Method Article

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

DOI:

10.3791/56332

⸱

March 12th, 2018

 , 
1Pediatric Oncology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2BC Cancer Agency, Provincial Health Services Authority, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות בריאות וזמינותו (פומה) הוא שמחוץ ריאות explant מערכת התרבות תאים סגורים שמקנה לחוקרים ללמוד את הביולוגיה של כיבוש ריאות אוסטאוסרקומה (OS) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מאמר זה מספק תיאור מפורט של הפרוטוקול ודן דוגמאות של קבלת נתוני תמונה על גידול גרורתי באמצעות widefield או פלטפורמות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. הגמישות של המודל פומה שמקנה לחוקרים ללמוד לא רק את הצמיחה של תאים OS microenvironment הריאה, אלא גם כדי להעריך את ההשפעות של הרפוי אנטי גרורתי לאורך זמן. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר הדמיה חסרת תקדים, ברזולוציה גבוהה של מערכת ההפעלה תא אינטראקציות עם parenchyma הריאה. יתר על כן, כאשר המודל פומה משולב עם צבעי פלורסנט או כתבים גנטי חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים ללמוד את microenvironment הריאה, מבנים הסלולר subcellular, תפקוד הגן, יזם פעילות בתאים OS גרורתי. המודל פומה מספק כלי חדש עבור אוסטאוסרקומה חוקרים לגלות ביולוגיה גרורות חדשות, להעריך את הפעילות של טיפולים אנטי גרורתי, ממוקד.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות משופרות עבור ילדים חולים עם גרורות אוסטאוסרקומה (OS) נשאר עדיין צורך קליני קריטי 1. זה מדגיש את החשיבות של לפתח טיפולים חדשים ממוקדות מולקולרי. Chemotherapeutics המקובלת כי התפשטות תאים סרטניים היעד לא הוכיחו להיות יעיל בטיפול במחלה גרורתית, ובכך אסטרטגיות הרומן חייב לכוון תהליך גרורתי עצמו 2. המאמר הנוכחי דן בהיבטים של סוג חדש יחסית של ex-vivo מודל ריאות גרורות, וזמינותו גרורות בריאות (פומה) שפותחה על ידי מנדוזה ועמיתיו3, אשר מספק כלי שימושי גילוי חדש מנהלי התקנים מולקולריים בהתקדמות גרורות ריאה OS 4,5. לפני שתמשיך, עם זאת, יהיה נבון. לגעת בקצרה על מספר המודלים הנוכחיים של גרורות, מבחני איך המודל פומה מציעה מספר יתרונות על-קונבנציונאלי במבחנה .

ביותר ניסיוניות המשמשות ללימוד גרורות המרכיבים של מערכות במבחנה , ויוו מסכם את הדברים צעד מסוים או מספר שלבים של המפל גרורתי. השלבים הבאים כוללים: תאים סרטניים 1) מעביר הגידול העיקרי, 2) intravasation לתוך כלי הסמוך (הדם או הלימפה), המעבר בתוך מחזור הדם, 3) לעצור באתר משני, 4) extravasation ו הישרדות באתר משני, היווצרות 5) של micrometastases, ו- 6) הצמיחה לתוך vascularized גרורות (איור 1). במבחנה מודלים של גרורות ניתן לכלול העברה (2D) 2-ממדי, תלת-ממדי (3D) Matrigel הפלישה מבחני אשר נבדקות ב פירוט במקום 6. עבור מודלים ויוו , לכלול שתי המערכות מודל נפוץ: 1) דגם גרורות ספונטני הוא איפה תאים סרטניים orthotopically מוזרק לתוך סוג רקמות ספציפיות כדי בצורת גידול מקומי אשר באופן ספונטני משיל תאים גרורתי לאתרים מרוחקים; 2) דגם ניסיוני גרורות הוא שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך כלי הדם במעלה הזרם של האיבר היעד. לדוגמה, זנב הווריד הזרקה של תאי הגידול בתוצאות פיתוח ריאות גרורות5,7,8. דגמים אחרים גרורה ניסיוני כוללים הזרקה של תאים סרטניים לתוך הטחול או וריד מצע המעי העליון אשר גורמת להתפתחות גרורות בכבד9,10. שיקולים מעשיים של מודלים אלה ויוו נדונים בפירוט על ידי ולש 11. עוד ויוו דגם המשמשות ללימוד גרורות ב סרקומות של ילדים הוא המודל השרשה הגידול subcapsular כליה כליות שתוצאתה היווצרות הגידול המקומי, גרורות ספונטנית הריאות 12,13. טכניקה יותר מבחינה טכנית תובעניים כגון intravital videomicroscopy יכול ישירות להמחיש, בזמן אמת, אינטראקציות בין תאי סרטן גרורתי של microvasculature של אתר גרורתי (כלומר. הריאות או הכבד) כפי שתואר על ידי מקדונלד14 Entenberg15, או סרטן extravasation תא ממברנה chorioallantoic כפי שמתואר על ידי קים 16.

המודל הפומה הוא ex-vivo, explant רקמת הריאה, מערכת תרבות סגורה איפה הצמיחה של תאים סרטניים פלורסנט יכול להיות longitudinally שנצפו באמצעות מיקרוסקופ זריחה על פני תקופה של חודש (ראה איור 2 א). מודל זה recapitulates בשלבים הראשונים של הריאה קולוניזציה (שלבים 3 עד 5) בהמפל גרורתי. הם כמה מהיתרונות העיקריים של המודל פומה על-קונבנציונאלי במבחנה מודלים: 1) היא מספקת הזדמנות למדוד longitudinally צמיחת תאים של סרטן גרורתי ב- microenvironment תלת-ממד זה שומר על תכונות רבות של הריאות microenvironment ב ויוו 3; 2) פומה מאפשר החוקר להעריך נוקאאוט של טיפול גנטי או סמים למועמד יש פעילות אנטי-גרורתי בהקשר של microenvironment הריאה תלת-ממד; 3) המודל הפומה הוא גמיש עם סוגים רבים של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פלטפורמות (איור 2B) כגון widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או סריקה בלייזר קונפוקלית, דוגמאות של כל אחד מוצגים באיור 2C & D, בהתאמה. במאמר זה נדון כיצד להשתמש במודל של פומה כדי לקבל נתונים הדמיה האורך על גידול גרורתי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) משופרת-המבטאת תאי האדם אוסטאוסרקומה גרורתי גבוה ונמוך (MNNG וזונות תאים, בהתאמה) באמצעות קרינה פלואורסצנטית ההגדלה נמוך widefield. דוגמאות של הדמיה של הפלורסנט אשר תוויות parenchyma הריאה, חלבון אדום-פלורסנט כתב גנטי, אשר מתייג המיטוכונדריה ב OS תאים במודל פומה באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית נדונות גם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים בעלי חיים שממנו התקבלו נתונים הדמיה בוצעו עם אישור של טיפול בעלי חיים, שימוש הוועד של המכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות. כל הפרוטוקולים בעלי חיים שנדונו ואת מתוארים במאמר וידאו אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים אוניברסיטת בריטיש קולומביה.

1. הכנה של תאים סרטניים הזרקת וחומרים עבור דגם פומה

הערה: כמות התאים והפתרונות יהיה מספיק בשביל העכבר 1. קנה המידה של הצורך אם עכברים יותר משמשים במחקר. לקבלת מתכונים המדיה, עיין טבלה 1 ו- 2 בטבלה.

