נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה
במאמר זה
סיכום
תקציר
רמות הכולסטרול (HDL-C) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נמוך הם אחד החזקים ביותר מנבאות שלילי עצמאית של מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD). המבנה והתפקוד של HDL יותר מאשר ה-HDL-C אולי יותר לחזות במדויק טרשת עורקים. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. פונקציית ה-HDL נקבעת בדרך כלל לפי תא מבוסס מבחני כגון כולסטרול בזרימת assay אבל אלה מבחני יש חסרונות רבים, היעדר סטנדרטיזציה. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. HDL חמצון פוגע פונקציית ה-HDL. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. השומנים-בדיקה אינטראקציות להתייחס כאשר מבחני הנמצאות לפרש את התוצאות של זריחה אנזימטי למדידת מצב חמצון השומנים. זה הניע אותנו לפתח שיטה אנזימטי ללא תא ביוכימי כדי להעריך את ה-HDL חמצן תוכן שומני (HDLox) אשר תורם בתפקוד ה-HDL. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C. פרוטוקול זה קביעת describedfor peroxidation HDL-השומנים באמצעות הכימית fluorochrome. השתנות assay יכול להיות מופחת על ידי סטנדרטיזציה קפדנית של תנאי הניסוי. ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. Readout assay זו משויכת המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית אמצעים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית פנוטיפים סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך. גישה טכנית זו היא שיטה חזקה כדי להעריך פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים).
מבוא
מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי רמות נמוכות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) המשויכים בדרך כלל הפוך הסיכון להתפתחות טרשת עורקים1,2. למרות מספר מחקרים תומכים תפקיד atheroprotective עבור ה-HDL1,2, המנגנון שבאמצעותו HDL נחלש החניכה, ההתקדמות של טרשת עורקים הוא מורכב 3,4. לפיכך, הוצע כי מורכבות המבנה והתפקוד של HDL ולא רמה מוחלטת עלולה יותר לחזות במדויק טרשת ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו עם אתיקה אישור מהאוניברסיטה של קליפורניה בלוס אנג'לס, לוס אנג'לס, ועדת האתיקה האנושית של החולים אלפרד, מלבורן.
הערה: ישנן וריאציות רבות של הפונקציה fluorochrome HDL Assay (ראה דיון) 32. להלן נתאר את פרוטוקול זה נותן תוצאות עקביות ביותר לשחזור. סקירה כללית של וזמינותו מוצגת באיור 2.
1. עיבוד הדגימה
- שימוש בסרום טריים, ללא hemolyzed (יכול להיות שנאספו סרום מפריד צינורות) או ציטראט פלזמה שהושג לאחר 12-14 שעות צום. אם באמצעות דגימות cryopreserved, לכלול הפקד המתאים כמתואר פרוטוקול זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
50 µL של כל מדגם ה-HDL מתווספים כל טוב כמו שלב 7.3. µL 50 של פתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.5. דוגמאות מודגרת למשך 30 דקות ב 37 ° C כמו שלב 7.6. µL 50 של ריאגנט fluorochrome יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.7 (הריכוז הסופי של 300 מיקרומטר). המדידה פלורסנט (בחושך) ואז שקובעת כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים). קרינה פלואורסצנטית נציג נתונים לשליטה ריק, במאגר, לדוגמה עם HDL לקוי ידוע ודגימת עם HDL נורמלי מוצגים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מציע כלי חזקים כדי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL טרשת עורקים, מחלות אנושיות. וזמינותו מכמת את ה-HDL השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C באמצעות הגברה אנזימטי (HRP). גישה זו מונע המגבלות המוכרות של מבחני תפקוד HDL מוקדמת (למשל וזמינותו בזרימת כולסטרול) כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים טריגליצרידים7,15,32. קביעת הבי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
זה הפרוטוקול ואת וזמינותו הרלוונטיים הפטנטים PCT/US2015/018147.
תודות
המחברים מאשר בתודה את העבודה של ד ר פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן Reddy סריניוואסה עבור שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. T.A.A. נתמך על ידי RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. AJ AH נתמכים על ידי מענק פרוייקט NHMRC 1108792. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # µL1TR000124.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ריאגנטים ניסיוניים חזקים> | |||
| HDL PEG (פוליאתילן גליקול) מגיב משקע | פוינט מדעי | H7511 | |
| מגיב אדום אמפלקס. | Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני |
| DMSO קל. | Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני |
| צנון סוס קל פרוקסידאז (HRP) | Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני |
| כולסטרול אסטראז קל. | Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני |
| כולסטרול קל תקן | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום Amplex. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני אור |
| Resorufin fluorescense תקן ייחוס | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום Amplex. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; יש להגן מפני |
| מאגר תגובה קל פי 5. | Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק | A12216 | ערכת בדיקת כולסטרול אדום אמפלקס. • ≤ – 20° סי ושור; Desiccate ושור; הגן מפני אור |
| HDL כולסטרול אוטומטי ריאגנט | ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב. | TR39601 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| ><חזק>פלסטיק | |||
| 96 בארות (פוליפרופילן, תחתית שטוחה, שקוף). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| צלחות 96 בארות (פוליפרופילן, תחתית שטוחה, שחור). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| ClipTip 200, סטרילי | ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב. | 14-488-058 | |
| פיפטות רב-ערוציות תרמו סיינטיפיק, 8 ערוצים, 125 | ThermoFisher Scientific Co., סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב. | 14-387--955 | |
| שם | חברה | Catalog Number | >Comments |
| >Software | |||
| Gen5 2.01 תוכנה | Biotek, ורמונט, ארה"ב | NA | |
| שם | חברה | Catalog Number | >Comments |
| >Equipment | |||
| Gen5 קורא צלחות | Biotek, ורמונט, ארה"ב | NA |
מקורות
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
