Method Article

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

DOI:

10.3791/56332

⸱

March 12th, 2018

 , 
1Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2BC Cancer Agency, Provincial Health Services Authority, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות בריאות וזמינותו (פומה) הוא שמחוץ ריאות explant מערכת התרבות תאים סגורים שמקנה לחוקרים ללמוד את הביולוגיה של כיבוש ריאות אוסטאוסרקומה (OS) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מאמר זה מספק תיאור מפורט של הפרוטוקול ודן דוגמאות של קבלת נתוני תמונה על גידול גרורתי באמצעות widefield או פלטפורמות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. הגמישות של המודל פומה שמקנה לחוקרים ללמוד לא רק את הצמיחה של תאים OS microenvironment הריאה, אלא גם כדי להעריך את ההשפעות של הרפוי אנטי גרורתי לאורך זמן. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר הדמיה חסרת תקדים, ברזולוציה גבוהה של מערכת ההפעלה תא אינטראקציות עם parenchyma הריאה. יתר על כן, כאשר המודל פומה משולב עם צבעי פלורסנט או כתבים גנטי חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים ללמוד את microenvironment הריאה, מבנים הסלולר subcellular, תפקוד הגן, יזם פעילות בתאים OS גרורתי. המודל פומה מספק כלי חדש עבור אוסטאוסרקומה חוקרים לגלות ביולוגיה גרורות חדשות, להעריך את הפעילות של טיפולים אנטי גרורתי, ממוקד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות משופרות עבור ילדים חולים עם גרורות אוסטאוסרקומה (OS) נשאר עדיין צורך קליני קריטי 1. זה מדגיש את החשיבות של לפתח טיפולים חדשים ממוקדות מולקולרי. Chemotherapeutics המקובלת כי התפשטות תאים סרטניים היעד לא הוכיחו להיות יעיל בטיפול במחלה גרורתית, ובכך אסטרטגיות הרומן חייב לכוון תהליך גרורתי עצמו 2. המאמר הנוכחי דן בהיבטים של סוג חדש יחסית של ex-vivo מודל ריאות גרורות, וזמינותו גרורות בריאות (פומה) שפותחה על ידי מנדוזה ועמיתיו3, אשר מספק כלי שימושי גילוי חדש מנהלי התקנים מולקולריים בהתקדמות גרורות ריאה OS 4,5. לפני שתמשיך, עם זאת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים בעלי חיים שממנו התקבלו נתונים הדמיה בוצעו עם אישור של טיפול בעלי חיים, שימוש הוועד של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים בעלי חיים שנדונו ואת מתוארים במאמר וידאו אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת בריטיש קולומביה.

1. הכנה של תאים סרטניים הזרקת וחומרים עבור דגם פומה

הערה: כמות התאים והפתרונות יהיה מספיק בשביל העכבר 1. קנה המידה של הצורך אם עכברים יותר משמשים במחקר. לקבלת מתכונים המדיה, עיין טבלה 1 ו- 2 בטבלה.

  1. לחמם 5 מ של A-מדיה 15 מ"ל צינור חרוטי באמבט מים 37 oC.
  2. ממיסים 1.2% נמוך נמס agarose הפתרון ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ פלורסצנטיות ההגדלה נמוך widefield

עבור widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ של פומה ריאות פרוסות, להחליפן בתמונות, כימות הנתונים מוצגים באיור 2C, ואת דמות 4A ו- B. מספק שלעצמו גרורתי עבור שורות תאים גבוה ונמוך גרורתי ניכרים באופן חזותי על נקודות זמן מתקדמת. תאים MNNG יכול ליישב ביעילות רקמת הריאה ואילו תאים זונות לא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן מאמר טכני המתאר כמה היבטים מעשיים של המודל פומה בלימוד קולוניזציה ריאות ב- OS. כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול איפה החוקרים צריכים להיזהר במיוחד כוללות את הפעולות הבאות:

a) תעלות של חוליות הצוואר. יכול להיפגע בקלות אל קנה הנשימה תוך כדי לנתח את השרירים שמסביב ואת רקמת חיבור. בנוסף, להיות דחף את המחט של הקטטר בקלות דרך קנה הנשימה. שים לב עד כמה השיקוע של המחט נכנסת קנה הנשימה בעת הוספת את הצינורית.