  1. לחמם 5 מ של A-מדיה 15 מ"ל צינור חרוטי באמבט מים 37 oC.
  2. ממיסים 1.2% נמוך נמס agarose הפתרון (במים סטריליים) באמצעות המיקרוגל מעבדה.
  3. להעביר 5 מיליליטר agarose מותכת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, לחמם בתוך אמבט מים 37 oC. ודא agarose נמס ב 37 oC ונוזלים לפני השלב insufflation ריאות.
  4. מראש מקררים 30 מ של התא-תרבות כיתה PBS בתוספת 1 X עט/דלקת בתוך דלי קרח.
  5. ב טוב אחד של צלחת 6-ובכן, מראש משרים בספוג ג'לטין ב- 1.5 מ של B-מדיה. הספוג יהיה העוגן תמיכה הפרוסות ריאות.
  6. ודא שהתאים OS כ- 70-90% confluent ביום של ההליך. אל תשתמש תאים שהם confluent יתר או אם התקשורת הוא כתום לצהוב מאז התאים בדרך כלל לחוצה ואני יש פחת הכדאיות בשלב זה. עבור שורות תאים אוסטאוסרקומה, MNNG, זונות, 5 x 105 בנפח של 100 μL ישמש להחדיר לתוך וריד הזנב העכבר 1. יוקרתית בהתאם אם עכברים יותר משמשים לצורך המחקר.
  7. לקצור את תאי הגידול באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA (3 מ"ל בקבוקון T75 או 2 מ לצלחת תרבות 10 ס מ). כאשר התאים מתחילים להרים את הצלחת, לנטרל טריפסין-EDTA עם מדיה מלאה. ספין למטה תאים ולשטוף פעם תרבית תאים בציון PBS. Resuspend צנפה ב 5 מ של PBS.
  8. לבצע ספירת תאים על ידי בשיטות הרגילות. . זה הטוב ביותר להפוך התליה תא יותר מאשר מה נדרש למעשה מאז אובדן של השעיה תא לעיתים קרובות מתרחשת במהלך המחט צייר-up, הזרקת נסיונות שנכשלו.
  9. ביצוע וזמינותו אי-הכללה של Trypan-כחול על מדגם של התליה תא להערכת הכדאיות של התאים. המשך רק אם התא להראות יכולת הקיום של 90% ומעלה.
  10. להזריק 5 x 105 תאים נפח של 100 μL. כדי להכין עודף של 2 X סכום זה, עונה 1 פרק 106 תאים צריך להיות טוו למטה, resuspended ב 0.2 מ של HBSS.
  11. מקום התליה תא דלי קרח בעת הכנת העכברים להזרקה.

2. זנב בהזרקה לווריד, ריאות Insufflation

הערה: הסכום של פתרונות ותאים בסעיף זה יהיה מספיק בשביל העכבר 1. קנה המידה של הצורך אם עכברים יותר משמשים במחקר. לקבלת רשימה של חומרים וציוד, כלי ניתוח שימוש בשלבים הבאים, עיין בטבלה 3 ו- 4 בטבלה.

