלוק או מים חום.
4. הוספת µL 50 proteinase K פתרון (20 מ"ג/מ"ל resuspended ב- 10 מ מ טריס pH 7.5, מ מ 2 CaCl₂, 50% משקל נפח גליצרול) ואת תקופת דגירה של h 1 ב 50 º C.
5. ספין למטה תאים (14,000 x g, 4 ° C), resuspend תאים 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (14,000 x g, 4 ° C), תשאף תגובת שיקוע עם ואקום, resuspend ב 1 מ"ל 1 מיקרומטר חומצת גרעין ירוק זן resuspended ב-50 מ מ סודיום ציטרט , pH 7.2 ו דגירה בחושך לשעה בטמפרטורת החדר, sonicate 2 x עבור 2 s כל (פלט כוח 2 וואט).

2. התא מיון

1. שימוש של סדרן התא, למיין תאים על פי תוכן ה-DNA לשלבים G1 ', ' S ', "G2 מוקדם", ו "G2 מאוחר", איסוף תאים הפלואידי לפחות 1.6 מיליון כל שלב מחזור התא כמו באיור 1 (ראה הדיון בנקודה (3)).
2. להעביר תאים microfuge צינורות ו ספין למטה תאים עבור 20 דקות ב g 14,000 x-4 מעלות צלזיוס ב microfuge האחות תגובת שיקוע עם ואקום (בגדר ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C ללא הגבלת זמן; ראה דיון הצבע (4)).

3. דנ א החילוץ, הכנת רצף ספריות

הערה: השלבים הבאים מבוססים על "פרוטוקול אני" בהפקת דנ א גנומי שמרים קיט (ראה טבלה של חומרים).

1. הוסף µL 120 "מאגר עיכול," מאגר קנייני המאפשרת שמרים אנזים lytic לעכל את דופן התא, µL 5 של האנזים lytic שמרים, resuspend על ידי vortexing של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות.
2. הוסף µL 120 "מאגר פירוק," מאגר קניינית המכיל חומרי ניקוי, ואת מערבולת קשה עבור s 10-20.
3. הוסף כלורופורם µL 250 - לערבב היטב עבור 1 דקות.
4. ספין במהירות מקסימלית microfuge למשך 2 דקות.
5. לטעון את תגובת שיקוע עמודה איגוד ה-DNA ועל צנטריפוגה במהירות מקסימלית microfuge עבור 1 דקות.
6. להוסיף 300 µL "ה-DNA שטיפה מאגר," מאגר קניינית המכיל אתנול, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות מקסימלית microfuge. למחוק את הזרימה, להוסיף 300 µL מאגר ה-DNA לשטוף, לחזור על התהליך לשטוף.
7. להעביר את העמודה ספין צינור microfuge טריים, להוסיף 60 µL של מים (לא טה) - לחכות 1-3 דקות, ואז צנטריפוגה 10 s כדי elute את ה-DNA.
8. למדוד ריכוז על ידי הוספת 5 µL של ה-DNA µL 195 של ריאגנט רגישות גבוהה dsDNA, כי כבר 1:200 מדולל במאגר רגישות גבוהה dsDNA ולאחר מכן פלורסצנטיות מדידה ב fluorometer, באמצעות µL 10 התקנים שסופקו לכיול; מצפה בין 10 עד 50 ng של התשואה הכוללת הדנ א.
9. Sonicate (שיא האירוע כוח 450, פקטור חובה 30%, מחזורים לכל פרץ 200, טיפול זמן 60 s, מפלס המים 6) כדי לשבור את ה-DNA לחלקים bp 250-350.
10. להכין ספריה באמצעות ערכת הכנה דגימת דנ א, רצף זה (לפחות 10 מיליון 50 bp יחיד-end reads) על הכלי רצפי DNA במצב מהיר (ראה הערה לדיון (5)).

4. ניתוח של רצף נתונים והפקת שכפול פרופילים

1. ליישר רצפי הגנום sacCer3 האפייה באמצעות Gsnap¹² (ראה הערה לדיון (6)).
2. לקבוע לכל בסיס זוג לקרוא לעומק באמצעות תוכנת Bedtools' "genomeCoverageBed"¹³.
3. להסיר קוצים artefactual בעומקים קרא, אם מתנה (ראה הערה לדיון (7)).
4. חלקה לקרוא לעומק על ידי כרומוזום באמצעות medians 20 kb הזזה חלון באמצעות הפונקציה "runMean" ב- R חבילת "caTools" (ראה הערה לדיון (8)).
5. מגרש לקרוא לעומק שלב S, G2 מוקדם ו G2 מאוחר כאחוז משוכפל לגמרי במעמקי קריאה (ראה הערה לדיון (9)).

Results

השתמשנו ההליך המתואר לעיל כדי לזהות אתרים שכפול מאוחר ניצני שמרים. בדיקות גישה זו באמצעות אזור שכפול מאוחר ידוע על כרומוזום מלאכותי הוכיח את הטכניקה להיות מדויקות ואמינות. התוצאות שלנו הוכיחו את חשיבות במועד השלמת השכפול הביולוגית על-ידי הצגת מאוחר שכפול אזור בכרומוזום 7, אשר זיהינו כמו שכפול מאוחרת על בסיס התוצאות G2-seq שלנו, אבד יבול בתדירות גבוהה יותר מאשר דומות לשלוט באזור¹¹.

דוגמה ספציפית את התוצאות...

Discussion

טכניקה זו היא חזקה, יחסית ישר קדימה, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות מוקדש הבאות:

(1) אנו ממליצים כי תרבויות לגדול במשך לפחות 12 שעות לפני שהם מגיעים שלב יומן, שכן ההבדלים באה לידי ביטוי מחזור התא הפצות אם תרבויות נקצרים לאחר שהגיעו ה הרצוי צפיפות 4 רק לאחר חיסון. ההנחה שלנו היא כי התפלגות מחזור התא זה הגיע שיווי משקל יציב יחסית מייצג טוב יותר התפלגות שלב יומן "אמיתי" יותר התפלגות זה עדיין בתוך השטף כאשר תרבות רווי הועבר לאחרונה כדי בינוני טרי.

(2) במקום של ספינינג למטה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת DNA גנומי של YeaStar	Genesee Scientific	11-323
1 µ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	מושעה ב 50 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2
50 מ"מ נתרן ציטראט, תמיסת pH 7.2
RNase (0.25 מ"ג / מ"ל)	Sigma	R6513	0.25 מ"ג / מ"ל RNaseA מושעה ב 50 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.2, מרתיחים תמיסת RNase למשך 10 דקות לפני השימוש הראשון בלבד, ומכאן ואילך יש לאחסן ב -20 מעלות;
תמיסת פרוטאינאז K (20 מ"ג / מ"ל)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	מושעה ב -10 מ"מ Tris, pH 7.5, 2 מ"מ CaCl2, 50% גליצרול, יש לאחסן בטמפרטורה של -20° C
דגם 50 Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Zymo-spin III עמודות	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 פלואורומטר	ThermoFisher	Q33216
Covaris דגם LE220 ממוקד-אולטראסוניקטור	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT ערכת הכנה לדוגמא	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 מכשיר	Illumina	SY– 401– 2501
gsnap יישור תוכנה	תוכנת קוד פתוח / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap