במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם חוליה חשובה בין מערכות החיסון מולדים, מסתגלת. כמו אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), הם יכולים לתקשר עם לימפוציטים באמצעות מצגת אנטיגן שני ולשחרר ציטוקין^1,2,3. עם זאת, כמו המקצועי phagocytes, התפקיד העיקרי שלהם היא לנקות פתוגנים, תאים בגילאי ופסולת הסלולר^1,4. בעקבות פגיעה בחוט השדרה (מדע), כמויות ניכרות של פסולת המיאלין נוצר מתוך oligodendrocytes גוסס, סוג התא אחראי על מערכת העצבים המרכזית האקסון myelination⁵. אנחנו ואחרים הראו כי סיווג של המיאלין פסולת הוא בראש ובראשונה באחריות שחדר BMDMs^5,6,7. עם זאת, תוך פגיעה בחוט השדרה הוצע היבלעות באתרים של פסולת המיאלין להעביר תאים בדרך כלל אנטי דלקתיות אלה לכיוון מדינת פרו דלקתיים^5,8,9. כמתווכים מרכזיים של נוירו-דלקת חוט השדרה נפגע, BMDMs הם מטרות קליני חשוב.

כדי לסייע לחקור את השפעת BMDMs בחוט השדרה הפגוע, פיתחנו מודל במבחנה ללמוד ישירות איך BMDMs להגיב המיאלין פסולת. כדי לשפר את הרלוונטיות ביולוגי, BMDMs מאתר ראשי ופסולת המיאלין מבודד טריים משמשים האלה החקירות. ככזה, השיטות המובאות כאן פירוט גם את הבידוד והתרבות של BMDMs מאתר ראשי, טכניקה הדרגתיות סוכרוז ששונה המשמשת כדי לבודד CNS מאתר נגזר המיאלין פסולת^10,11,12. המיאלין פסולת יכול להיקרא בקלות עם תיוג הפלורסנט, אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כדי מעקב אחר שלה הפנמה מאת BMDMs. CFSE מתאים היטב עבור יישום זה כי זה הלא-ציטוטוקסיות, היתרים ספקטרום פלורסנט הצר שלה ריבוב עם פלורסנט אחרים רגשים^13,14. בעקבות phagocytosis, המיאלין פסולת שומנים מועברים דרך lysosomes, כחבילה ליפידים נייטרלי לתוך השומנים תאיים טיפות⁵. כדי לכמת את הצטברות השומנים תאיים, נציג של שמן אדום O (אורו) צביעת שיטת ממוטבים לניתוח תמונה כמותית. שיטה מכתימים פשוטה זו מייצרת תוצאות לשחזור חזקים כימות¹⁵. שיטות אלה להקל על המחקר של המיאלין פסולת השמירה phagocytosis ו ליפיד עם ציוד מיוחד מוגבל.

השיטות המתוארות כאן, בסעיף 2 אושרו על ידי פלורידה המדינה אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (IACUC), מנחים שנקבעו עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה, 8^th מהדורה מדריך . כל זה בשימוש פרוטוקול זה בעלי הבית במתקן חיות מעבדה ייעודית עד השימוש. אין ויוו ניסוי היה לפני שבוצעו כדי להקריב. מספרים בעלי חיים היו מבוססים על הצורך ניסיוני באמצעות תא הממוצע ואוספים המיאלין כמדריך על מנת למזער את השימוש.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הדור של מח עצם-derived מקרופאגים (BMDMs) (סעיף 1), הכנת מיאלין במוח, נגזר fluorescently שכותרתו פסולת (סעיף 2), נוהל כללי ניתוח phagocytosis פסולת מיאלין (סעיף 3), ו ההליך כללי לניתוח של הצטברות השומנים פסולת מיאלין (סעיף 4). ריאגנט הכנה, קציר תאים, מניפולציה, אוסף המיאלין, תיוג וביצועים assay צריכות להסתיים ב אבטחה למינריות זרימת האוויר ארון.

1. דור של מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי

1. הכנת מקרופאג מלאה תרבות בינוני (CMCM)
   הערה: הדור מקרופאג ממח העצם מחייב השימוש של גורם מגרה המושבה מקרופאג (M-CSF). הכנת מנצל L929 מאתר פיברובלסט ממוזגים מדיה כמקור של M-CSF.
   1. הפקת מדיה מאתר פיברובלסט ממוזגים L929 על ידי תאים culturing במנות 145 מ מ 50 מ של גלוקוז גבוהות (4500 mg/L L-גלוקוז) Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 5% נולד עגל סרום (רכיבי NC) ו פניצילין/סטרפטומיצין במשך 7 ימים.
   2. לאסוף את המדיה מתרבויות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 3500 x g, 4 מעלות צלזיוס.
   3. לסנן supernatants דרך מסנן מזרק 0.2 µm לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל חדש. ניתן לאחסן מדיה ממוזגים ב-80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
   4. כדי גלוקוז גבוהות DMEM, להוסיף 5% vol/כרך רכיבי NC, 15% vol/כרך L929 מאתר פיברובלסט ממוזגים DMEM ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין. ניתן לאחסן מדיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים. חם עד 37 ° C לפני השימוש.
2. אוסף של תאים במח העצם העיקרי מקרופאג אינדוקציה
   הערה: באמצעות העכבר הזה פרוטוקול אחד יפיק כ-20 מיליון הנגזרות מח עצם מקרופאגים (BMDMs).
   1. המתת חסד המספר בשבוע 8-10 עכברים הישן באמצעות CO₂ חנק לקווים מנחים סטנדרטיים ואחריו נקע בצוואר הרחם הרצוי.
   2. לחטא את החיה באמצעות 70% אתנול (vol/כרך): H₂O, קולח הפרווה.
   3. לחתוך חור קטן בבטן, בזהירות להפשיל את העור כדי לחשוף את הרקמה הבסיסית. לטפל כדי לא לנקב חלל הצפק.
   4. הסר את שתי הרגליים האחוריות החל הירך ואת הסוף על הקרסול. המקום הרקמה שנאספו לתוך צלחת פטרי 100 מ מ המכיל פוספט סטרילי 5-10 מ ל תמיסת מלח (PBS) בתוספת 1% buffered פניצילין/סטרפטומיצין.
      הערה: כאשר עיבוד מספר חיות ודא לשמור מנות על קרח כדי להגביל את רקמת השפלה.
   5. הסר העצם באמצעות אזמל משרירים ורקמות. רק את עצם הירך ואת שוקה משמשים לאוסף תא, השוק יכול להימחק.
   6. לחשוף את חלל מח העצמות שנאספו על ידי קיצוץ קטע קטן משני הצדדים עם אזמל.
   7. באמצעות מחט 25 גרם, לרוקן את חללים מח עם CMCM לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. העצמות יופיעו לבן ברגע שהם. יש כבר מספיק סמוקות.
   8. עם סיום איסוף, להתסיס aspirates עם מחט 18 גרם 30-90 שס. שנוצר השעיה תא בודד.
      הערה: ניתן לבצע צעד פירוק תאי הדם האדומים (RBC) אופציונלי בשלב זה. לאחרונה הוצע כי תוכן תאיים ברזל עשויים להשפיע את ההשפעות של המיאלין פסולת על קיטוב מקרופאג¹⁶. לקבלת מידע אודות הכללת צעד פירוק RBC מתייחסים Trouplin et al. ¹⁷.
   9. לסנן את המתלים דרך מסננת סטרילית תא מיקרומטר 70 לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל חדש.
   10. זרע נאסף תאים באופן שווה לתוך 145 מ מתא-תרבות-מנות המכיל 15-20 מ ל CMCM. השתמש בערך שלושה תרבות מנות לכל העכבר הקריב. דגירה תרבויות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   11. לאחר 72 שעות לשטוף צלחות פעם אחת עם PBS סטרילי כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, ואז להוסיף 15-20 מ"ל CMCM טריים. תקופת דגירה תרבויות של 4 ימים נוספים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. לאחר 7 ימים של תרבות הכולל, תאי מח עצם hematopoietic בתחילה מבודד יהיה בוגר BMDMs (איור 1).

2. דור של מיאלין במוח, נגזר Fluorescently שכותרתו פסולת

הערה: ניתן לאחסן כל ריאגנטים ב 4 ° C עד כחודש.

1. הכנה של המיאלין פסולת אוסף ריאגנטים
   1. הכנת Tris· Cl בופר.
      1. 800 מ ל מזוקקים יונים H₂O (ddiH₂O) להוסיף 20 מ של 1 מ' Tris· קלרנית, pH 7.45 (ריכוז סופי של 20 מ מ) ו- 20 מ ל 100 מ מ נה₂EDTA (ריכוז סופי 2 מ מ).
      2. להתאים את ה-pH ל 7.45. לכוון את עוצמת הקול עד 1000 מ"ל עם ddiH₂O. מסנן פתרון באמצעות יחידת סינון 0.2 µm.
   2. להכין פתרון סוכרוז 1 מ'.
      1. 100 מ של Tris· Cl מאגר פתרון, להוסיף 68.46 גר' סוכרוז. להתאים את עוצמת הקול כדי 200 מ עם Tris· Cl בופר. לסנן פתרון באמצעות יחידת סינון 0.2 µm.
   3. להכין 200 מ של 0.32 M סוכרוז פתרון על ידי דילול הפתרון 1 מ' עם Tris· Cl מאגר פתרון 0.83:0.16 (vol/כרך).
   4. הכן 150 מ ל 0.83 M סוכרוז פתרון על ידי דילול הפתרון 1 מ' עם Tris· Cl מאגר פתרון 0.83:0.16 (vol/כרך).
2. אוסף של המוח-derived המיאלין גולמי פסולת
   הערה: שיטת איסוף המתוארים כאן מיועדת הבידוד של פסולת גסה מיאלין.
   1. המתת חסד עכברים 10-12 8-10 שבועות של גיל באמצעות CO₂ חנק לקווים מנחים סטנדרטיים ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   2. לנתח את המוח ומניחים בצלחת 100 מ מ המכיל 10 מ"ל של 0.32 M סוכרוז פתרון.

3. מיאלין פסולת Phagocytosis Assay

הערה: הרשימה הבאה היא השיטה הבסיסית להבחנה phagocytosis של המיאלין שכותרתו fluorescently פסולת. תוספת של טיפולים אחרים ותנאים ניסיוני צריך להיות מותאם על ידי החוקר.

1. הכנת לוחות טיפול
   1. על כל צלחת 145 מ מ, לאסוף BMDMs בוגרת לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל באמצעות 5-6 מ"ל של 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ב- saline פוספט באגירה של Dulbecco (dPBS) (pH 7.4).
      הערה: אל תשתמש/י טריפסין כמו זה עשוי לשנות את מצב ההפעלה תאים¹⁸.
   2. להוסיף אמצעי שווה של CMCM מראש ומחוממת כל שפופרת של תאים שנאספו.
   3. צנטריפוגה ב 180 x g במשך 8 דקות ב 20 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
   4. להשעות מחדש תאים CMCM וספירה.
   5. על כל טוב של צלחת התרבות התא 24-ובכן, להוסיף 1 x 10⁵ תאים 1 מ"ל של CMCM.
   6. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
2. ניתוח וטיפול פסולת של המיאלין
   1. להוסיף 10 µL של 100 מ"ג/מ"ל CFSE שכותרתו המיאלין פסולת מכל קידוח (הריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל).
   2. תקופת דגירה של 1-3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   3. לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר את המיאלין שפוקדת ללא פסולת.
   4. להוסיף 400 µL של 4% paraformaldehyde כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
   5. לשטוף צלחת 2 פעמים עם PBS סטרילי.
   6. להוסיף 400 µL של פתרון Hoechst 33258 כל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות ב RT מוגן מפני אור.
   7. לשטוף צלחות 2 פעמים עם PBS סטרילי.
   8. להוסיף 200 µL של פטור-ג'ל עם מאגר טריס בכל טוב כדי להפחית את photobleaching.
   9. התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט הפוכה.
      הערה: אורכי הגל עירור, פליטה של CFSE הם 494 nm ו 521 nm, בהתאמה.
   10. מחלקים את מספר התאים חיובי CFSE לפי מספר גרעינים לקביעת יחסי המיאלין פסולת ספיגת.
   11. לפני הדמיה, לשמור על לוחות עד 7 ימים ב 4 ° C מוגן מפני אור.