  1. חמים עכבר הנשי (גיל 6-8 שבועות) תחת מנורת חימום למשך 5 דקות על מנת להפוך את הזנב שלהם הווריד יותר בצואה. עבור תאים K7M2 או K12 מאתר, להשתמש Balb/c עכברים; לשימוש תאים אנושיים של MG63.3, MG63, MNNG, זונות, severe משולבים כשל חיסוני עכברים.
  2. ודא שהתליה תא הוא אחיד ע י ניעור בעדינות את הצינור. צייר בקפידה את התליה תא לתוך המזרק 1 מ"ל ללא המחט. מכסה המזרק עם 27 להעריך את המחט. ודא שיקוע המחט נמצא באותו צד כמו הסימנים נפח על המחט.
  3. הצב את העכבר restrainer, לנקות את הזנב עם המחיקה אלכוהול.
  4. להמשיך לבצע זריקה וריד הזנב ולהזריק את μL 100 של התליה תא. 5 דקות אחרי הזריקה, מקם את העכבר בתוך תא2 CO ולהתחיל את המתת חסד סטנדרטי (כמו חלוקה לרמות על-ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים שלך). נקע בצוואר הרחם אמור לא לשמש כאמצעי המתת חסד מאז ההליך יגרום נזק קנה הנשימה.
  5. לאחר העכבר הוא מורדמים, להתחיל הכנה של למינארי insufflation של הריאות העכבר עם הפתרון agarose/A-מדיה. בתוך למינארי, כיוונון ופינת עבודה עם הפנקס סטרילי. על גבי משטח זה יהיה מקום שלך בכלים סטיריליים, צנתר הרביעי, הרביעי סיומת set והכבידה זלוף המנגנון (ראה תוספת איור 1).
  6. מקם את העכבר recumbancy הגבי. עם מספריים קטנות סטרילי, בזהירות לנתח את עצם החזה כדי לחשוף את החזה. לטפל כדי לא לנקב את הריאה מאז פתרון agarose/A-מדיה שישמש insufflate הריאה.
  7. כאשר לנתח את החזה, לנתח מעבר לים בית החזה משני הצדדים קנה הנשימה. חושפים את קנה הנשימה על ידי לנתח של הרקמות הרכות שמסביב.
  8. נקרר קנה הנשימה עם צנתר הרביעי מד 20. ברפיון לקשור קשר כירורגי באמצעות תפרים לאללה סטרילי סביב cannulated קנה הנשימה.
  9. צרף הרחבה הרביעי של קנה הנשימה catheterized מוגדר המזרק 10 מ"ל של המנגנון זלוף הכבידה.
  10. לשלב טרום ומחוממת 37 oC agarose (5 מ"ל) A-מדיה (5 מ"ל) לתערובת 1:1. יוצקים את הפתרון agarose/A-מדיה נוזלי לתוך המזרק 10 מ"ל של המכשיר זלוף הכבידה. לפני insufflation של הריאות עם פתרון agarose/A-מדיה, להבטיח כי לכל אורכה של ערכת הרחבה יש כבר בשלה עם agarose/A-מדיה, ובכך שלילת בהיסח הדעת insufflation של הריאה דגימות אוויר.
  11. למלא את הריאה הפתרון agarose/A-מדיה עד הריאות מלא הוא insufflated.
  12. ברגע הריאות מלא insufflated, הסר את הצינורית, תקשור בחוזקה הקשר כירורגית למניעת דליפה של הפתרון agarase/A-מדיה דרך קנה הנשימה.
  13. המשך שווייץ התעוזה (קנה הנשימה, הלב והריאות) מ בחלל החזה. לדאוג לא לנקב או נזק המשטח של הריאה.
  14. המקום התעוזה (בללא כיוון מסוים) ב- mL 30 מראש צוננת של PBS בתוספת עט X 1/דלקת, ולאפשר agarose/A-התקשורת לגבש כעשרים דקות.
  15. באמצעות מספריים בסדר, פינצטה, לחתוך חתיכות קטנות של הריאות (3 מ"מ x 1.5 מ"מ), כפי שמוצג באיור 1A. לפרוסות דקות ריאות יכול בקלות לדימות באמצעות מטרה X 2.5. פרוסות מרובות ניתן לחתוך לכל תנאי הניסוי, בדרך כלל 4-10 פרוסות לכל קבוצה.
    הערה: עבור כל קבוצה ניסיונית, מניחים את פרוסות ריאות לבאר נפרד (6-ובכן צלחת) המכיל בספוג ג'לטין 2 x 2 ס"מ מראש טבולים ב'-מדיה. כמות מדיה לכל טוב צריך להיות 1.5 מ. לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. ללימודים סמים, התדירות של שינוי המדיה/התרופה הוא משתמש נקבע.

3. Widefield זריחה הדמיה של הריאה פרוסות וניתוח

הערה: עבור זריחה widefield פרוסות הדמיה, קטן יותר, נחתכים (3 מ מ x 1.5 מ"מ x 1 מ"מ) על מנת להתאים את המקטע ריאות 1 תמונה באמצעות מטרה X 2.5.

