מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

סיכום

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

תקציר

שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג'ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג'ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג'ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ' ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מבוא

הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג'ין-הפרעה יש נעזרו ג'ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג'ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות^1,2 על עיצוב האתר של ג'ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum³ ו- Synechocystis sp. PCC6803⁴ . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג'ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ' ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.

היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1^סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג'ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5' אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5' אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז'ן. בשלב השני (2^nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1^סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2^nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.

בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח^5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס' mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג'ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.

פרוטוקול

1. פריימר עיצוב

1. להתכונן תחל 2-שלב פיוז ' ן PCR ואימות של שיבוש גנטי.
   הערה: טבלה 1 מציגה את רצפי פריימר בשימוש בפרוטוקול זה. איור 1 מראה של איור סכמטי של שיטת ה-PCR 2-שלב פיוז ' ן המשמש ליצירת Δ ס mutans gtfC.
   1. תחל עיצוב עבור התחליף של אזור היעד הגנום עם ג'ין (spc ^r) ההתנגדות spectinomycin ⁷. פרוטוקול זה מחליף את כל האזור קידוד של הגן gtfC spc ^r.
   2. לכלול 15 בסיסים משלימים בקצוות העליונים והתחתונים של spc ^r ב- 5 ' מחוזות היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה. באופן דומה, כולל 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזורים איגוף במעלה הזרם של gtfC, בקצה העליון של האזורים איגוף במורד הזרם של gtfC-5 ' מחוזות spc ^r-קדימה ואת spc ^r -הפוך תחל בהתאמה ( איור 1 א').
      הערה: רצפים של היפוך למעלה, למטה-קדימה, spc ^r - קדימה, ו- spc ^r - הפוך תחל נקבעים באופן אוטומטי בהתאם אתר מסמכי התאגדות של הבונה הפרעה של.
   3. לעצב את תחל למעלה-קדימה, למטה-הפוך מעגנת > 1-kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של הגן gtfC, בהתאמה. להגדיר את טמפרטורת ההיתוך (T _m) של מעלה-קדימה, למטה-הפוך תחל בהתאם טמפרטורת ההיתוך של היפוך למעלה, למטה-קדימה תחל בהתאמה ( איור 1 א').
      הערה: להפנות הנוסחה הבאה כדי לקבוע T _m: T _m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, היכן * N מייצג את מספר נוקלאוטידים תחל עם הזהות המצוינת (A, T, C או G)-
   4. עיצוב תחל מקוננים (N_up-קדימה ואת היפוך N_up) עבור 2 ^nd PCR ( איור 1B).
      הערה: למרות הזוג תחל החיצוני (up-קדימה, למטה-אחורי) עשויה לשמש תחל 2 ^nd PCR, תחל מקוננים (N_up-קדימה ו- N_up-אחורי) עוצבו ב פרוטוקול זה. תחל מקוננים נדרשים לעתים קרובות עבור 2 ^nd PCR, כמפורט נציג תוצאות.
   5. תחל עיצוב ספציפי עבור spc ^r. תחל משמשים המושבה PCR למסך להפרעה gtfC.
   הפרעה
   6. תחל עיצוב עבור האימות של gtfC.
      הערה: המוצרים PCR מוגבר באמצעות תחל אלה שנושקות לגבול בין gtfC או spc ^r במעלה או במורד הזרם איגוף מחוזות gtfC. ערכות פריימר ' gtfC up-קדימה ואת gtfC up-הפוך ', ' gtfC למטה-קדימה, gtfC למטה-הפוך ' ספציפיות עבור gtfC, ו ' gtfC up-קדימה ו- spc ^r 2 -הפוך ', ' spc ^r 2-קדימה ו- gtfC למטה-הפוך ' ספציפיות עבור spc ^r.

2. הפקת דנ א גנומי מ ס mutans

1. המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר המוח אינפוזיה (BHI) הלב. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
3. צנטריפוגה התרבות תא החיידק למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
4. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב ג' × 2,000 Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS.
5. לחלץ דנ א גנומי התליה באמצעות של חרוז-מכות-בסיס גנומי DNA ערכת חילוץ בהתאם להוראות היצרן-
   1. העברת ההשעיה מדגם 2.0-mL שפופרת המכילה חרוזי זכוכית (כלול בערכה). להוסיף µL 750 בפתרון פירוק (כלול בערכה) התליה תא.
   2. קאפ בחוזקה ולמקם הצינורות באופן סימטרי בעל שפופרת של מנגנון השיבוש חרוז-מכות. תהליך במהירות המרבית עבור 5 דקות. צנטריפוגה הוכה חרוז הדוגמאות עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' × להעביר את תגובת שיקוע המסנן ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב × 7,000 g .
   3. µL 1,200 להוסיף איגוד ה-DNA של מאגר (כלול בערכה) פילטרט. העברת µL 800 של התערובת לעמודה ספין (כלול בערכה) 2.0-mL אוסף שפופרת, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×
   4. להשליך הזרימה דרך, להוסיף 200 µL מאגר קדם כביסה (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את המטריצה עמודה, ו צנטריפוגה עבור 1 דקות בג' 10,000 × להשליך הזרימה דרך, להוסיף 500 µL מאגר לשטוף (כלול בערכה) ספין עמודה כדי לשטוף את המטריצה עמודה ולאחר צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 10,000 ג' ×
   5. למקם את העמודה ספין לתוך צינור 1.5-mL microcentrifuge ולהוסיף 100 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה) אל המטריקס עמודה.
   6. צנטריפוגה ב-30 s ב × 10,000 g כדי elute את הדנ א הגנומי. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס ₂₈₀ /A ₂₆₀ A גדול מ- 1.8.

3. PCR-הגברה

1. בצע 1 ^סנט PCR באמצעות הגנום s WT המוטנטים לפני שהם י ס והגן סינתטי spc ^r כתבניות PCR (ראה טבלה 1). להגביר את האזור איגוף במעלה הזרם של הגן gtfC, אזור איגוף במורד הזרם של הגן gtfC, הגן spc ^r באמצעות שלושה זוגות תחל שתוארו לעיל ( איור 1 א'), לפי בטבלה 2 ו- 3 בטבלה.
   הערה: תחל PCR, ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
2. Fractionate כל מוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1% ו בלו הלהקות המתאימים שימוש בחותך הלהקה ג'ל.
3. לטהר כל מוצר ה-DNA מוגבר של ג'לים שימוש של ספין עמודה, סיליקה ג'ל המבוסס על רפידה ערכת חילוץ.
   1. העברת הפרוסות ג'ל כדי microcentrifuge נקי צינור ומערבבים עם 500 µL של איגוד מאגר (כלול בערכה). דגירה התערובת ב 55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד הפרוסות ג'ל התפרקה לחלוטין.
   2. למקם את העמודה ספין (כלול בערכה) לתוך צינור אוסף (כלול בערכה) לטעון את הדגימה אל העמודה ספין, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g. למחוק את הזרימה דרך, להוסיף את µL 600 מאגר לשטוף (כלול בערכה) העמודה ספין כדי לשטוף את הקרום סיליקה, צנטריפוגה ב-30 s ב 11,000 × g.
   3. להיפטר זרימה דרך של צנטריפוגה למשך 2 דקות ב × 11,000 g כדי לייבש את הקרום סיליקה.
   4. במקום העמודה ספין לתוך צינור microcentrifuge 1.5-mL החדש, להוסיף 50 µL מאגר • תנאי (כלול בערכה), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק
   5. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 11,000 × g כדי elute את ה-DNA מוגבר. מעריכים את ריכוז הדנ א ואת טוהר על ידי מדידת את ספיגת ב-260 nm ו 280 nmusing ספקטרופוטומטרים לאשר כי היחס ₂₈₀ /A ₂₆₀ A גדול מ- 1.8.
4. לבצע 2 ^nd PCR של 2-שלב פיוז ' ן PCR באמצעות שלושה שברי כ equimolar כתבניות PCR, לפי בטבלה 2 < /stרונג > ו לטבלה 3.
   הערה: קטעים אלה היו מוגבר, משולבים באמצעות תחל מקוננים על ' N_up-קדימה ואת היפוך N_down ' או את תחל החיצוני ' up-קדימה, למטה-הפוך ' ( איור 1B). PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
5. לטעון עשירית של תערובת התגובה PCR (5 µL) ב- 0.8% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים ( איור 1C).
6. להתרכז המוצר PCR הסופי שנותרו על ידי משקעים אתנול ללא טיהור.
   1. µL להוסיף 55 של אולטרה טהור מים לתערובת PCR הנותרים כדי לכוונן את העוצמה הכוללת כדי 100 µL.Add נפח עשירית של 3 מ' סודיום אצטט (10 µL), pH 5.2, ואחריו 2.5 בנפחים של 100% אתנול (250 µL). לערבב ומקפיאים למשך 30 דקות ב-80 מעלות צלזיוס
   2. צנטריפוגה כעשרים דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, בדוק בגדר בתחתית של התחתית, ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב × 15,000 g ב- 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. מילה נהדרת בגדר כ 30 דקות, להמיס עם 10 µL של מים אולטרא טהורים.

