הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

17.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

22 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

במאמר זה

סיכום

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

תקציר

המיטוכונדריה הם תחנות כוח של תאים, לייצר תאי אנרגיה בצורת ATP. תפקוד מיטוכונדריאלי תורמת להזדקנות ביולוגית ועוד מגוון רחב של מחלות כולל מחלות מטבוליות, תסמונות הזדקנות מוקדמת של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD). שמירה על הבריאות מיטוכונדריאלי תלוי מיטוכונדריאלי להן את סיווג יעיל של המיטוכונדריה לקוי דרך mitophagy. שיטות נסיוניות כדי לזהות במדויק autophagy/mitophagy, בעיקר במודלים של בעלי חיים, יש כבר מאתגר לפתח. התקדמות אחרונים לקראת להבנת המנגנון המולקולרי של mitophagy אפשרה הפיתוח של הרומן mitophagy זיהוי טכניקות. כאן, אנו מציגים מספר טכניקות רב-תכליתי לעקוב אחר mitophagy בתאים אנושיים, Caenorhabditis elegans (למשל, רוזלה וללחצים DCT-1 / איג-1), ועכברים (mt-Keima). שילוב של שיטות זיהוי אלה mitophagy, כולל הערכה קרוס-מינים, לשפר את הדיוק של מדידות mitophagy, להוביל הבנה טובה יותר של התפקיד של mitophagy על בריאות ומחלה.

מבוא

Mitophagy חיוני לצורך תחזוקה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מצטלבים תא מספר מסלולי איתות והם organelles תת סלולרית אוניברסלית אחראי על ייצור האנרגיה התאית, מטבוליזם התא, ו סידן הומאוסטזיס1,2,3, 4. המיטוכונדריה כל הזמן לחוות אתגרים ממקורות אנדוגני, אקסוגני, כגון מינים חמצן תגובתי (ROS), חשיפה לרעלים מיטוכונדריאלי, בהתאמה, אשר יובילו הדור של המיטוכונדריה "גיל" ולא מתפקד. הצטברות של המיטוכונדריה פגום מקטין את יעילות ייצור ATP תוך הגדלת הכמות של ROS מזיקים, נקשר מחלות הקשורות כגון מחלות מטבוליות, לספירה, ו- PD1,5,6 . כדי למנוע תפקוד הסלולר המיטוכונדריה המושרה, תאים צורך במיוחד מזהים פגום המיטוכונדריה ולהסיר אותם ביעילות באמצעות תהליך הסלולר כינה autophagy מיטוכונדריאלי (mitophagy). כך מבהירים את החשיבות של mitophagy בריאות, מחלות ממחישה את הצורך בשיטות מדויק ויעיל לגילוי mitophagy גם במבחנה וגם בתוך vivo.

Mitophagy הוא תהליך מרובה-צעד מעורבים רבים חלבונים, חלבונים מתחמי5,7,8. בקצרה, מיטוכונדריון פגום הוא קודם מזוהה, נבלע על ידי phagophore כפול-membraned, אשר יכולות לנבוע מן קרום פלזמה, רשתית תוך-פלזמית, הגולגי, גרעין, או מיטוכונדריון עצמה9,10. Phagophore כדורית לתרמיל, בסופו של דבר חותמות המיטוכונדריה בפנים, המהוות את autophagosome מיטוכונדריאלי (mitophagosome). Mitophagosome בין אז עם ליזוזום עבור השפלה, ויוצרים autolysosome בו מיטוכונדריון פגום הוא מפורק וממוחזרים7,8. חלבונים autophagic הגדולות גם מעורב mitophagy כוללים: Autophagy קשורים 7 (ATG7), Beclin1 (ייזום), חלבון Microtubule-Associated 1A/1B-אור שרשרת 3 (LC3-II) (איג-1 ב- s elegan ג) ו- p62 (מרכיבי phagophore), ו הממברנה lysosomal-הקשורים גליקופרוטאין 2 (LAMP2)6,7. בנוסף, ישנם מספר חלבונים חיוניים ייחודיים ל- mitophagy, כולל PTEN-induced בשם קינאז 1 (ורוד-1), Parkin1, נקודה גרעיני חלבון 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 אינטראקציה חלבון 3 כמו (ניקס/BNIP3L) (DCT-1 C. elegans), בין היתר5,6,11.

