מאמר שיטה

פרוטוקול בשלב אחד עבור הערכת המצב של מוות של תאים Clonogenic קרינה הנגרמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

DOI:

10.3791/56338

⸱

23 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Gunma University Graduate School of Medicine, 2Advanced Scientific Research Leaders Development Unit, Gunma University Graduate School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר על קרינה מייננת (IR)-מוות של תאים clonogenic המושרה חשוב להבנת השפעת IR על גידולים ממאירים ורקמות נורמלי. כאן, אנו מתארים וזמינותו של צעד אחד לשם הערכת המצבים העיקריים של מוות של תאים clonogenic IR-induced בהתבסס על המורפולוגיה של 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)-צבעונית גרעינים דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר על קרינה מייננת (IR)-מוות של תאים clonogenic המושרה חשוב להבנת השפעת IR על גידולים ממאירים ורקמות נורמלי. כאן, אנו מתארים וזמינותו בשלב אחד מהירה וחסכונית להערכת דרכי מוות של תאים clonogenic הנגרמת על ידי אינפרא-אדום, קרי, אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בו זמנית. בשיטה זו, תאים גדל על מכסה מוקרן עם צילומי רנטגן, מוכתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי). באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר מזוהים על סמך את מורפולוגיות האופיינית של גרעינים שהוכתמו דאפי. אפופטוזיס נקבעת על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים להיפגע (קרי, גרעין האטום מרוכז ומתפרקת). קטסטרופה mitotic נקבעת על ידי הנוכחות של הגרעינים כי התערוכה שניים או יותר האונות נפרדות, micronuclei. הזדקנות ביולוגית הסלולר נקבעת על ידי הנוכחות של הזדקנות ביולוגית-הקשורים heterochromatic מוקדים (קרי, DNA גרעיני המכיל 30-50 בהיר, צפופה מוקדים). גישה זו מאפשרת הנסיין על המסך בקלות עבור clonogenic תא מוות מצבי שימוש שונים שורות תאים, טיפול הגדרות, ו/או נקודות זמן, עם המטרה של שחקרתי את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי הריבית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרינה מייננת (IR) גורם מספר מצבי clonogenic של מוות של תאים. מחקר על מוות של תאים clonogenic IR-induced חשוב להבנת הרעילות של IR רקמות רגילה, כמו גם לפתח שיטות כדי להגדיל את יעילות הטיפול של הקרנות סרטן. אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות תאית ביולוגית הם המצבים העיקריים של מוות של תאים clonogenic הנגרמת על-ידי אינפרא-אדום1. אפופטוזיס הוא מצב מוסדר של מוות של תאים זה הוא שיזם DNA נזק1. קטסטרופה mitotic היא מוות של תאים המתרחשת עקב חריגה מיטוזה הנובע DNA לא מתוקן כפול-strand מעברי1. הזדקנות ביולוגית הסלולר מוגדרת כמצב של צמיחה בלתי הפיך לתא מעצר2; שימו לב כי הזדקנות ביולוגית הסלולר אינה מוות תאי כשלעצמה, אבל זה מצב של מוות של תאים clonogenic בגלל זה מבטל את הישרדות clonogenic של התא senescent.

מבחני מבוססת תא שונים פותחו כדי להעריך באופן אינדיבידואלי אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר. אפופטוזיס יכול להיות מוערך על ידי טרמינל deoxynucleotidyl טרנספראז dUTP ניק-end תיוג (TUNEL) מכתים, annexin V מכתים, מבחני פרגמנטציה של ה-DNA ונחישות sub-G1 מחזור התא שלב cytometry זרימה1. קטסטרופה mitotic יכול להיות מוערך על ידי immunofluorescence מכתים לסמני mitotic, כולל MPM2, TUNEL מכתים מיקרוסקופ אלקטרונים1. הזדקנות ביולוגית הסלולר יכול להיות מוערך על ידי צביעת הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), מבחני צמיחה-מעצרו ו מיקרוסקופ אלקטרונים1. חשוב לציין, מצב הדומיננטית של מוות של תאים clonogenic שונה בין שורות תאים וטיפול-הגדרות-3,-4. לכן, להבהיר לפרופיל הכללי של מוות של תאים clonogenic עבור סביבה נסיוני נתון, מספר מבחני המכסה את כל המצבים הללו של מוות שחייבת להתנהל ביחד, וזו העבודה ואת עלות-עתירי.

