Method Article

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

DOI:

10.3791/56322

⸱

December 30th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם לויקוציטים בוגרת לשרת תפקיד פיזיולוגי קריטיים כמו phagocytes מקצועי המסוגל סליקה מגוון של חלקיקים. בדרך כלל, BMDMs שנאסרת על מערכת העצבים המרכזית (CNS), אך בעקבות פציעה, הם בקלות יכולים לחדור. פעם אחת בתוך הרקמה הפצועים CNS, BMDMs הם סוג התא הראשי אחראי האישור של פציעה, נגזר הסלולר פסולת, כולל כמויות גדולות של פסולת המיאלין עשיר השומנים. ההשלכות neuropathological של BMDM חדירה של המיאלין פסולת phagocytosis בתוך מערכת העצבים הן מורכבות לא הבין היטב. הפרוטוקולים המתוארים כאן, לאפשר לחקר ישירה במבחנה BMDMs בהקשר של פגיעה CNS. אנחנו מכסים בידוד BMDM מאתר ואת התרבות המיאלין פסולת הכנה, מבחני להעריך BMDM מיאלין פסולת phagocytosis. טכניקות אלה לתוצאות לכימות חזקים ללא צורך משמעותי ציוד מיוחד או חומרים, עדיין ניתן בקלות להתאים אישית לצרכים של החוקרים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם חוליה חשובה בין מערכות החיסון מולדים, מסתגלת. כמו אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), הם יכולים לתקשר עם לימפוציטים באמצעות מצגת אנטיגן שני ולשחרר ציטוקין1,2,3. עם זאת, כמו המקצועי phagocytes, התפקיד העיקרי שלהם היא לנקות פתוגנים, תאים בגילאי ופסולת הסלולר1,4. בעקבות פגיעה בחוט השדרה (מדע), כמויות ניכרות של פסולת המיאלין נוצר מתוך oligodendrocytes גוסס, סוג התא אחראי על מערכת העצבים המרכזית האקסון myelination5. אנחנו ואחרים הראו כי סיווג של המיאלין פסולת הוא בראש וב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המתוארות כאן, בסעיף 2 אושרו על ידי פלורידה המדינה אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC), מנחים שנקבעו עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, 8th מהדורה מדריך . כל זה בשימוש פרוטוקול זה בעלי הבית במתקן חיות מעבדה ייעודית עד השימוש. אין ויוו ניסוי היה לפני שבוצעו כדי להקריב. מספרים בעלי חיים היו מבוססים על הצורך ניסיוני באמצעות תא הממוצע ואוספים המיאלין כמדריך על מנת למזער את השימוש.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הדור של מח עצם-derived מקרופאגים (BMDMs) (סעיף 1), הכנת מיאלין במוח, נגזר fluorescently שכותרתו פסולת (סעיף 2), נוהל כללי ניתוח phagocytosis פסולת מיאלין (סעיף 3), ו ההליך ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול של BMDMs עם CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אמור להניב ברור הפנמה (איור 2). בעוד זמן האינטראקציה 3 שעות מספיקה עבור BMDMs phagocytose מספיק פסולת המיאלין נוסף לגילוי במורד הזרם חזקים, הצטברות תאיים יכול להיות שנצפו עם מעט ככל 1 שעה של אינטראקציה. עם זאת, יש שרידים המיאלין עדיין ייתכן בהווה על פני התא לאחר הרחצה. זה יכול להיות בגלל כביסה לא מספיק, או לא להיות מלא הפנימו כבר בשלבים המוקדמים של phagocytosis חלקיקים.

בעוד BMDMs במהירות יכול להפנים את המיאלין פסולת, ע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליכים המתוארים כאן לנצל טרי מבודד פסולת המיאלין גולמי של CNS והן מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי. כדי לצמצם את ההוצאה על בעלי חיים, אנו ממליצים כי שני המוח, תאי מח העצם להיות שנקטפו כל עכבר בזמנו של הקרבה. שני החוקרים עובדים ביחד יכולים להכין שני חומרים בו זמנית. לחלופין, ניתן לאחסן את המוח ב- 80 ° C ב- PBS בתוספת אנטיביוטיקה לפני המיאלין פסולת בידוד. זה היה הניסיון שלנו זה המוח יכול להישמר בתנאים אלו במשך עד חודש ללא אובדן ניכר של המיאלין פסולת דור פוטנציאל.

CFSE משמש להוספת תווית המיאלין .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין גילויים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות גלן סנגר-הודג'סון, מומחה בתקשורת במכללה לרפואה של בריה"מ לשעבר על כל העבודה הפקות וידאו, עריכה, ואת הקריינות.

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM100474 ו- R01GM072611).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGE Healthcare Life SciencesSH30243.01גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין, נתרן פירובט
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןCorning30-002-CI100X
Solution New Born Calf Serum (NCS)Rocky Mountain BiologicsNBS-BBT-5XMארצות הברית
מוצא NCTC שיבוט 929 [תא L, L-929, נגזרת של זן L] ATCCCCL-1L929 קו תאים של הכנת מדיה מותנית
24 בארות צלחות תרבית תאיםVWR10062-896 
צלחת תרבית תאיםGreiner Bio-One639960פוליסטירין, ערכת ריבוי תאים CFSE 145/20 מ"מ
Thermo FisherC34570DMSO לקונסטרוקציה סיפקה
פלואורו-ג'ל עם Tris Buffer מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית17985-11
שמן אדום Oסיגמא אולדריץ'O0625
<חזק>ציוד
<חזק>חומרים<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
צינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר326823קיר דק, פוליפרופילן, 38.5 מ"ל, 25 x 89 מ"מ
SW 32 Ti רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר369650SW 32 Ti רוטור, דלי מתנדנד, טיטניום
כף יד הומוגנייזר סיבוביפישר סיינס08-451-71

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
  3. Cavaillon, J. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow Derived MacrophagesMyelin Debris PhagocytosisSucrose Gradient UltracentrifugationCFSE LabelingOil Red O StainingBone Marrow IsolationMacrophage CultureMyelin Debris PreparationPhagocytosis AssayEpifluorescence Microscopy

Related Articles