מאמר שיטה

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

DOI:

10.3791/56333

⸱

23 בנובמבר 2017

 , 
1Division of Hematology, Oncology and Blood and Marrow Transplantation, Department of Pediatrics, University of Southern California, 2The Saban Research Institute of Children's Hospital Los Angeles, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

siRNA בתיווך shRNA דפיקה למטה (KD) שיטות של ויסות גנים כלי יקר ערך להבנת תפקוד גנים וחלבונים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, במקרה כי KD של החלבון עניין השפעה קטלנית על תאים או ההשפעה הצפויה של KD שיטות KD תלויי-זמן, אהבה ללא תנאים אינם מתאימים. מערכות מותנה יותר המתאימים במקרים אלה, היה הנושא של עניין רב. אלה כוללים מערכות ביטוי Ecdysone-inducible, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ומוסדרת טטרציקלין מערכות ביטוי גנים.

טטרציקלין מוסדר ג'ין ביטוי המערכת מאפשרת שליטה הפיך על ביטוי חלבון באמצעות אינדוקציה של הביטוי shRNA בנוכחות טטרציקלין. פרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת ט'-על תפקודי בשורות תאים סרטניים אנושיים עבור בקרת מותנה גנים. ואז נדגים את השימוש במערכת זו במחקר של גידול התא-מונוציט אינטראקציה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגידול הקשורים מקרופאגים (תאמי) תורמים להתפתחות הגידול באמצעות קידום הגידול, גרורות, ויסות התגובה החיסונית2. סרטן תאי ומונוציטים דלקתיות מגויסת, אשר לחדור הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic3. חדירה של הגידול עם תאמי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן, נקשר את התפקיד לדיכוי המערכת החיסונית של מקרופאגים4,5. עם זאת, המנגנון של הגיוס של מקרופאגים לגידול לא נידונות טוב, הבנה טובה יותר של המסלולים המעורבים חיוני לקידום בהמשך השדה, טיפולים המבטיחים. אחד האתגרים ללמוד אינטראקציות בין תאים סרטניים ותאים רגילים ב microenvironment הגידול (טיים) הוא המורכבות של מנגנונים,....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המקטע פרוטוקול העושה שימוש אנושי ומונוציטים המתקבל מתנדבים בריאים עוקב אחר הקווים המנחים של הילדים החולים בלוס אנג'לס האנושי מחקר בועדת האתיקה, אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים תחת החומר האנושי פרוטוקול מספר: CCI 08-00208.

1. הכנת שורות תאים סרטן עם shRNA מוסדר טטרציקלין ביטוי

  1. שיבוט של shRNA פאי-1 לתוך ט-pLKO-פורו וקטור 8 , 9
    1. עיצוב oligomers shRNA המכילים גילואני לסביבהRI המחשוף באתר-בקצה 5', את רצף הגיוני, לולאה נוקלאוטיד 6, ואודות הרצף antisense.
      הערה: oligonucleotides טיפוסית מתוכננים כדלהלן: oligo קדימה: 5' CCGG - bp 19-21 ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלושה רצפים shRNA נבדקו עבור היעילה KD של פאי-1. בשביל זה, shRNA רצפים נגד פאי-1 ומקושקשת (טבלה 1) היו משובטים לתוך ט-pLKO-פורו ביטוי וקטור בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הקו תא fibrosarcoma HT-1080 היה stably transfected עם בונה שנוצר, התאים שטופלו דוקסילין למשך 3 ימים. הביטוי של פאי-1 אומתה על ידי המערבי סופג (איור 2A) ואת האינטנסיביות של הלהקות המתאים פאי-1 וטובולין נותחה על ידי densitometry. באמצעות הרצף KD היעיל ביותר (sh.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מורכבת של מגוון רחב של סוגי תאים, טיים חיוני להתפתחות של סרטן. לבירור תנאי הגידול האופטימלית, תאים סרטניים מושכים ומונוציטים באמצעות הפרשת גורמים chemotactic. כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון של גיוס מונוציט מאת גידול תאים במבחנה. למטרה זו, נעשה שימוש בשילוב של ג'ין inducible ביטוי במערכת, טיהור של ראשי ומונוציטים אנושי, כדוגמה וזמינותו הגירה, וזמינותו קאמרית בוידן.

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הציג הוא לאשר נכונות השיבוט של הרצף shRNA לתוך הווקטור ט-על, אשר תמיד צריך להיות מו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להכיר ז'קלין רוזנברג להגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי לנו מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של/לאומי מכוני הבריאות בעזרת מענק לך DeClerck (להעניק 5R01 CA 129377) ושל קרן מרטל. טי-ג'יי. MH Kubala היא זוכת פרס מחקר לאגודה לפיתוח הקריירה של מכון המחקר סבן-החולים בלוס אנג'לס לילדים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Tet-pLKO-puro וקטור לנטי-ויראליAddgene21915
FBS (ללא טטרציקלין)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep ערכת העשרת מונוציטים אנושייםStemCell19059
EasySep מגנטStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
לחתוך מאגר חכםNEBB7200S
EndoFree פלסמיד מקסי ערכתQiagen12362
PROMEGA Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCRPROMEGAA9281
psPAX וקטורAddgene12260
pMD2.G וקטורAddgene12259
One Shot Stbl3 מוכשר כימית E. coliThermo Fisher ScientificC737303
סט כתמים Hema 3 לפרוטוקול כתמים של רייט-גימסה123-869
תאי HEK293ATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
אנזים הגבלה XhoINEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M תמיסהתרמו פישר מדעיR1021
ליפופקטמין 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep מגנטתאי גזע18001
0.1% תמיסת פולי-L-ליזיןSigma-AldrichP8920
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ'S7670
נתרן בוטיראטסיגמא-אולדריץ'B5887
0.45 μ מסנני מזרק MVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 ק"ג
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
דיתיאוריתריטול (DTE)סיגמא-אולדריץ'B8255-5 גרם
אתנול (EtOH)סיגמא-אולדריץ'792780
טריפטוןאמרסקוJ859-500 גרם
תמצית שמריםפלוקה70161-500 גרם
בקטו אגרBD214010
אמפיציליןסיגמא-אולדריץ'A9393-5 גרם
דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)קורנינג10-013-CV
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)קורנינג21-031-CV
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)סיגמא-אולדריץ'H3375
פורומיציןסיגמא-אולדריץ'P9620
דוקסיציקלין היקלאטסיגמא-אולדריץ'D9891-25g
רוזוול מכון הזיכרון של פארק (RPMI)קורנינג10-040-CV
0.5 מ' EDTA pH 8.0תרמו פישר סיינטיפיקR1021
פלקון תמיכה חדירה לצלחת 24 בארות עם 8.0μ m ממברנה PET שקופהבקטון דיקינסון353097
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A7906
מוליך כותנה חבילת MedlineMDS202000
פרוטוקול Hema 3 STAT פישר סיינטיפיק123-869
לפתור שמן טבילה, צמיגות גבוההריצ'רד אלן סיינטיפיקM4004
פניצילין סטרפטומיציןג'יבקו15140122
חברת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A.....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Conditional KnockdownTet ON SystemGene ExpressionCancer Cell LinesMonocyte MigrationTumor MicroenvironmentWestern Blot AnalysisDensity Gradient CentrifugationBoyden Chamber AssayPAI 1 Protein

מאמרים קשורים