4. הכנה תא המוסמכת וטרנספורמציה תא

1. המניות פס ס המוטנטים לפני שהם י s UA159 על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך מ ל מרק BHI. דגירה התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
3. להעביר 2 מ"ל של התרבות s S. המוטנטים לפני שהם י 50 מ ל מרק BHI, תקופת דגירה של 6-8 h ב- 37 ° C עד צפיפות אופטית על 600 nm (OD ₆₀₀) של 0.2-0.4 בתנאים אנאירוביים.
4. Centrifuge התאים למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מ של קרח מים ואחריו 40 מיליליטר 10% גליצרול.
   הערה: חומרים שיורית משפיע אלקטרופורציה עוקבות.
5. וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות עם פיפטה פסטר כמו דבקותה של בגדר תא גליצרול 10% מצטמצם. Resuspend תאי 1 מ"ל של גליצרול 10% טרי, לוותר על 50 µL של ההשעיה לתוך כל שפופרת microcentrifuge 1.5-mL ו לאחסן ב- 80 ° C עד לפני שימוש.
6. מערבבים את aliquot 50 µL של תאים המוסמכת קפואים עם 5 µL של הבונה הפרעה שתוארו לעיל בסעיף 3. להוסיף את התערובת אלקטרופורציה וואקום (עם מרחק 0.2 ס מ בין האלקטרודות). להעסיק את מצב Staphylococcus aureus (1.8 kV, 600 Ω, 10 µF, הדופק 1) על מנגנוני אלקטרופורציה כדי electroporate.
7. להשעות את התאים µL 500 BHI מרק מיד לאחר אלקטרופורציה ולהוסיף 50 µL של ההשעיה ללוחות BHI-אגר המכילות spectinomycin.
   הערה: הדגירה תוספת הזמן לאחר אלקטרופורציה אינה נדרשת. עם זאת, דגירה עבור h 1-2 לאחר אלקטרופורציה עשוי לשפר את יעילות טרנספורמציה.
8. תקופת דגירה לצלחת של 2-6 ימים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
   הערה: S. mutans Δ gtfB נבנה כמתואר לעיל. כל האזור קידוד של הגן gtfB מוחלף עם אריתרומיצין ההתנגדות ג'ין ⁸ ב Δ mutans ס gtfB. כל זן mutans ס הוא תרבותי ב- BHI מרק ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.

5. אימות של שיבוש גנטי ואחסון

1. לאסוף מושבות אקראי ואת לחסן אותם לתוך התערובת PCR לבצע המושבה PCR לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה. PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
2. לטעון את תערובת התגובה PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר את ה-spc ^r-להקת ה-DNA ספציפיים.
3. לבחור את המושבה חיובי באמצעות קיסם סטיריליים ותאים תת-תרבות ב 10 מ"ל של spectinomycin-המכילים BHI ציר 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
4. לאמת את הדור של ס' mutans Δ gtfC.
   1. לחלק התליה תא באותה מידה. לחלץ דנ א גנומי מתאי שתוארו לעיל (צעדים 2.3. כדי 2.5.5.). לבצע PCR עם ה-DNA גנומי כתבנית PCR, באמצעות תחל עבור האימות של שיבוש gtfC (טבלה 1) לפי טבלה 2 ו- 3 בטבלה.
      הערה: ה-PCR תחל ריאגנטים, הגברה מחזורים מסוכמות בטבלה 1 בטבלה 2, טבלה 3, בהתאמה.
   2. לטעון את התערובת PCR על 2% agarose ג'ל ולהשוות את גודל הלהקה מוגבר עם גודל הלהקה צפויה לאשר את הדור של אמפליקון המתאים .
   3. Centrifuge התליה תא הנותרות למשך 15 דקות ב 2,000 × g ב- 4 מעלות צלזיוס Resuspend בגדר תא ב 5 מ של PBS.
   4. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב × 2,000 g ב-4 ° C. Resuspend התא הצניפה ב- 1.5 מ ל מרק BHI המכיל 25% גליצרול ולאחסן ב-80 מעלות קור-20 ° C.