במאמר זה, אנו מתארים וזמינותו בשלב אחד מהירה וחסכונית להערכת בו-זמנית אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הסלולר הזדקנות ביולוגית הנגרמת על ידי IR3,4. בשיטה זו, תאים גדל על מכסה מוקרן עם צילומי רנטגן, מוכתם 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי). באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר אחד מזוהים על סמך את מורפולוגיות האופיינית בהתאמה של גרעינים שהוכתמו דאפי. גישה זו תהיה שימושית עבור יישומים כולל הקרנה של clonogenic תא מוות פרופילים שונים שורות תאים, טיפול והגדרות נקודות זמן, במטרה לחקור את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי ריבית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של חומרים

  1. גולשת מכסה אוטוקלב.
    1. מקום שער גולשת גביע זכוכית-
    2. מכסים את גביע זכוכית עם נייר כסף-
    3. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס ב 15 psi במשך 20 דק.
    4. יבש בחנות 50 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר בשכונה תרבות.
  2. להכין פתרון קיבעון: paraformaldehyde 3% + 2% סוכרוז בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
    1. לבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להוסיף 700 מ"ל PBS ו 30 g paraformaldehyde.
      התראה: Paraformaldehyde הוא מאכל, ללבוש כפפות מתאימות.
    2. Paraformaldehyde התמוססות לחלוטין על ידי חימום עד 80 ° C באמצעות מיקרוגל.
      התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים, לעטות מסכה.
    3. להשאיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    4. להוסיף 20 גרם סוכרוז.
    5. PBS להוסיף כדי להפוך את אמצעי האחסון הכולל 1 ל'
      6. צינורות
    6. aliquot ב 50 מ. פתרון קיבוע ניתן לאחסן במשך 3 שנים ב-20 ° C או במשך 3 חודשים ב-4 מעלות צלזיוס

2. הכנת תרבית תאים

הערה: יש לבצע הליכים אלה בשכונה תרבות.

U2OS
  1. התרבות ומעבר אוסטאוסרקומה האנושי לתאים לשמור על גידול לוגריתמי 5.
    הערה: סוגי תאים אחרים ניתן להשתמש לאחר קביעת המינון הקרנה אופטימלית.
  2. נגב איזמל עם מגבות נייר לחלח עם 70% אתנול. באמצעות את האזמל, במקום מכסה לצלחת תרבות תא 35 מ מ (להלן פשוט לייב " המנה ").
    הערה: המספר של שער גולשת בצלחת אחת ניתן להגדיל על פי ניסיוני עיצוב (ראה דיון).
  3. להוסיף 1 mL תרבות המדיה: DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית.
    הערה: מדיה אחרים ניתן להשתמש בהתאם לסוג התא שבחרת.
    4. מלקחיים
  4. לנגב עם מגבונים לחלח עם 70% אתנול. בעדינות עם המלקחיים, החזק המרכז של תגית כיסוי. האחות התקשורת תרבות מתוך קערה לחלוטין, תוך שמירה על אחיזה על תגית כיסוי.
    ​ הערה: שלב זה מקדם את הנייח של תגית כיסוי לצלחת.
  5. ניתוק תאים בתרבית חסיד באמצעות טריפסין 5.
    1. מחוק לגמרי תרבות המדיה מן המנה.
    2. להוסיף 1 מ"ל PBS וללחוץ בעדינות את המנה.
    3. תשאף PBS מתוך קערה.
    4. להוסיף טריפסין 1 מ"ל [0.25w/v% EDTA טריפסין-1mmol/L] למנה.
    5. Incubate עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2.
    6. להוסיף מדיה תרבות 9 מ למנה.
    7. באמצעות micropipette μL של 1000, להכין השעיה החד-תאיים.
  6. לספור תאים 5.
    1. בשפופרת 1.5 mL, להוסיף 0.9 מ ל 0.1 מ"ל 0.4% וצמודי תא Trypan Blue פתרון.
    2. 10 החל μL אל hemocytometer.
    3. לבחון המספר מוכתם (קרי, בשידור חי) התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה-פאזי-
  7. בשפופרת 15 מ"ל, להכין 3 מ"ל ההשעיה תא תרבות בתקשורת על צפיפות של 0.5 x 10 5 תאים למ"ל.
    הערה: תא צפיפות שניתן לשנותם על פי ניסיוני צריך (ראה דיון).
  8. בעדינות מוסיפים 2 מ"ל של התליה תא למנה.
  9. Incubate בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2.