ייבוא תמונות במיקרוסקופ זריחה widefield:

  1. בדרך כלל עם תמונה ריאות פרוסות-0, 3, 7 ו- 14 ימים לאחר ההזרקה. בסביבה סטרילית של הקבינט ביולוגי, בזהירות להעביר את הפרוסות ריאות של הג'לטין ספוגים כדי זכוכית סטריליים 35 מ מתחתון סביב צלחת. . שמור על עצמך אנגב את הנוזל העודף מן הפרוסה ריאות כמו עודפי הנוזלים כמראה, משקפים אור ניאון מגיע לתאי הגידול.
  2. לסדר את פרוסות הריאה באופן דומה מתואר באיור 1A. כל עמודה מייצגים תנאי הניסוי שונה. לטפל כדי לא לחצות-לזהם את הריאות עם הפינצטה. לשטוף עם 70% אתנול ויבש לפני טיפול ריאות פרוסות מקבוצת נסיוני נוסף.
  3. למטב את הפרמטרים הדמיה (כלומר. רווח, היסט, חשיפה זמן, binning) המספקת את הניגודיות הטובה ביותר בין תאים סרטניים פלורסנט רקמת הריאה הרקע של הפקד (הרכב לא מטופל) קבוצה. השתמש באותם פרמטרים מקבוצת הבקרה כדי תמונה הקבוצות ניסיוני. שמירת תמונה בתבנית tiff.
  4. הפניה סולם, לצלם תמונה דיגיטלית של מיקרומטר על אותה מטרה.
  5. מאז ריאות אוטומטי-זריחה משתנה לאורך זמן, הפרמטרים הדמיה התוקף שתישמר לריאות שליטה בכל מפגש הדמיה. הפרמטרים הדמיה לטיפול אחד לא יהיה בהכרח אופטימליים להפעלות הדמיה עוקבות.

ניתוח התמונה:
הערה: השלבים הבאים של עיבוד תמונה נעשים עם חבילת התוכנה של ImageJ 1.51h 17.

  1. לפתוח קובץ תמונה ב- ImageJ (איור 3 א).
  2. להחסיר רקע: תהליך > רקע לחסר > רדיוס הכדור מתגלגל (התחל עם 50 פיקסלים), בטל את הסימון של "אור רקע" (איור 3B).
  3. המרת התמונה לתבנית 8 סיביות: תמונה > סוג > 8 - bit (איור 3C).
  4. הגדר יחידות פיקסלים: תמונות > Enter "פיקסלים" יחידת אורך, הזן 1 "פיקסלים רוחב", "פיקסל גובה", "Voxel עומק". סמן תיבה "גלובל" כדי להחיל על תמונות עוקבות.
  5. באמצעות הכלי בחירה מצולע, במיתאר של הצורה של הפרוסה הריאה כולה וקובעים את האזור (פיקסל2) של הפרוסה הריאות הכולל. ערך זה ישמש כדי לחשב את נטל הגידול באחוזים של הריאה.
  6. סף תמונה: תמונות > התאם > הסף > לסמן "ברירת מחדל" ו- "B & W" > השתמש במחוון לסף התמונה כזה כי הרוב המכריע של תאים סרטניים מסומנים באופן מדויק. לחיצה על "החל" יביא תמונה שחור-לבן שבו הריאות היא שחורה לגמרי, הפצעים פלורסנט הן לבן (דמות תלת-ממד). הקשה שניה על "החל" יתהפכו התמונה כל המבנים פלורסנט איפה עכשיו צורות שחורות (איור 3E).
  7. כימות מספר וצורה של נגעים:
    לנתח > לקבוע מידות > בדיקת "האזור". בטל את הסימון של כל תיבות אחרות.
    לנתח חלקיקים > גודל (פיקסל2): 0-אינסוף מייצג את מגוון צורות ImageJ למנות. מדעית לקבוע הנגע הכי קטן זה כדין תא גידול יחיד בתמונות הרכב יום 0. להשתמש האזור של תא יחיד גידול זה הגבול התחתון לתמונות הנותרים בערכת הנתונים. עבור העבודה שהוצגו במאמר זה, פיקסל 112 מוגדרת בתור הגבול התחתון. עבור העבודה המוצג בדוגמה וידאו, פיקסל 242 מוגדרת בתור הגבול התחתון. להשאיר "מעגליות" בטווח 0-1. "הצג" ניתן להגדיר את "כלום". לחלופין, אם נבחר "הצג" ו- "מתאר", ציור של כל הצורות מחולקת לרמות נוצר. בדוק "הצג תוצאות" חלון נפרד של מדידות לצוץ. לחלופין, יש תיבת "הוספת מנהל" בדק יחסוך כל הצורות לכמת למנהל רועי, אשר ניתן לשמור לשימוש עתידי. לאחר לחיצה על אישור, יופיע חלון "תוצאות" המכיל את כל הצורות הממוספרות ומדידות השטח (איור 3F).
  8. העתק והדבק את הנתונים מן החלון "תוצאות" גיליון אלקטרוני. השתמש בפונקציה SUM מתמטיות ב- Excel כדי לסכם את כל האזורים של נגעים גרורתי את הפרוסה ריאות מסוים. כדי להעריך את נטל הגידול ריאות אחוז של הריאה פרוסה, לחלק את הסכום של האזורים של נגעים גרורתי על-ידי האזור הכולל של הפרוסה ריאות. פרמטר זה נקרא גם אזור השבר (A) אשר מתואר יותר על ידי אנדרווד 18.
    נטל גידול בריאה = סכום של הנגע גרורתי אזורים/סה כ שטח של הריאה פרוסה
  9. לחשב את נטל הגידול ריאות עבור שאר הסעיפים ריאות קבוצת הביקורת, נותרו קבוצות. להתוות את נטל הגידול הריאות הממוצע לכל קבוצה 0, 3, 7, 14 ימים. תמונות פלורסנט widefield נציג של גבוה ונמוך גרורתי תאים אנושיים OS גדל במודל פומה בנקודות זמן מתקדם מוצגים (איור 4A). קו גרף המציג את הקיפול-השינוי (מנורמל ליום 0) ב אחוז גידול גרורתי נטל לאורך זמן מוצג (איור 4B).

4. קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית הדמיה של המודל פומה

הערה: עבור הדמיה קונאפוקלית, ברקמה דומה לזה בסעיף הקודם חוץ מזה פרוסות ריאות גדולים נחתכים (מלאה רוחבי סעיפים, 1-2 מ מ עובי) כדי לאפשר יותר ROIs לדימות.

Labelling של parenchyma הריאה עם DAR4M:

  1. לטבול פרוסות ריאות ב 10 μμM של DAR4M (ב HBSS) למשך 45 דקות ב 37 º C. DAR4M תוויות חנקן ונבדקים מינים בתוך התאים של הריאה.
  2. אחרי 45 דקות של דגירה, לשטוף את הפרוסות ריאות עם HBSS טריים.
  3. מקם את הפרוסה ריאות 35 מ מ זכוכית-תחתון סביב צלחת, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי.
  4. הפרמטרים הדמיה לתמונות בדוגמה המוצגת באיור 5 מפורטים בטבלה5.
  5. רוכשים ערימה-Z עבור אזור של עניין. השתמש את עובי הפרוסה Z המוצע עבור הדגימה של נייקוויסט. סרט נציג במחסנית 3D מציג תאים OS ניאון ירוק בתוך רקמת הריאה התווית על-ידי DAR4M ניתנת סרט 1 ו- 1 סרט משלימה.

עבור תמונות קונאפוקלית בדוגמה המוצגת באיור5, הפעלת הדמיה היה חולה סופני אם נדרשת הדמיה האורך, השימוש של פוטון 2 או פוטון מרובה מאובזר LSM מיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה מומלץ משום שיש פחות נזקי חיים רקמות19,20.
הדמיה mito-RFP לביטוי MG63 תאים במודל פומה:

  1. לבצע את פרוטוקול פומה כמיתאר שלב 1 ו- 2 באמצעות תאים MG63 לבטא הבונה mito-RFP.
  2. מקם את הפרוסה ריאות 35 מ מ זכוכית-תחתון סביב צלחת, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי.
  3. הפרמטרים הדמיה לתמונות בדוגמה המוצגת באיור 6 רשומים לפי טבלה 6. סרט נציג במחסנית 3D מציג תאים OS ניאון ירוק אדום המיטוכונדריה פלורסנט מסופק סרט 2 ו- 2 סרט משלימה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ פלורסצנטיות ההגדלה נמוך widefield