4. כימות של ליפידים תאיים באמצעות שמן מכתים אדום-O

הערה: הרשימה הבאה היא השיטה הבסיסית להבחנה ליפידים מיאלין-פסולת-derived תאיים.השימוש CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אינה מומלצת פלורסנט כימות של אורו מכתים בשל חפיפה ספקטרלי. תוספת של טיפולים אחרים ותנאים ניסיוני צריך להיות מותאם על ידי החוקר.

1. הכנת מכתים פתרונות
   1. להכין פתרון מוכתמים בשמן האדום-O (אורו) 0.5%.
      1. לאט לאט להוסיף 100 מ של 100% פרופילן גליקול (1, 2-Propanediol) ל- 0.5 גר' אורו (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) תוך כדי ערבוב.
      2. מחממים את הפתרון ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד כל חלקיקים גדולים הם התפרקה.
         הערה: לא מחממים מעל 100 מעלות צלזיוס.
      3. לסנן פתרון באמצעות פיסת נייר סינון בזמן עדיין חם לתוך מיכל חדש.
      4. לאפשר פתרון לילה מגניב-RT. פתרון שניתן לאחסן עד 1 שנה ב- RT.
   2. להכין 85% פרופילן גליקול פתרון.
      1. להוסיף מ 85 ל 100% פרופילן גליקול 15 מ"ל של ddiH₂O. מערבבים עד מעורב. הפתרון ניתן לאחסן עד 1 שנה ב- RT.
2. הכנת לוחות טיפול
   1. להכין צלחת 24-ובכן בעקבות השיטה המתוארים בסעיף 3.
   2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
3. טיפול פסולת המיאלין
   1. להוסיף 10 µL של 100 מ"ג/מ"ל המיאלין פסולת מכל קידוח (הריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל).
   2. תקופת דגירה של 1-3 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   3. לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי הסרת לכלוך שאינו מתעכל מיאלין.
      הערה: בשלב הזה, צלחות ניתן גם לעבור קיבוע מיידית או CMCM טריים ניתן להוסיף וחזר תאי הדגירה נקודות זמן נוסף.
   4. להוסיף 400 µL של 4% paraformaldehyde כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
   5. לשטוף צלחת 2 פעמים עם PBS ואז procced כדי להכתים סטרילי.
4. אורו מכתים וניתוח
   1. לשטוף צלחת קבוע 3 פעמים עם ddiH₂O.
   2. להוסיף 400 µL של 100% פרופילן גליקול מכל קידוח, תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
      הערה: פעולה זו תקטין דחויים של ddiH₂O.
   3. האחות של פרופילן גליקול ולהוסיף 400 µL של אורו פתרון כל טוב.
   4. תקופת דגירה של 8 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
   5. האחות הפתרון אורו. לאחר מכן, להוסיף µL 400 של 85% פרופילן גליקול מכל קידוח, תקופת דגירה של minumintes 5-RT.
   6. לשטוף צלחת 3 פעמים עם ddiH₂O.
   7. להוסיף 400 µL של פתרון Hoechst 33258 כל טוב. תקופת דגירה של 5 דקות-RT, מוגן מפני אור.
   8. לשטוף צלחות 2 פעמים עם PBS סטרילי.
   9. להוסיף 200 µL של פטור-ג'ל עם טריס מאגר כל טוב.
   10. התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט הפוכה. אורו יכול לדימות באמצעות ערכת מסנן סטנדרטי, טקסס אדום או DsRed.
   11. לכמת השומנים היחסי השמירה על ידי קביעת אזור חיובי אורו בכל שדה תמונה חילוק זה המספר של גרעין האטום.
   12. לשמור על לוחות עבור 7 ימים ב 4 ° C מוגן מפני אור.