שיטה נפוצה כדי לזהות שינויים ברמות של autophagy היא על ידי היחס של LC3-II/LC3-אני או LC3-II/אקטין. עם זאת, שיטה זו היא לא ספציפית, כמו עלייה יחס זה עשוי לשקף חניכה מוגבר או של פיוז'ן לקוי של mitophagosome ליזוזום12. שיטה נוספת היא להעריך את colocalization בין סמן autophagy (למשל, LC3) חלבון מיטוכונדריאלי (למשל, Translocase של החיצוני מיטוכונדריאלי ממברנה 20 (TOMM20, אשר יכול להיות מושפל על-ידי proteasomes)). עם זאת, זה יכול רק להצביע על שינויים ברמות mitophagy הכולל, מבדילה את step(s)-חסימה אשר מתרחשת. זה יכול להיות מובהר באמצעות מעכבי lysosomal (למשל, E64d + Pepstatin A, הנקרא EP) במקביל כדי לגרום להצטברות של mitophagosomes. ההבדל בין מספר mitophagosomes בנקודת ההתחלה ואת המספר של mitophagosomes לאחר הטיפול עם EP יכול לציין mitophagy. מגבלות אלה עוררו את התפתחות טכניקות הרומן mitophagy. לאור הרלוונטיות הגוברת של mitophagy במגוון רחב של מחלות האדם, אנו מציגים מספר טכניקות לזיהוי mitophagy חזקים אשר עשוי להיות שימושי עבור חוקרים. לכסות גם במבחנה וגם ויוו טכניקות ואנו ממליצים על שילוב של מספר טכניקות כדי לוודא שינויים של mitophagy.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים (עכברים זכר ונקבה) היו נולדתי וגדלתי במתקן מוסמכים בעלי חיים, בהתאם, אישור ראש הוועדה NIH חיה אכפת לי להשתמש. המתת חסד שיטות חייב להיות תואם לכל תקנות הלאומית ומוסדיים.