עבור widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ של פומה ריאות פרוסות, להחליפן בתמונות, כימות הנתונים מוצגים באיור 2C, ואת דמות 4A ו- B. מספק שלעצמו גרורתי עבור שורות תאים גבוה ונמוך גרורתי ניכרים באופן חזותי על נקודות זמן מתקדמת. תאים MNNG יכול ליישב ביעילות רקמת הריאה ואילו תאים זונות לא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן מאמר טכני המתאר כמה היבטים מעשיים של המודל פומה בלימוד קולוניזציה ריאות ב- OS. כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול איפה החוקרים צריכים להיזהר במיוחד כוללות את הפעולות הבאות:

a) תעלות של חוליות הצוואר. יכול להיפגע בקלות אל קנה הנשימה תוך כדי לנתח את השרירים שמסביב ואת רקמת חיבור. בנוסף, להיות דחף את המחט של הקטטר בקלות דרך קנה הנשימה. שים לב עד כמה השיקוע של המחט נכנסת קנה הנשימה בעת הוספת את הצינורית.

b) תקר או פגיעה השטח של הריאה. הריאה ניתן בקלות ניקב או ניזוק עם לנת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ד ר Arnulfo מנדוזה שסיפק הכשרה בטכניקה פומה. בנוסף, ברצוננו להודות ד"ר צ'אנד Khanna, סוזן גארפילד (NCI/NIH), ואפריצ'יו סאם (סוכנות סרטן לפנה ס) על מתן השימוש שלהם מיקרוסקופים במהלך מחקר זה. מחקר זה נתמך (באופן חלקי) על-ידי התוכנית מחקר מגזר של מכוני הבריאות הלאומיים, במרכז לחקר הסרטן, סניף אונקולוגיה ילדים. M.M.L. נתמך על ידי מוסדות של בריאות מגזר ביקור עמית התכנית הלאומית (זוכה פרס 15335), כיום נתמכת על ידי מלגת פרקר ג'ואן בחקר גרורות. P.H.S. נתמך על ידי קרן סרטן קולומביה הבריטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>טבלה 2
<חזק>ריאגנטים לתרבית תאים עבור A-media, B-media ומדיה שלמה
MNNG-HOSATCCCRL-1547קו תאים גרורתי מאוד HOS
ATCCCRL-1543קו תאים גרורתי של מערכת הפעלה
MG63.3מעבדת איימי לבלנק (NCI)N/Aקו תאים מערכת הפעלה גרורתי מאוד
MG63ATCCCRL-1427קו תא מערכת הפעלה גרורתי
גרוע 10X M199 מדיהThermofisher11825015מדיה בסיסית עבור A-media ו-B-media
מים מזוקקים (מעוקרים)Thermofisher15230-147רכיב של A-media & B-media
7.5% תמיסת נתרן ביקרבונטThermofisher25080094רכיב של A-media & B-media
HydrocortizoneSigma-AlrichH6909רכיב של A-media & B-media
רטינול אצטט-מסיס במיםSigma-AlrichR0635-5MGרכיב של A-media & תמיסת B-media
פניצילין/סטרפטומיצין 10X מרוכזת (10000 יחידות / מ"ל)Thermofisher15140122רכיב של A-media & B-media, מדיה מלאה.
תמיסת אינסולין בקר (10 מ"ג/מ"ל)Sigma-AlrichI0516-5MLרכיב של A-media & B-media
DMEM, גלוקוז גבוהThermofisher11965092מדיה בסיסית של מדיה שלמה
L-גלוטמין (200 מ"מ)25030081Thermofisher של מדיה מלאה
סרום בקר עובריThermofisher16000044 רכיב של מדיה שלמה
Dulbecco' s Phosphate BufferedSalt Thermofisher14190144משמש בתרבית תאים.
האנק' s תמיסת מלחים חומציים, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםתרמופישר14175095משמש להשעיית כדור תאים לפני הזרקת
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםתרמופישר25200114משמש בתרבית תאים.
DAR4MEnzoALX-620-069-M001משמש לתיוג פרנכימת ריאות.
NameCompanyCatalog NumberComments
טבלה 3
חומרים עבור PuMA
Zeiss 710 Confocal LSMZeissN/Aזקוף LSM קונפוקלי מיקרוסקופ
Zeiss 780 קונפוקלי LSMZeissN / Aמיקרוסקופ קונפוקלי LSM הפוך
עכברי SCIDצ'ארלס ריברN/ANOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl, נקבה, גיל 6-8 שבועות
GelFoamמכשיר הרווארד59-9863משמש כתמיכה לקטעי רקמת ריאה.