b) תקר או פגיעה השטח של הריאה. הריאה ניתן בקלות ניקב או ניזוק עם לנת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ד ר Arnulfo מנדוזה שסיפק הכשרה בטכניקה פומה. בנוסף, ברצוננו להודות ד"ר צ'אנד Khanna, סוזן גארפילד (NCI/NIH), ואפריצ'יו סאם (סוכנות סרטן לפנה ס) על מתן השימוש שלהם מיקרוסקופים במהלך מחקר זה. מחקר זה נתמך (באופן חלקי) על-ידי התוכנית מחקר מגזר של מכוני הבריאות הלאומיים, במרכז לחקר הסרטן, סניף אונקולוגיה ילדים. M.M.L. נתמך על ידי מוסדות של בריאות מגזר ביקור עמית התכנית הלאומית (זוכה פרס 15335), כיום נתמכת על ידי מלגת פרקר ג'ואן בחקר גרורות. P.H.S. נתמך על ידי קרן סרטן קולומביה הבריטית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>טבלה 2
<חזק>ריאגנטים לתרבית תאים עבור A-media, B-media ומדיה שלמה
MNNG-HOSATCCCRL-1547קו תאים גרורתי מאוד HOS
ATCCCRL-1543קו תאים גרורתי של מערכת הפעלה
MG63.3מעבדת איימי לבלנק (NCI)N/Aקו תאים מערכת הפעלה גרורתי מאוד
MG63ATCCCRL-1427קו תא מערכת הפעלה גרורתי
גרוע 10X M199 מדיהThermofisher11825015מדיה בסיסית עבור A-media ו-B-media
מים מזוקקים (מעוקרים)Thermofisher15230-147רכיב של A-media & B-media
7.5% תמיסת נתרן ביקרבונטThermofisher25080094רכיב של A-media & B-media
HydrocortizoneSigma-AlrichH6909רכיב של A-media & B-media
רטינול אצטט-מסיס במיםSigma-AlrichR0635-5MGרכיב של A-media & תמיסת B-media
פניצילין/סטרפטומיצין 10X מרוכזת (10000 יחידות / מ"ל)Thermofisher15140122רכיב של A-media & B-media, מדיה מלאה.
תמיסת אינסולין בקר (10 מ"ג/מ"ל)Sigma-AlrichI0516-5MLרכיב של A-media & B-media
DMEM, גלוקוז גבוהThermofisher11965092מדיה בסיסית של מדיה שלמה
L-גלוטמין (200 מ"מ)25030081Thermofisher של מדיה מלאה
סרום בקר עובריThermofisher16000044 רכיב של מדיה שלמה
Dulbecco' s Phosphate BufferedSalt Thermofisher14190144משמש בתרבית תאים.
האנק' s תמיסת מלחים חומציים, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםתרמופישר14175095משמש להשעיית כדור תאים לפני הזרקת
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםתרמופישר25200114משמש בתרבית תאים.
DAR4MEnzoALX-620-069-M001משמש לתיוג פרנכימת ריאות.
NameCompanyCatalog NumberComments
טבלה 3
חומרים עבור PuMA
Zeiss 710 Confocal LSMZeissN/Aזקוף LSM קונפוקלי מיקרוסקופ
Zeiss 780 קונפוקלי LSMZeissN / Aמיקרוסקופ קונפוקלי LSM הפוך
עכברי SCIDצ'ארלס ריברN/ANOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl, נקבה, גיל 6-8 שבועות
GelFoamמכשיר הרווארד59-9863משמש כתמיכה לקטעי רקמת ריאה.
SeaPlaque AgaroseLonza50100משמש במהלך אינפלציה של הריאה.
מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 מדFisherscientific14-826-87משמש להזרקת וריד זנב.
מזרק BD 10 מ"ל309604משמש לאינפלציה של הריאה.
קטטר 20 מדTerumoSR-OX2032CAמשמש במהלך אינפלציה של הריאה.
סט הארכה של Abbott IV (30 אינץ', סטרילי)Medisca8342משמש במהלך אינפלציה של הריאה.
ספוגיות אלכוהולBD326895לניגוב וריד הזנב לפני הזרקה
כפפות כירורגיות סטריליותFisherscientificמשתנה עם גודלמסירה ספקנית של ריאות עכבר
סרגל 30 ס"מסיכות המשמשותלאינפלציה של הריאה.
מעמד תמיכה לסרגלPipette.comHS29022Aמשמש לניפוח הריאות.
צלחת תרבית עם תחתית זכוכית 35 מ"מIbidi81158משמש במהלך הדמיה של פרוסות ריאה
רפידות תחתונות סופגות עם מחסום לחות עמיד למיםVWR56617-014משמש לציפוי אזור העבודה הסטרילי במכסה המנוע הביולוגי.
Catgut תפר נספג רגילבראוןN/Aמשמש לקשירת קנה הנשימה המשונר.
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>טבלה 4
<חזק>מכשירים כירורגיים עבור PuMA
מספריים חיתוך מיקרו 3.5 אינץ' ישר חד/חד רובוזRS-5910לחיתוך חלקי ריאה
4 אינץ' (10 ס"מ) ארוך משונן ישר עדין במיוחד 0.5 מ"מ קצהRobozRS-5132למניפולציה/החזקת חלקי ריאה.
4 אינץ' (10 ס"מ) עקומה קלה משוננת ארוכה 0.8 מ"מ קצהRobozRS5135למניפולציה/החזקת חלקי ריאה.
מלקחיים לחבישת אגודל; משונן; עדין; אורך 4.5 אינץ'; רוחב קצה 1.3 מ"מRobozRS-8120לדיסקציה כללית.
מלקחיים לתחבושת אגודל 4.5 אינץ' משוננים 2.2 מ"מ רוחב קצהRobozRS-8100לדיסקציה כללית.
מספריים מיקרו חיתוך עדינים במיוחד 3.5 אינץ' ישר חד / חד, להב 20 מ"מRobozRS-5880לדיסקציה כללית.
מספריים של Knapp; ישר; חד-בוטה; אורך להב 27 מ"מ; 4 אינץ' אורך כוללRobozRS-5960לדיסקציה כללית.
רכיב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
  2. Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
  3. Mendoza, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pulmonary Metastasis AssayOsteosarcoma Lung ColonizationMetastatic Osteosarcoma CellsLung MicroenvironmentFluorescence MicroscopyImage AnalysisConfocal MicroscopyWidefield MicroscopyLung Tissue PreparationTumor Cell Quantification

Related Articles