1. זיהוי של Mitophagy בתאי אדם

  1. זיהוי של mitophagy באמצעות פלסמיד mt-Keima
    הערה: החלבון Keima, דבוקה אות היעד המיטוכונדריה, פשוטה כמו mt-Keima, הוכיח שימושי לזיהוי mitophagy ' ויוו . mt-Keima הוא רציומטרי רגיש pH חלבון פלורסנט שמתועדות ירוק קרינה פלואורסצנטית (עירור 458 ננומטר) בתנאים בסיסיים או נייטרלי, פלואורסצנטי אדום (עירור 561 ננומטר) בתנאים חומציים. המיטוכונדריה בריא משגשגים בתנאים בסיסיים או נייטרלי (pH 7-8), יצוינו על-ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק כאשר transfected עם mt-Keima. כאשר המיטוכונדריה עוברים mitophagy הפתיל עם lysosomes חומצי, ה-pH יורדת ל 4.5 ולהציג המיטוכונדריה המכיל mt-Keima פלואורסצנטי אדום6,13,14. חשוב לציין, mt-Keima עמיד lysosomal פרוטאזות, המאפשר הערכה של mitophagy על פני תקופות ארוכות יותר. להלן הפרוטוקול מיועד עבור לוחות 6-. טוב.
    1. יום 1: השתמש תאים אנושיים הראשית (למשל, fibroblasts) או מונצחים תאים אנושיים (למשל, תאים תאים הלה או U2OS). זרע כ 0.3-1 × 106 תאים/ובכן (תלוי קצב גדילת התא כדי לאפשר תאים להגיע confluency 70% ביום הבא) לתוך צלחת 6-. טוב. לשמור על התאים במדיום התרבות התא המלא (בינוני בינוני נשר שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% FBS ו- 1% פתרון של פניצילין-סטרפטומיצין מעורב), דגירה ב חממה תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס (20% או2, 5% CO2 ). להוסיף 1 מ"ל תא שלם בינוני תרבות/טוב צלחת 6-. טוב.
      הערה: טיפולים ביטוי/נוקאאוט או סמים ג'ין יכול להיעשות על זה בשלב6.
    2. יום 2: מערבבים mt-Keima פלסמיד דנ א6 ו- DNA תרביות תאים ריאגנט (התערובת עבור אחד טוב של צלחת 6-טוב).
      1. לדלל µL 15 של ריאגנט תרביות תאים DNA עם 150 µL ללא סרום בינוני לפי הפרוטוקול של היצרן.
      2. לדלל µg 2-5 של פלסמיד mt Keima DNA עם 150 µL בינוני ללא סרום.
      3. להוסיף מדולל mt-Keima פלסמיד מדולל DNA תרביות תאים ריאגנט, מערבולת 10 s, דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: אופטימיזציה של תנאים תקנים DNA עשוי להיות נחוץ תלוי בגודל צלחת (ראה הפרוטוקולים היצרנים לפרטים).
      4. להוסיף תערובת ריאגנט DNA/תקנים dropwise לתאים ולאחר מכן ללחוץ את הצלחות בעדינות במשך 5-10 s עד הפתרון הוא מעורב לחלוטין.
    3. יום 3: לשנות את התקשורת על-ידי החלפת המדיום המכיל ריאגנט DNA תרביות תאים תא שלם טרי תרבות בינוני (1 מ"ל/טוב).
    4. יום 4: תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית6. השתמש בשני ערוצים הדמיה: הערוץ הירוק (nm עירור 458, פליטה 570-695 ננומטר) לדמיין המיטוכונדריה נורמלי, הערוץ האדום (nm עירור 561, פליטה 570-695 ננומטר) כדי להמחיש את המיטוכונדריה אשר עוברים mitophagy. באופן אקראי תמונה האזורים 20 40 x הגדלה כדי לכסות את סך של 100-200 תאים בכל טוב.
    5. לבצע ניתוח נתונים. חישוב מדד"mitophagy" (אחוז של המיטוכונדריה שעברו mitophagy), באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי לכמת את כמות קרינה פלואורסצנטית בשני הערוצים אדום וירוק: לקחת את היחס שבין פלואורסצנטי אדום כדי אדום + ירוק פלורסצנטיות, ו להכפיל ב- 1006.
      הערה: חלופות תקנים כוללות שימוש mt-Keima stably הביע הלה תא שורות14. מאז הלה תאים שאינם מבטאים פרקין, פרקין חייב stably להתבטא ללמוד mitophagy תלויי-פרקין בסדרה זו התא.
  2. זיהוי של mitophagy באמצעות את colocalization בין ציטוכרום C אוקסידאז יחידת משנה II (COXII) LAMP2
    הערה: COXII הוא חלבון הממברנה הפנימית מקודד גנום מיטוכונדריאלי. המדד' mitophagy' שווה את היחס בין COXII colocalized עם LAMP2 המבוטא באחוזים מהסכום הכולל של COXII.
    1. זרע הלה תאים (או תאים אחרים עניין שהוזכר בשלב 1.1.1) בשקופית 4-ובכן קאמרית (1-5 × 104 תאים 1 מ"ל תא שלם בינוני תרבות/היטב) בתא תרבות חממה ב 37 מעלות צלזיוס (20% או2, 5% CO2) בן לילה.
    2. הוסף µL 3.0 של 10 מ מ קרבוניל ציאניד (trifluoromethoxy) - 4 - phenylhydrazone (FCCP) ואת דגירה בחממה תא תרבות (שלב 1.2.1) במשך 3 שעות.
      הערה: סמים אחרים המשפיעים על mitophagy ניתן להשתמש.
    3. להסיר את המדיום תרבות באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, לשטוף את התאים פעמיים 1 מ"ל/טוב של קור (0-4 ° C) 1 x PBS. תן את הפתרון לשבת במשך 10-30 s לפני בכביסה הבאה. לאחר מכן להוסיף 0.5 mL 3.7% paraformaldehyde (PFA) ב- 1 x PBS מכל קידוח, תקופת דגירה של 10 דקות על קרח כדי לתקן את התאים.