SeaPlaque AgaroseLonza50100משמש במהלך אינפלציה של הריאה.
מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 מדFisherscientific14-826-87משמש להזרקת וריד זנב.
מזרק BD 10 מ"ל309604משמש לאינפלציה של הריאה.
קטטר 20 מדTerumoSR-OX2032CAמשמש במהלך אינפלציה של הריאה.
סט הארכה של Abbott IV (30 אינץ', סטרילי)Medisca8342משמש במהלך אינפלציה של הריאה.
ספוגיות אלכוהולBD326895לניגוב וריד הזנב לפני הזרקה
כפפות כירורגיות סטריליותFisherscientificמשתנה עם גודלמסירה ספקנית של ריאות עכבר
סרגל 30 ס"מסיכות המשמשותלאינפלציה של הריאה.
מעמד תמיכה לסרגלPipette.comHS29022Aמשמש לניפוח הריאות.
צלחת תרבית עם תחתית זכוכית 35 מ"מIbidi81158משמש במהלך הדמיה של פרוסות ריאה
רפידות תחתונות סופגות עם מחסום לחות עמיד למיםVWR56617-014משמש לציפוי אזור העבודה הסטרילי במכסה המנוע הביולוגי.
Catgut תפר נספג רגילבראוןN/Aמשמש לקשירת קנה הנשימה המשונר.
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>טבלה 4
<חזק>מכשירים כירורגיים עבור PuMA
מספריים חיתוך מיקרו 3.5 אינץ' ישר חד/חד רובוזRS-5910לחיתוך חלקי ריאה
4 אינץ' (10 ס"מ) ארוך משונן ישר עדין במיוחד 0.5 מ"מ קצהRobozRS-5132למניפולציה/החזקת חלקי ריאה.
4 אינץ' (10 ס"מ) עקומה קלה משוננת ארוכה 0.8 מ"מ קצהRobozRS5135למניפולציה/החזקת חלקי ריאה.
מלקחיים לחבישת אגודל; משונן; עדין; אורך 4.5 אינץ'; רוחב קצה 1.3 מ"מRobozRS-8120לדיסקציה כללית.
מלקחיים לתחבושת אגודל 4.5 אינץ' משוננים 2.2 מ"מ רוחב קצהRobozRS-8100לדיסקציה כללית.
מספריים מיקרו חיתוך עדינים במיוחד 3.5 אינץ' ישר חד / חד, להב 20 מ"מRobozRS-5880לדיסקציה כללית.
מספריים של Knapp; ישר; חד-בוטה; אורך להב 27 מ"מ; 4 אינץ' אורך כוללRobozRS-5960לדיסקציה כללית.
רכיב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
  2. Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
  3. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  4. Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
  5. Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
  6. Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
  7. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  8. Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
  9. Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
  10. Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
  11. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  12. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  13. El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
  14. MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
  15. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  16. Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
  19. Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
  20. Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
  21. Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  22. Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
  23. Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
  24. Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
  25. Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pulmonary Metastasis AssayOsteosarcoma Lung ColonizationMetastatic Osteosarcoma CellsLung MicroenvironmentFluorescence MicroscopyImage AnalysisConfocal MicroscopyWidefield MicroscopyLung Tissue PreparationTumor Cell Quantification

Related Articles