Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
המיטוכונדריה הם תחנות כוח של תאים, לייצר תאי אנרגיה בצורת ATP. תפקוד מיטוכונדריאלי תורמת להזדקנות ביולוגית ועוד מגוון רחב של מחלות כולל מחלות מטבוליות, תסמונות הזדקנות מוקדמת של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD). שמירה על הבריאות מיטוכונדריאלי תלוי מיטוכונדריאלי להן את סיווג יעיל של המיטוכונדריה לקוי דרך mitophagy. שיטות נסיוניות כדי לזהות במדויק autophagy/mitophagy, בעיקר במודלים של בעלי חיים, יש כבר מאתגר לפתח. התקדמות אחרונים לקראת להבנת המנגנון המולקולרי של mitophagy אפשרה הפיתוח של הרומן mitophagy זיהוי טכניקות. כאן, אנו מציגים מספר טכניקות רב-תכליתי לעקוב אחר mitophagy בתאים אנושיים, Caenorhabditis elegans (למשל, רוזלה וללחצים DCT-1 / איג-1), ועכברים (mt-Keima). שילוב של שיטות זיהוי אלה mitophagy, כולל הערכה קרוס-מינים, לשפר את הדיוק של מדידות mitophagy, להוביל הבנה טובה יותר של התפקיד של mitophagy על בריאות ומחלה.
מבוא
Mitophagy חיוני לצורך תחזוקה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מצטלבים תא מספר מסלולי איתות והם organelles תת סלולרית אוניברסלית אחראי על ייצור האנרגיה התאית, מטבוליזם התא, ו סידן הומאוסטזיס1,2,3, 4. המיטוכונדריה כל הזמן לחוות אתגרים ממקורות אנדוגני, אקסוגני, כגון מינים חמצן תגובתי (ROS), חשיפה לרעלים מיטוכונדריאלי, בהתאמה, אשר יובילו הדור של המיטוכונדריה "גיל" ולא מתפקד. הצטברות של המיטוכונדריה פגום מקטין את יעילות ייצור ATP תוך הגדלת הכמות של ROS מזיקים, נקשר מחלות הקשורות כגון מחלות מטבוליות, לספירה, ו- PD1,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים (עכברים זכר ונקבה) היו נולדתי וגדלתי במתקן מוסמכים בעלי חיים, בהתאם, אישור ראש הוועדה NIH חיה אכפת לי להשתמש. המתת חסד שיטות חייב להיות תואם לכל תקנות הלאומית ומוסדיים.
1. זיהוי של Mitophagy בתאי אדם
- זיהוי של mitophagy באמצעות פלסמיד mt-Keima
הערה: החלבון Keima, דבוקה אות היעד המיטוכונדריה, פשוטה כמו mt-Keima, הוכיח שימושי לזיהוי mitophagy ' ויוו . mt-Keima הוא רציומטרי רגיש pH חלבון פלורסנט שמתועדות ירוק קרינה פלואורסצנטית (עירור 458 ננומטר) בתנאים בסיסיים או נייטרלי, פלואורסצנטי אדום (עירור 561 ננומטר) בתנאים חומציים. המיטוכונדריה בריא משגשגים בתנאים בסיסיים או נייטרלי (pH 7-8), יצוינו על-י....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זיהוי של Mitophagy בתאי אדם:
הלה תאים אנושיים באמצעות ההליך המובאת כאן, היו transfected עם פלסמיד mt-Keima. תאים בריאים הפגינו רשת מיטוכונדריאלי מאורגן היטב (ה-GFP, 488 ננומטר) עם כמה מקרים של mitophagy (RFP, 561 ננומטר). עם זאת, תאים מיוחדים עם uncoupler מיטוכונדריאלי FCCP (30 מיקרומטר עבור 3 h) באורה עלייה משמעותית שכיחות mitophagy (איור 1 א'). Mitophagy נמדדה גם באמצעות לוקליזציה שיתוף בין LAMP2 לבי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מדידה מדויקת של mitophagy הוא תובעני מבחינה טכנית. . הנה, הוצגו מספר טכניקות חזקים המאפשרים הן זיהוי איכותי של mitophagy, כימות של רמות mitophagy בדגמי ניסויי מעבדה הנפוץ ביותר.
לרכוש לנתונים ניתן לשכפול, עיצוב ניסיוני עם חזרה ביולוגית לפחות שלושה נחוצה. מעורב ניסויים וניתוח כל החוקרים חייב להיות עיוור כדי לזהויות ניסיוני. יתר על כן, הדמיה שדות באופן אקראי להיבחר במהלך ייבוא תמונות. עבור תרבית תאים ו- C. elegans מחקרים, לפחות שלושה חזרה ביולוגי יש לבצעו. ללימודים העכבר mt-Keima, מומלץ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המעבדה האטום של בוהר הסדרים CRADA עם ChromaDex ועם GlaxoSmithKline.
