המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולות הפלישה והעברה של תאים סרטניים הם התורמים העיקריים התקדמות סרטן, מופע חוזר. מחקרים רבים בחנו את יכולות העברה ופלישה להבין איך להפיץ תאים סרטניים, במטרה לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות. ניתוח של הבסיס תאית ומולקולרית של היכולות הללו הוביל אפיון תא ניידות ואת המאפיינים physicochemical של שלד התא, microenvironment הסלולר. במשך שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה כבר הטכניקות רגיל ללמוד תא הפלישה והעברה. עם זאת, אלה שתי טכניקות יש מגבלות. וזמינותו קאמרית בוידן קשה וצורכת זמן, ויש וזמינותו פצע שריטה הפארמצבטית נמוכה. התפתחות הטכנולוגיות המודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, הגבירה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. באמצעות מערכות ניתוח רב-עוצמה, מיקרוסקופ וידאו "בחממה" יכול לשמש כדי לספק וניתוח אוטומטי בזמן אמת של נדידת תאים, הפלישה. מטרת מאמר זה היא לדווח ולהשוות את מבחני שני חקר התא הפלישה והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן וטיוטה אופטימיזציה במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ פצע וזמינותו.
מבוא
תא הפלישה והעברה מעורבים להפצת תאים סרטניים, אשר מהווה את הגורם העיקרי של התנגדות טיפול1 והוא יכול להוביל locoregional או הישנות גרורתי לאחר סרטן טיפול2. המעבר אפיתל-mesenchymal (החובשים) הוא התהליך הראשוני של הפלישה-נדידת תאים שבה סרטן תאים להחליף בין אפיתל הפנוטיפ mesenchymal. E-קדהרין הוא סמן חוץ-תאי של פנוטיפ אפיתל3, ביטוי מוגבר של N-קדהרין, vimentin היא תכונה של פנוטיפ mesenchymal4. ההעברה תלויה גם הקיבולת מהותי של תאים סרטניים לפלוש מטריצות (ECM) דרך הפעולה של מטריקס metalloproteases5.
מנגנון ההעברה – הפלישה זה תואר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: מבחני לשכת ולגרד בוידן ללא הכללת ECM מכונים וזמינותו ההעברה, מבחני אותו באמצעות ECM נחשבת וזמינותו הפלישה.
1. בוידן קאמרית Assay
הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם הקו תא SQ20B, אשר נגזר חוזרים ונשנים הראש, הצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) סרטן בגרון היה המתקבלים ג'ון הקטן (בוסטון, שמימנה).
יום 1
-
תא זריעה
- זרע 2 106 SQ20B תאי ב 12 מ של תרבות בינוני (ס מ) בקבוקון2 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
- כדי להתכונן ס מ SQ20B תאים, תוספת בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM) ....
- זרע 2 106 SQ20B תאי ב 12 מ של תרבות בינוני (ס מ) בקבוקון2 175 ס' ' מ 72 h לפני היום הראשון ולאפשר לתאים לגדול 80% תא הנהרות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
. מדווחים כאן שתי שיטות שונות כדי לנתח תא הפלישה והעברה. איור 1 מציג בוידן קאמרית הניסוי. התוספות ממוקמים בתוך צלחת לוויה chemoattractant בינונית, התאים הם נזרע בס מ. הקרום יכול להיות ניטראלית (העברה assay) או מצופה (הפלישה assay). התאים הם נזרע לתא העליון ב- s-ס"מ. תא תחתון מלא ס מ כמו chemoattractant. התאים קבועים לפני הזמן ההכפלה.
איור 2 מציג את הקרום בוידן לאחר קיבו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
. מדווחים כאן שתי שיטות שונות ללמוד הפלישה תא את תהליך ההעברה. הניתוח של תהליך זה חשוב להבנת הגורמים המעורבים הישנות גרורתי, אשר יכול להיות מוסבר על ידי תנועתיות מוגברת subpopulation של תאים סרטניים נקרא סרטן בתאי גזע10,11.
הניסוי קאמרית בוידן היא אחת הנפוצות ביותר בשימוש בטכניקות לחקור תא הפלישה והעברה. אחד היתרונות של גישה זו אמנם הפארמצבטית שלה, טכניקה זו תלויה מאוד המומחיות של הנסיין. תא ספירה ידנית, יכול להשתנות בין ניסויים. חייב .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
טכניקות אלה פותחו עם התמיכה של LabEx הראשוניים (ANR-11-LABX-0063), תוכנית Contrat-הינוממוקם-אזור (CPER) במסגרת מדעי אטואל (CPER 2009-2013), לירית גרנט האינקה-DGOS-4664.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרום עגל עוברי Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| הידרוקורטיזון מסיס במים | סיגמא-אולדריץ | ' H0396-100MG | |
| פניצילין/סטרפטומיצין 100 X | דומיניק דוטשר | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 תערובת אגוזים (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | יש להכין את התמיסה ממש לפני השימוש מכיוון שהיא מאוד לא יציבה |
| חלקיק קולטר Z1 | בקמן קולטר | 6605698 | |
| מיקרוסקופ אופטי | אולימפוס | CKX31 | |
| SQ20B | מתנה מג'ון ליטל' s Laboratory-Wound | ||
| Maker | Essen Bioscience | 4494 | אחסן במקום בטוח ויבש |
| 96 בארות ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| מערכת CoolBox 96F עם CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox עם מערכת M30 | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | דומיניק דאצ'ר | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store ב -20 & deg; C |
| Companion 24 בארות צלחת | דומיניק דאצ'ר | 353504 | |
| BD Matrigel סטנדרטי | BD BioScience | BD 354234 | חנות ב -20°C. |
| ערכת צביעה RAL 555 | RAL Diagnostics | 361550 | אחסן במקום בטוח ויבש |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf | 33511 |
מקורות
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