      התראה: PFA הוא רעלן. פועלים בשכונה fume כאשר באמצעות מחברים.
    4. למחוק את הפתרון מחברים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, לשטוף את התאים פעמיים עם 1 קר X PBS (1 מ"ל/טוב; תן פתרון לשבת 10 s לפני בכביסה הבאה), ו permeabilize את התאים עם 1 מ"ל/טוב של 0.25% סבון (ב 1 x PBS) למשך 10 דקות על קרח.
    5. לבטל את המאגר permeabilizing, לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם 1 קר-PBS וביטול (לתת את הפתרון לשבת 10 s בין שוטף). לחסום את התאים עם 1 מ"ל/טוב של 5% FBS ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C. מכסים התאים כדי למנוע אובדן לחות.
    6. להתכונן 0.5 mL/טוב של פתרון נוגדן מעורב עם נוגדנים COXII (עכבר, דילול 1:250) ונוגדן LAMP2 (ארנב, דילול 1:20-1:50) ב- PBS 1 x עם 5% FBS, חנות על הקרח 0.5-1 h.
    7. להוציא את השקופית 4-ובכן קאמרית מן החדר קר וזורקים את הפתרון חסימה עם פיפטה 1 מ"ל. לשטוף בעדינות את התאים פעמיים 1 מ"ל/טוב של 1 קר-PBS וביטול (לתת את הפתרון לשבת 10 s בין שוטף), ואז להוסיף 0.5 mL/טוב בפתרון מעורבים נוגדנים. דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ב מטרף במהירות נמוכה.
    8. למחוק פתרון נוגדן ראשון באמצעות פיפטה של 1 מ"ל בעדינות לשטוף את התאים היטב ל- PBS קר x 1/3 פעמים עם 1 מ"ל, למחוק. לתת הפתרון יושב במשך 10 s לפני בכביסה הבאה. להוסיף 1 mL/טוב של נוגדנים משניים פלורסנט (למשל, ארנבת נגד עז עם אורך גל 568 nm של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) עבור LAMP2; ועכבר נגד עז עם אורך גל 488 ננומטר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עבור COXII) ב- 1:250 דילול עם 5% FBS ב- 1 x PBS. מכסה את השקופית 4-ובכן קאמרית עם רדיד אלומיניום, דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ב מטרף במהירות נמוכה.
    9. למחוק את הפתרון הנוגדן השני עם פיפטה 1 מ"ל. לשטוף בעדינות את התאים היטב ל- PBS קר x 1/6 פעמים עם 1 מ"ל. תן את הפתרון לשבת במשך 1 דקה לפני בכביסה הבאה.
    10. הר התאים עם µL 50/טוב של הרכבה antifade בינוני עם דאפי, וכן להוסיף שער גולשת.
    11. תמונה התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם 66 x הגדלה ו טבילה שמן (אריח סורק / פסיפס עשוי לשמש כדי להגדיל את מספר תאים עם תמונה על-ידי התוכנה). השתמש באותן ההגדרות כמו ערוץ חשיפה זמן, רווח דיגיטלי, אופסט דיגיטלי וכו לאורך כל תהליכי כל הדמיה (ראה הנחיות התוכנה לקבלת פרטים)15.
    12. שימוש colocalization ניתוח תוכנה לנתח באופן כמותי לפחות 20 תמונות אקראיות של 100 תאים15. השתמש בפונקציה "עקומות סגור" כדי לבחור את כל התאים הבודדים. להשוות פירסון מקדם colocalization של ה-GFP כדי RFP, משוקלל או unweighted, כדי לקבוע רמות mitophagy בתאים שנותחה. לשמור על ערכים על הכוונת אופקיים ואנכיים של תוכנת ניתוח colocalization במהלך ניתוח. כדי להגדיר במדויק את הכוונת, להכין שני זוגות נוספים של תאים, תווית אחת COXII, את LAMP2 אחרים. לאחר מכן, הגדר הכוונת ישירות מעל פיזור הפיקסלים של כל ערוץ15 (ראה הוראות התוכנה לקבלת פרטים).
  3. תפוקה גבוהה הדמיה מדידה להקרנה mitophagy
    הערה: ביצוע תפוקה גבוהה המסכים של תרכובות בתדר mitophagy או עיכוב mitophagy מספריות מתחם גדול הוא תובעני מבחינה טכנית. טכניקת דימות מבוסס על colocalization של המיטוכונדריה עם autophagosomes הוא חלופה פשטנית יותר, אך רגישה מאוד עבור mitophagy הקרנת16.
    1. יום 1: זרע תאים (למשל, האדם fibroblasts ראשי ב- 5,000 תאים/100 mL תא תרבות המדיה /. ובכן) של צלחת 96-ובכן (ראה שלב 1.1.1).
    2. יום 2: מתייחסים לתאים מהיום השני עם FCCP או תרכובות אחרות עניין זמן דגירה המיועד (ראה שלב 1.2.2).
    3. בצע את השלבים 1.2.2-1.2.9 באמצעות נוגדנים העיקרי עבור COXII (עכבר, דילול 1:250 עם 5% FBS ב- PBS 1 x) ו LC3B (ארנב, בטחונות-דילול 1:200 עם 5% FBS ב- PBS 1 x). לחלופין, עשוי לשמש נוגדנים העיקרי עבור COXII ו- LAMP2.
    4. תמונה של תאים באמצעות קורא פלורסנט16. איסוף תמונות בשדות המונחות ועם מינימום 500 תאים/באר.
    5. ניתוח נתונים באמצעות פרוטוקול מנתח אישית16תאים.