תודות
אנו מודים המייאוואקי אטסשי ד ר ו ד ר ריצ'רד ג' Youle על שיתוף את פלסמיד mt-Keima, mt-Keima משולב הלה תאים. אנו מודים עדי שי א Shamanna, ד ר דבורה ל' Croteau על קריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH (VAB), המכון הלאומי להזדקנות, כמו גם של 2014-2015 ו- 2016-2017 ניא אינטרה-מעבדה הענק (EFF, VAB). EFF נתמכה על ידי HELSE RHF סור-אוסט (פרוייקט לא: 2017056), מועצת המחקר של נורבגיה (פרוייקט לא: 262175).
תרומות מחבר:
EFF עיצב את כתב היד והכינו את הטיוטה; KP, מניטובה, EMF, RDS, JSK, שק, יד הנדיב ו אד כתב חלקים שונים של הנייר; NT, JP, ח נ ו VAB תוקן כתב היד וסיפק מומחיות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| mt-Keima | mouse Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציה DNA | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | מדיום נטול סרום |
| mtKemia פלסמיד: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| נוגדן COXII (עכבר) | abcam | #ab110258 | |
| נוגדן LAMP2 (ארנב) | NOVUS | ||
| אנטי-ארנב עז עם אורך גל 568 ננומטר של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 צבע |
| עז-אנטי-עכבר עם אורך גל 488 ננומטר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | צבע Alexa Fluor 488 |
| להאריך זהב אנטי-דהייה עם DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| צלחת 6 בארות | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| שקופית תא 4 בארות | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B נוגדן ארנב | NOVUS | #NB100-2220 | |
| נוגדן DNA | Progen Biotechnik | #anti-DNA עכבר חד שבטי, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | מדיום הרכבה נגד דהייה עם מנתח DAPI |
| IN Cell (קורא פלואורסצנטי) | GE Healthcare Life Sciences | #IN מנתח תאים 2200 | |
| Eclipse TE-2000e מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | #TE-2000e | |
| תוכנת קולוקליזציה | Volocity | #Volocity 6.3 | תוכנת Zeiss ZEN 2012 חלופית |
| IN תוכנת חוקר תאים | GE Healthcare מדעי החיים | #28408974 | |
| מדיום תרבית תאים | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| סרום בקר עוברי | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| חממת תרמו-פישר | #Thermo Forma 3110 CO2 חממה | ||
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי | Zeiss Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| מצלמה | אולימפוס | אולימפוס DP71 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| תוכנה קונפוקלית | Zeiss | ZEN 2012 | |
| תוכנת ניתוח תמונה | Image J | ניתוח קולוקליזציה וכו | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| תוכנת ניתוח סטטיסטי | GraphPad Software Inc., סן דייגו, ארה"ב | חומר חבילת תוכנה של GraphPad Prism | |
| לבחירת תולעת | Surepure Chemetals | #4655 | הבחירה עשויה מ-30 מד 90% פלטינה 10% חוט אירידיום |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | חקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektarios | שמירה על בעלי חיים טרנסגניים ב-20 מעלות; C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | חקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | חקירה מהותית ל-Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | חקירה חומרית ל-Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed:: חקירת חומר LGG-1 | לפתרון Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat | ראה נתונים משלימים להכנת | ||
| מאגר M9 | ראה נתונים משלימים להכנת | ||
| מאגר M9-levamisole | ראה נתונים משלימים להכנה | ||
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית וכיסויים | פישר סיינטיפיק | #B9992000 | |
| מלקחיים כירורגיים | STERIS בריאות בעלי חיים | 19 חתיכות חבילת עיקור כלבים מספריים כירורגיות חסכוניות | |
| STERIS בריאות בעלי חיים | 19 חתיכות חבילת עיקור כלבים כלכלה | ||
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | יש לדלל 10x PBS ל-1x PBS באמצעות שייקר ddH2O |
| פישר סיינטיפיק | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP שולחני אורביטלי פלטפורמה קטנה באוויר הפתוח שייקר חבילת שייקר פלטפורמה באוויר הפתוח | |
| כרית אגרוז 2% | ראה נתונים משלימים להכנה | ||
| להבי Vibroslice | מכשירים דיוק עולמיים | #BLADES-2 | לוחית מתכת להב קצה אחד |
| MSC | #78803988 | 0.012 אינץ' עובי x 6 אינץ' רוחב x 12 אינץ' ארוך, 430 גיליון נירוסטה | |
| Triton X-100 | חומר ניקוי | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | חממת פרקווט |
| לנמטודות | חממת AQUALYTIC | לשמירה על 20 מעלות; C | |
| ניתוח סטריאומיקרוסקופ | אולימפוס | SMZ645 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | AxioObserver Z1 | לנמטודות (שלב 2) |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי | Zeiss | AxioImager Z2 | לנמטודות (שלב 2) |
| קרוסלינקר UV | Vilber Lourmat | BIO-LINK – מקור אור BLX-E365 | UV; 356 ננומטר |
מקורות
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