3. הקרנה

זהירות: לטפל את רנטגן בעוצמה בקפידה על פי היצרן ' הוראות s.

  1. לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה-פאזי. לאשר התאים מחוברים כדי להחליק את הכיסוי וחי.
  2. להאיר את המנה עם צילומי רנטגן Gy 6 (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 מא).
  3. Incubate עבור 72 h ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2.
    הערה: זמן הדגירה שניתן לשנותם על פי ניסיוני עיצוב (ראה דיון).

4. קיבוע

  1. מחוק לגמרי תרבות המדיה מן המנה.
  2. באמצעות מספריים, חותכים את קצה micropipette 1,000 μL עצה 5 מ מ מהקצה.
    הערה: הטיפ לחתוך עוזר ליישם בצורה חלקה את הפתרון קיבעון.
  3. בעזרת הטיפ לחתוך, להוסיף 1 מ"ל פתרון קיבעון (להכין בשלב 1.2) למנה מן הקיר בצד של המנה.
    הערה: שלב זה זמן רגיש, ולכן יש לבצעו ללא שינוי micropipette עצות בעת טיפול בדגימות מרובות. יישום של פתרון קיבוע ישירות לתחתית של המנה עלולה לגרום נזק לתאים.
  4. מקום המנה לצלחת תרבות מרובע. לנער את המנה תרבות מרובע בעדינות כדי להפיץ את הפתרון קיבוע מעל תגית כיסוי אחיד.
  5. Incubate 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. פתרון קיבוע מחוק לגמרי מתוך קערה.
  7. להוסיף 2 מ של PBS המנה מתוך הקיר בצד של המנה.
    הערה: יישום של PBS ישירות על החלק התחתון של המנה עלולה לגרום נזק לתאים.
  8. תשאף PBS מתוך קערה.
    9. חזור על שלבים 4.7 ו- 4.8 פעמיים
  9. .
    הערה: המנה ניתן לאחסן במשך שבוע ב 4 ° C עם כיסוי פתקי. ההימורים התרחץ באור 2 מ"ל PBS.

5. דאפי מכתים

  1. כדי שקופיות זכוכית, החל 5 μL 1 μg/mL דאפי מכתים ריאגנט.
    הערה: דאפי מכתים ריאגנט יציב במשך 6 חודשים כאשר הוא מאוחסן מוגן מפני אור או תחתיו-20 ° C.
  2. באמצעות אזמל, הסר תגית כיסוי המנה.
  3. להרחיק את עודף PBS על תגית כיסוי על ידי לגעת בקצה של תגית לכסות עם מגבת נייר.
  4. הר בתגית המכסה הפוך על גבי הירידה של דאפי מכתים מגיב על הזכוכית שקופית כך התאים נחשפים דאפי מכתים ריאגנט.
    הערה: השלב זה הרגיש. ייבוש של דאפי צביעת ריאגנט יכול להוביל מכתים שיוצרת.
  5. הדגימות ניתן לאחסן 1 שנה ב-20 מעלות צלזיוס