2. זיהוי של Mitophagy C . elegans

הערה: תולעים נימיות C. elegans מספק פלטפורמה assay mitophagy ברמה organismal. שני זנים יכול לשמש כדי לפקח על mitophagy: (1) המיטוכונדריה במיקוד רוזלה (mtRosella) או mitophagy (2) קולטן DCT-1 התמזגו עם GFP יחד עם סמן autophagosomal איג-1 התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed) sp. Discosoma5, 17.

  1. Mitophagy ניטור באמצעות רוזלה ביוסנסור
    הערה: רוזלה היא ביוסנסור מולקולרית המשלבת DsRed pH-רגישות דבוקה variant GFP pH-רגיש. החיישן רוזלה מנצל pH ההבדלים את ליזוזום חומצי (pH ~ 4.5) לבין תאים סלולריים אחרים. ביוסנסור הזה שימש לעקוב בהצלחה mitophagy האפייה ואת מספר שורות בתרבית של תאים, כגון הלה, HEK293 ו- HCT11618,19. אנחנו הותאם לכתב פלורסנט כפול צדדי, ועורר הטרנסגניים C. elegans נמטודות לבטא, ממוקדות המיטוכונדריה רוזלה (mtRosella) בתאי השריר בגוף-קיר. אינדוקציה Mitophagy מציינים יחס GFP/DsRed מופחת של זריחה mtRosella.
    1. יום 1: לבחור L4 הזחלים של תולעים לבטא, ממוקדות המיטוכונדריה רוזלה (mtRosella) בתאי השריר קיר הגוף לצלחת מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM) עם e. coli (OP50) באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה5. במקום 10-20 תולעים/צלחת על צלחות 3.5 ס"מ לפחות שלושה. דגירה של נמטודות בטמפרטורה רגילה של 20 ° C5.
      הערה: ראה חומר עזר עבור האנטומיה תולעת, כולל זיהוי של L4 הזחלים20, ועל הדרך כדי לבחור בו נעשה שימוש כדי להעביר תולעים ממיקום אחד אחר21.
    2. יום 5: לסנכרן נמטודות על-ידי בחירת 15-20 L4 הטרנסגניים הזחלים, להעביר אותם לתוך רעננה OP50 נזרע NGM צלחת. להשתמש לפחות חמישה לוחות לכל תנאי הניסוי.
    3. יום 7: להכין לוחות רכב לסמים שמשפיעים על mitophagy של עניין או פקדים חיובי.
      1. להרוג חיידקים e. coli (OP50) זרועה על-ידי חשיפת הצלחות NGM למשך 15 דקות עם 222 µW/cm2 (העוצמה) של אור UV על מנת להבטיח כי תרכובות בתדר mitophagy הם לא מטבוליזם על ידי חיידקים. חייבת להיות חשופה צלחות עם J/m 2,0002.
        הערה: שניות של חשיפה צריך = 2000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. להוסיף compound(s) עניין העליון של לוחות NGM הזריעה. להוסיף כמות שווה של מתחם רכב (הממס להשתמש כדי להמיס את המתחם, כמו דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) לוחיות הרישוי של הרכב כפקד שלילי. עבור שליטה חיובית של אינדוקציה mitophagy, toxicant מיטוכונדריאלי, שימש paraquat (ריכוז סופי 8 מ מ). להוסיף פתרון המכיל µL 10 מניות paraquat שמונה מ' עם µL 190 של ddH2O בראש צלחת אגר עבור קבוצת הטיפול. עבור קבוצת הרכב, להוסיף פתרון המכיל 10 µL של דימתיל סולפוקסיד עם µL 190 של ddH2O על ראש הלוח אגר.
        הערה: הפתרון paraquat עבודה נשמרות במשך חודש-4 מעלות צלזיוס.
      3. מערבולת בעדינות את לוחיות הרישוי עד הסם או רכב ציפוי פני השטח כולו. לאפשר את הצלחות לייבש בשלמותם סגור בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה לפני העברת את התולעים.
        הערה: צלחות סמים ניתן גם להכין על-ידי הוספת תרופות NGM נוזלי לפני זה עפור.
    4. יום 7: העברת 10-20 בן יום-2 חיות הטרנסגניים למבוגרים מוכן בשלב 2.1.2 ללוחות המכילה גם paraquat, compound(s) מעניינים, או רכב (דימתיל סולפוקסיד). דגירה החיות הטרנסגניים ב 20 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    5. יום 9: להכין רפידות agarose 2% (ראה חומר משלים). לאחר מכן להוסיף אחד droplet (10 µL) של 20 מ מ levamisole ב M9 לכל משטח. לשתק את החיות הטרנסגניים עבור הדמיה, על-ידי הצבתם הירידה M9-levamisole. הנח בעדינות coverslip על גבי.