טיפול של BMDMs עם CFSE שכותרתו המיאלין פסולת אמור להניב ברור הפנמה (איור 2). בעוד זמן האינטראקציה 3 שעות מספיקה עבור BMDMs phagocytose מספיק פסולת המיאלין נוסף לגילוי במורד הזרם חזקים, הצטברות תאיים יכול להיות שנצפו עם מעט ככל 1 שעה של אינטראקציה. עם זאת, יש שרידים המיאלין עדיין ייתכן בהווה על פני התא לאחר הרחצה. זה יכול להיות בגלל כביסה לא מספיק, או לא להיות מלא הפנימו כבר בשלבים המוקדמים של phagocytosis חלקיקים.

בעוד BMDMs במהירות יכול להפנים את המיאלין פסולת, עיבוד lysosomal נדרש לפני אורו השומנים מלאכת יד טיפות טופס. להפגין, BMDMs היו מודגרות עם מיאלין פסולת במשך 90 דקות, לשטוף, תרבותי עבור סכומים נוספים של זמן לפני קיבוע, מכתים (איור 3). איור 4 מראה שיש עיכוב בין טיפול חניכה והמראה השומנים נייטרלי. יש גם לציין כי השומנים השמירה אינה יציבה במהלך תרבות. BMDMs יתחיל לעכל שומנים שהצטברו זמן קצר לאחר היווצרות droplet. ככזה, אנו ממליצים על ההמתנה. לא יותר מ-24 שעות בין כביסה משם שפוקדת ללא מיאלין פסולת קיבעון.

כימות של אורו צבעונית אזור מדגים את קצב חילוף החומרים של השומנים מיאלין ב- BMDMs (איור 5). לאחר תקופה של 90 דקות אינטראקציה, תאים הוחזרו הדגירה ב CMCM טריים. במהלך התקופה הקדומה צ'ייס בינוני טריים, BMDMs לעכל הרכיב השומנים מיאלין phagocytosed פסולת לתוך נייטרלי אורו ליפידים מלאכת יד. עלייה מתמדת באזור חיובי אורו הוא אופייני בשעות בעקבות המפגש. לאחר 24 שעות אולם, BMDMs יהיו effluxed או מטבוליזם ניכר של ליפידים תאיים.

איור 1 : נציג BMDM תרבויות. כמה תאים חסיד יתקיימו בתחילה. יום 3 תאים שאינם מחסידי יוסרו. על ידי 7 יום, מקרופאגים הנגזרות מח עצם בוגרת שנצפו. סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : נציג תמונות של BMDM מיאלין פסולת Phagocytosis Assay. תאים שטופלו 1 מ"ג/מ"ל CFSE שכותרתו המיאלין פסולת למשך שעה לפני כביסה, קיבעון עם 4% מחברים. למביטה המיאלין פסולת ניתן לאבחן באמצעות מערכות סינון GFP רגיל על מיקרוסקופ בעל יכולת epi-פלורסנט. סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : תרשים של שמן אדום O (אורו) תכנון ניסויים. BMDM מטופלים עם פסולת המיאלין 1 מ"ג/מ"ל (דילול מטריים) במשך 90 דקות, ואחריו כביסה ותרבות בינוני טריים לפני קיבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : אורו כתמים BMDM בעקבות המיאלין פסולת Phagocytosis. קיבוע הבאים עם 4% PFA המצוין הזמן-נקודות, BMDMs היו מוכתמים אורו, Hoechst 33258. מוצגות תמונות נציג עבור כל הזמן-נקודה. סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : ניתוח תמונה כמותית של אורו מכתים. על כימות של אורו מכתים, 3 בארות היו צילמו בגיל 20 X עם 5 תמונות לכל טוב. כל ההגדרות רכישת התמונה היו זהים. קווי שגיאה = ב- SEM (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים יש אין גילויים.