6. תמונה רכישת

  1. לבחון הדגימה על מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. הגרעינים הם visualized באמצעות המסנן דאפי.
    הערה: גם 20 X 60 X עדשה שמן ניתן להשתמש או, על פי החוקר ' s ריבית. כאשר משתמשים בעדשה שמן X 60, הוסף טיפה אחת של שמן על גבי בתגית כיסוי. להיזהר כי הדגימות אל תיגע העדשה; אחרת, העדשה עלולים להיפגע.
  2. לרכוש תמונות של גרעינים באמצעות מצלמת CCD תמונה דיגיטלית רכישת תוכנה עם הפרמטרים וההגדרות הבאות: מסנן דאפי, תמונות טפט, רווח של 1 X וחשיפה אוטומטית.
  3. סיום תמונה רכישה: לנגב 20 X עדשה עם מגבות נייר לחלח עם עדשה מנקה. לנגב את 60 X עדשה שמן עם מגבות נייר לחלח עם הכלורופורם.

7. הערכה של מצב מוות של תאים Clonogenic

  1. בתמונות שנבחרו באקראי, לספור את מספר גרעינים העונים על הקריטריונים אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic של הזדקנות ביולוגית הסלולר עד המספר הכולל של גרעינים שנספרו מגיע 300. לבצע שלב זה דולר עבור כל הגדרה ניסיוני.
    1. לקריטריונים אפופטוזיס: נוכחות של מוות גופים (קרי, גרעין האטום מרוכז ומתפרקת) 6 , 7.
    2. קריטריונים עבור קטסטרופה mitotic: נוכחות של גרעינים מציג שתי האונות נפרדות או micronuclei 8 , 9 , 10-
    3. קריטריונים עבור הזדקנות ביולוגית הסלולר: נוכחות של הזדקנות ביולוגית-הקשורים מוקדים heterochromatic (SAHF) (קרי, DNA גרעיני המכיל 30-50 בהיר, צפופה foci) 2 , 11-

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לדוגמה, תאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS היו מטופלים עם צילומי רנטגן Gy 6, מתפשט על 72 h, נתון את דאפי מכתים assay לפי הפרוטוקול. איור 1 מציג תמונות מוגדלת עבור מורפולוגיות גרעינית טיפוסית המשויך אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר שהושג באמצעות עדשה שמן 60 ×. עיין 7.1.1-7.1.3 השלבים עבור מורפולוגיות אופיינית עבור כל מצב של מוות של תאים clonogenic. איור 2 מציג תמונות סקירה של גרעינים שהושג באמצעות עדשה X 20. הקרנה עם צילומי רנטגן Gy 6 המושרה mitotic קטסטרופה לעתים קרובות אפופטוזיס בתדירות נמוכה יותר, הסלולר הזדקנות ביולוגית לעיתים רחוקות. באופן זה, בדיקה על שדה נמוך ההגדלה מאפשרת אחד לעצור במבט חטוף את התמונה הכוללת של הפרופיל מוות תא clonogenic באווירה ניסיונית נתון. איור 3 מראה ייצוג גרפי של הנתונים כימות.