    6. לכידת יחיד חיות הטרנסגניים בעזרת מצלמה מחוברת במיקרוסקופ epifluorescence. לרכוש תמונות פלורסנט של נמטודות לכל הטרנסגניים לבטא mtRosella בתאי השריר הגוף-קיר-X 10 ההגדלה5. שמור את התמונות שנאספו.
    7. תהליך תמונות שנרכשו עם התוכנה ImageJ. לנתח את תאי שריר לגוף החומה ממוקם בראש של התולעת להימנע autofluorescence ברקמת המעי. למדוד את הפיקסלים הממוצע בעוצמה ערך וסיכום האזור עבור כל תמונה פלורסנט רק על אזור הראש של כל בעל חיים. כדי לנתח שטח ספציפי של עניין:
      1. תחת התפריט הנפתח 'תמונה', 'צבע' כדי להמיר תמונות, בחר 'פצל ערוצים'.
      2. לנצל את הכלי 'בחירה חופשי' כדי ללכוד האזור עם פלורסנט.
      3. בחר בפקודה 'מדידה' תחת התפריט הנפתח 'נתח' ולבצע ניתוח עוצמת פיקסל.
      4. יש אפשרות לנרמל את עוצמת פיקסל על-ידי חלוקת העוצמה באזור סה כ נותחו. על נורמליזציה, לחשב את ה-GFP אל DsRed יחס22.
    8. השתמש ניתוח סטטיסטי לתוכנה גם התנהגות התלמיד t-test (השוואה בין שתי הקבוצות) או ANOVA (השוואה בין קבוצות מרובות) לשם ניתוח סטטיסטי עם 0.05 < p כמו משמעותית5,17 .
  2. הערכת mitophagy באמצעות לוקליזציה שיתוף בין DCT-1 ואיג-1
    הערה: DCT-1 היא חלבון ממברנלי מיטוכונדריאלי החיצוני שפועל קולטן mitophagy בתגובה ללחץ תנאים, הדומה שלה orthologues בשם BNIP3, ניקס/BNIP3L יונקים5. לפיכך, חניכה mitophagy מוערך על ידי לוקליזציה שיתוף בין DCT-1 mitophagy לקולטן של autophagosomal חלבון ממברנלי איג-1 (homolog של יונקים LC3).
    1. יום 1: פיק L4 הזחלים של חיות הטרנסגניים לבטא DCT-1::GFP ו- DsRed::LGG-1 קיר הגוף שרירים תאים5 על גבי OP50 נזרע NGM צלחת. מקום 5-10 תולעים/3.5 ס מ צלחת, והשתמש לפחות שלושה לוחות. דגירה של נמטודות ב 20 º C.
      הערה: transgenes נמצאים על פלסמידים נפרדים, הם אינם משולבים הגנום. לאסוף נמטודות נושא סמנים contransformation rol-6(su1006) ו- pmyo-2 GFP. רק הטרנסגניים תולעים עם שני הסמנים contransformation אקספרס DCT-1::GFP ו- DsRed::LGG-1 בתאי השריר בגוף-קיר.
    2. בצע את השלבים של 2.1.2-2.1.5.
    3. תמונת קיר-גוף יחיד תאי שריר בעזרת מצלמה מחוברת של מיקרוסקופ קונפוקלי5,23. הגבולות של תאי שריר בגוף-קיר שלם ויוכל לקחת z-מחסנית תמונות מתחת לגיל 63 x הגדלה. ניתן להשתמש גם הגדלה גבוהה יותר.
    4. פתח, לעיבוד תמונות רכשה עם התוכנה קונפוקלי. חניכה של mitophagy מזוהה באמצעות שיתוף לוקליזציה של הקולטן mitophagy (DCT-1::GFP) עד לסימון autophagosomal (DsRed::LGG-1). באופן ידני למדוד לוקליזציה ושיתוף האירועים כל ערימה של קיר הגוף שרירים תא5. זה חיוני כדי לשמור את ההגדרות המיקרוסקופ והמצלמה כל (עדשה, זכוכית מגדלת, מסננים, זמן החשיפה, רזולוציה, לייזר בעוצמה, רווח, וכו ') עקבי לאורך כל הניסויים. יש לציין את כל ההגדרות.
    5. השתמש ניתוח סטטיסטי לתוכנה גם התנהגות התלמיד t-test (השוואה בין שתי הקבוצות) או ANOVA (השוואה בין קבוצות מרובות) לשם ניתוח סטטיסטי עם 0.05 < p כמו משמעותית5,17 . השוואות דו-כיווני להשתמש הסטודנט t-מבחן (0.05 <p הוא נחשב משמעותי). להשוואות מרובות משתמשים ניתוח השונות של גורם יחיד (ANOVA), תוקנו על ידי הבדיקה Bonferroni פוסט הוק . אנו ממליצים על ניתוח לפחות 50-70 בעלי חיים או תאי שריר בגוף-הקיר 30-50 עבור כל תנאי הניסוי. חזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.