6. ניתוח פנוטיפי

1. פס כל המוטנטים לפני שהם י S. s זן על צלחת אגר BHI. דגירה את הצלחת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
2. שמושבה בודדת באמצעות קיסם סטיריליים ולקלוט לחסן אותו לתוך 2 מ ל מרק BHI עם או בלי אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
3. לחסן µL 20 של ההשעיה תרבות לילה לתוך 2 מ ל מרק BHI המכיל 1% או 5% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה במבחנה זכוכית; התרבות התאים עם מבחנה במצב נוטה ללון ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים.
4. מערבולת הכוס מבחנות 10 s ו decant תרבות המתלים. רחץ צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% Coomassie מבריק כחול (CBB) כתם biofilms על הקיר צינור ולאחר מכן תקופת דגירה של דק 1
5. Decant הפתרון מוכתמים, רוחצים צינורות הבדיקה שלוש פעמים עם מים מזוקקים, ומייבשים את המבחנות.
6. להעריך את צפיפות הצבע והן הארכת CBB צבעונית-biofilm באופן חזותי כדי לקבוע את יכולת ניתוח פנוטיפי להיוות biofilm.

תוצאות

איור 2 מציג את הגודל של כל מוצר מ- 1^סנט PCR, כפי שנצפה על הג'ל 1% agarose, היה הסכם טוב עם חזה בגודל של 1 kb. איור 3 מראה ג'ל אלקטרופורזה ניתוח של המוצרים של 2^nd PCR. איור 4 מראה המושבות ס mutans טרנספורמציה עם הבונה שיבושים, ניתוח ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR המושבה. Amplicons של כל המושבות היו של גודל החזוי. איור 5 מצ...

דיון

בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1^סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.

מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spc^r-קדימה, ו- spc^r-הפוך) בפרוטוקול זה באופן אוטומטי נקבעו בהתבסס על האתר של התאגדות של הבונה שיבוש. כל פריימר כולל 15 בסיסים משלימים לסוף התבנית PCR 2^nd -האזור 5'. אתר איגוד יותר מאפשר ייצור יעיל יותר של הבו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Streptococus mutans	זן מלאי במעבדה.		זן מסוג בר (זן UA159)
ערכת מיצוי DNA גנומי	Zymo Research	D6005
מנגנון שיבוש מכות חרוזים	Taitec	GM-01
גנים סינתטיים	Eurofins Genomics	גן עמיד לספקטינומיצין ואריתרומיצין	בהזמנה אישית
תרמיים	Astec	PC-708
PCR	Eurofins Genomics	הזמנה אישית	של 35 בסיסים באורך
DNA פולימראז	Takara	R045A	ג'ל DNA פולימראז בנאמנות גבוהה
	Nippon Genetics	FG-91202	מיצוי DNA מג'ל אגרוז
חותך להקת ג'ל	Nippon Genetics	FG-830
ספקטרופוטומטר	בקמן קולטר	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Electroporation cuvette	Bio-rad	1652086	מרווח של 0.2 ס"מ
Anaeropack	מיצובישי גז כימי	A-03	מערכת תרבית אנאירובית
מרק עירוי לב מוח	Becton, Dickinson	237500	מדיה לתרבית חיידקים
Spectinomycin	Wako	195-11531	אנטיביוטיקה
אריתרומיצין	וואקו	057-07151	אנטיביוטיקה
סוכרוז	וואקו	196-00015	לפיתוח ביופילם
CBB R-250	וואקו	031-17922	לצביעה ביופילם