3. זיהוי של Mitophagy בעכברים

הערה: שיטות קודמות כדי לזהות mitophagy בעכברים היו מסורבלים, רגישות, קשה לכמת. דגם העכבר הטרנסגניים לבטא את הטופס מיטוכונדריאלי במיקוד של הכתב פלורסנט Keima (mt-Keima) יכול עכשיו להיות מנוצל כדי להעריך את רמות של mitophagy במגוון רחב של מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological.

  1. המתת חסד עכברים באמצעות פרוטוקול שאושר על-ידי אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש14.
  2. אבטח את העכבר (הגחון בצד למעלה) פלטפורמת עבודה באמצעות סיכות בגפיים. לעשות חתך בבטן התחתונה בעזרת מלקחיים ומספריים למיקרו לחשוף את הכבד24. לחתוך חתיכה של הכבד (למשל, חתיכה של האונה הימנית-1 × 1 × 1 ס מ) בעזרת מלקחיים ומספריים למיקרו.
    הערה: זיהוי של mitophagy בעכברים הוא מורכב ודורש ידע על העכבר אנטומיה ו טיפול מאוד מיומנת העכבר העכבר ניתוח. פרוטוקול זה מספק צעדים בסיסיים, מפתח בשיטה זו, ויש שיטה מפורטת יותר זמין24.
  3. במקום המדגם כבד על פלטת מתכת על הקרח להתקרר במהירות את הרקמה. להמשיך את רקמת לוחית המתכת קר ולא לעבד במהירות האפשרית. השתמש בצורה אופטימלית, בתוך h 1 של ניתוח.
  4. הרם המדגם בכבד באמצעות מלקחיים מעוקל, לשטוף עם 5 מ של PBS קר כקרח 1 x.
  5. העברת הכבד צלחת פטרי (Ø 100 מ מ) על קרח באמצעות כפית סוף מרית.
  6. חותכים דגימת כבד בעבודת יד 0.5-1 מ מ עבה למקטעים באמצעות להבי קצה חד.
  7. להעביר בזהירות הסעיפים רקמות צלחת תחתית זכוכית באמצעות מלקחיים למיקרו.
  8. בזהירות לקבוע בסעיף כבד עם מלקחיים לשטח בתחתית.
  9. מכסים את הכבד הפרוס עם 3-5 טיפות של PBS קר 1 x.
    הערה: דאפי מכתים מומלץ לזהות את האזור של עניין מסוים רקמות (למשל, מוח)24. לאימות ושיתוף לוקליזציה של האות הר אדום-Keima עם ליזוזום, צבעי lysosomal, כגון לתוספי מפל כחול lysosensor, יכולים להיות בשימוש24.
  10. תמונה הסעיפים רקמות תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות שני רציפים excitations24. להגדיר שני ערוצים הדמיה: "ירוק" ערוץ mt-Keima (nm עירור 458, טווח nm פליטה 570-695) ו mt "אדום"-Keima (nm עירור 561, טווח nm פליטה 570-695). לשמור על הגדרות הדמיה בין תנאי הניסוי. עבור הדמיה יעיל יותר, לנתח את שתי חיות בבת אחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי של Mitophagy בתאי אדם:

הלה תאים אנושיים באמצעות ההליך המובאת כאן, היו transfected עם פלסמיד mt-Keima. תאים בריאים הפגינו רשת מיטוכונדריאלי מאורגן היטב (ה-GFP, 488 ננומטר) עם כמה מקרים של mitophagy (RFP, 561 ננומטר). עם זאת, תאים מיוחדים עם uncoupler מיטוכונדריאלי FCCP (30 מיקרומטר עבור 3 h) באורה עלייה משמעותית שכיחות mitophagy (איור 1 א'). Mitophagy נמדדה גם באמצעות לוקליזציה שיתוף בין LAMP2 לבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מדידה מדויקת של mitophagy הוא תובעני מבחינה טכנית. . הנה, הוצגו מספר טכניקות חזקים המאפשרים הן זיהוי איכותי של mitophagy, כימות של רמות mitophagy בדגמי ניסויי מעבדה הנפוץ ביותר.

לרכוש לנתונים ניתן לשכפול, עיצוב ניסיוני עם חזרה ביולוגית לפחות שלושה נחוצה. מעורב ניסויים וניתוח כל החוקרים חייב להיות עיוור כדי לזהויות ניסיוני. יתר על כן, הדמיה שדות באופן אקראי להיבחר במהלך ייבוא תמונות. עבור תרבית תאים ו- C. elegans מחקרים, לפחות שלושה חזרה ביולוגי יש לבצעו. ללימודים העכבר mt-Keima, מומלץ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המעבדה האטום של בוהר הסדרים CRADA עם ChromaDex ועם GlaxoSmithKline.

תודות

אנו מודים המייאוואקי אטסשי ד ר ו ד ר ריצ'רד ג' Youle על שיתוף את פלסמיד mt-Keima, mt-Keima משולב הלה תאים. אנו מודים עדי שי א Shamanna, ד ר דבורה ל' Croteau על קריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH (VAB), המכון הלאומי להזדקנות, כמו גם של 2014-2015 ו- 2016-2017 ניא אינטרה-מעבדה הענק (EFF, VAB). EFF נתמכה על ידי HELSE RHF סור-אוסט (פרוייקט לא: 2017056), מועצת המחקר של נורבגיה (פרוייקט לא: 262175).

תרומות מחבר:

EFF עיצב את כתב היד והכינו את הטיוטה; KP, מניטובה, EMF, RDS, JSK, שק, יד הנדיב ו אד כתב חלקים שונים של הנייר; NT, JP, ח נ ו VAB תוקן כתב היד וסיפק מומחיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
mt-Keimamouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציה DNAThermofisher#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)Thermofisher#31985062מדיום נטול סרום
mtKemia פלסמיד: pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
נוגדן COXII (עכבר)abcam#ab110258
נוגדן LAMP2 (ארנב)NOVUS
אנטי-ארנב עז עם אורך גל 568 ננומטר של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 צבע
עז-אנטי-עכבר עם אורך גל 488 ננומטר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)Thermofisher#Z25002צבע Alexa Fluor 488
להאריך זהב אנטי-דהייה עם DAPIInvitrogen#P36931
צלחת 6 בארותSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
שקופית תא 4 בארותTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96-well plateThermofisher#152038
LC3B נוגדן ארנבNOVUS#NB100-2220
נוגדן DNAProgen Biotechnik#anti-DNA עכבר חד שבטי, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306מדיום הרכבה נגד דהייה עם מנתח DAPI
IN Cell (קורא פלואורסצנטי)GE Healthcare Life Sciences#IN מנתח תאים 2200
Eclipse TE-2000e מיקרוסקופ קונפוקליNikon#TE-2000e
תוכנת קולוקליזציהVolocity#Volocity 6.3תוכנת Zeiss ZEN 2012 חלופית
IN תוכנת חוקר תאיםGE Healthcare מדעי החיים#28408974
מדיום תרבית תאיםThermofisher#DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermofisher#15140122
סרום בקר עובריSigma-Aldrich#12003C-1000ML
חממת תרמו-פישר#Thermo Forma 3110 CO2 חממה
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיZeiss ZeissAxio Imager Z2
מצלמהאולימפוסאולימפוס DP71
מיקרוסקופ קונפוקליZeissZeiss Axio Observer Z1
תוכנה קונפוקליתZeissZEN 2012
תוכנת ניתוח תמונהImage Jניתוח קולוקליזציה וכוhttps://imagej.nih.gov/ij/
תוכנת ניתוח סטטיסטיGraphPad Software Inc., סן דייגו, ארה"בחומר חבילת תוכנה של GraphPad Prism
לבחירת תולעתSurepure Chemetals#4655הבחירה עשויה מ-30 מד 90% פלטינה 10% חוט אירידיום
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]חקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektariosשמירה על בעלי חיים טרנסגניים ב-20 מעלות; C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]חקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosellaחקירה מהותית ל-Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFPחקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed:: חקירת חומר LGG-1לפתרון Tavernarakis Nektarios
Paraquatראה נתונים משלימים להכנת
מאגר M9ראה נתונים משלימים להכנת
מאגר M9-levamisoleראה נתונים משלימים להכנה
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית וכיסוייםפישר סיינטיפיק#B9992000
מלקחיים כירורגייםSTERIS בריאות בעלי חיים19 חתיכות חבילת עיקור כלבים מספריים כירורגיות חסכוניות
STERIS בריאות בעלי חיים19 חתיכות חבילת עיקור כלבים כלכלה
1x PBSThermofisher#AM9625יש לדלל 10x PBS ל-1x PBS באמצעות שייקר ddH2O
פישר סיינטיפיק#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP שולחני אורביטלי פלטפורמה קטנה באוויר הפתוח שייקר חבילת שייקר פלטפורמה באוויר הפתוח
כרית אגרוז 2%ראה נתונים משלימים להכנה
להבי Vibrosliceמכשירים דיוק עולמיים#BLADES-2לוחית מתכת להב קצה אחד
MSC#788039880.012 אינץ' עובי x 6 אינץ' רוחב x 12 אינץ' ארוך, 430 גיליון נירוסטה
Triton X-100חומר ניקוי
Methyl viologen dichloride hydrateSigma-Aldrich#856177חממת פרקווט
לנמטודותחממת AQUALYTICלשמירה על 20 מעלות; C
ניתוח סטריאומיקרוסקופאולימפוסSMZ645
מיקרוסקופ קונפוקליZeissAxioObserver Z1לנמטודות (שלב 2)
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיZeissAxioImager Z2לנמטודות (שלב 2)
קרוסלינקר UVVilber LourmatBIO-LINK – מקור אור BLX-E365UV; 356 ננומטר
#CD107b מצופה מים

מקורות

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mito KeimaC elegansHeLaParaquatUncoupler FCCPLAMP2 COXII
במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.