figure-results-1
איור 1: הגדלת תצוגת תמונות של גרעינים שהוכתמו דאפי מראה אופייני מורפולוגיות של אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic הסלולר הזדקנות ביולוגית. U2OS התאים היו מוקרן עם צילומי רנטגן Gy 6. לאחר 72 h, התאים היו קבועים, מוכתם דאפי. תמונות גרעיני נרכשו באמצעות 60 X עדשה שמן. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: סקירה על תמונות של דאפי שהוכתמו הגרעינים של תאים שטופלו צילומי הרנטגן. U2OS התאים היו מוקרן עם צילומי רנטגן Gy 6 או מוקרן מעושה. לאחר 72 h, התאים היו קבועים, מוכתם דאפי. תמונות של גרעינים נרכשו באמצעות עדשה X 20. חוגים, אפופטוזיס; חיצים, mitotic קטסטרופה. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: כימות הנתונים אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic של הזדקנות ביולוגית הסלולר המושרה בתאי מטופלים עם צילומי הרנטגן. U2OS התאים היו מוקרן עם צילומי רנטגן Gy 6 או מוקרן מעושה. לאחר 72 h, התאים היו קבועים, מוכתם דאפי. תמונות של גרעינים נרכשו באמצעות עדשה X 20. משדות אקראי, סך של 300 גרעינים הוערכו אפופטוזיס (Ap), mitotic קטסטרופה (MC) של הסלולר הזדקנות ביולוגית (Sns). ההערכות בוצעו דולר. ממוצע של ערכים מוצגים, וציין קווי שגיאה סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, תאים צריך לגדול על המנה תרבות כמו טפט כי ביצוע הערכה מורפולוגית של גרעינים שהוכתמו דאפי קשה עבור תאים מרובה שכבות. למטרה זו, בשלב 2.9, מומלץ להעביר זהיר של המנה תרבות לאינקובטור; רעד של המנה תרבות יוצר מערבולת של תאים מושעה שמוביל הריכוז של תאים במרכז המנה תרבות. בנוסף, יש להימנע overconfluence המוביל לתאים מרובה שכבות. למטרה זו, בשלב 2.7, מספר התאים נזרע על המנה תרבות יכול להיות שונה בהתבסס על האוכלוסייה מכפילה את מרווח הזמן בין הקרנה קיבוע וזמן. זרימה של 80 בזמנו של קיבעון מומלץ. שנית, מהירות חשוב הקיבעון, דאפי מכתים (קרי, שלבים 4 ו- 5). חוסר עקביות בין דוגמה לגבי הזמן שנדרשו עבור השלבים יכול להוביל הטרוגניות בעוצמת האות דאפי בתוך האטום, אשר יטשטש את ההערכה מורפולוגי.

בשלב 2.2, ניתן להגדיל את מספר שער גולשת בקערה תרבות; מספר מרבי של ארבע שער גולשת ניתן להניח בקערה 35 מ מ, המספר יכול להיות גדל עוד יותר באמצעות מנות גדולות יותר. הצבת מספר שער גולשת בכל צלחת תרבות מאפשרת את הפעולה יעיל של הזמן קורס הערכה לטיפול נתון (קרי, השער מתעודות משלוח ניתן לאסוף מתוך תרבות קערה אחת בנקודות זמן מרובים עניין).

בשלב 3.2, ניתן לשנות את המינון הקרנה לפי ריבית החוקרים. היישום מינון עקבי שורות תאים מרובים מאפשר השוואת רגישות כל מצב של מוות של תאים clonogenic בין הקווים התא. מצד שני, השימוש של מינונים הישרדות iso-clonogenic עבור כל קו תא מאפשרת השוואה של פרופילים מוות תא clonogenic בין הקווים התא. המינון הישרדות iso-clonogenic יכול להיקבע על ידי וזמינותו להישרדות12clonogenic. הערך10 D, מינון מספק 10% clonogenic הישרדות, היא נקודת קצה של נפוצות עבור המנה הישרדות iso-clonogenic.

בשלב 3.3, הזמן של הקרנה קיבוע ניתן לשנות לפי ריבית החוקרים; זה חשוב כי הזמן. השיא IR-induced אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic של הזדקנות ביולוגית הסלולר משתנה על פי שורת התאים וטיפול. במאמר זה, השתמשנו 72 h לאחר הקרנה כנקודת זמן זה יהיה שימושי ביותר עבור ההקרנה הראשונית clonogenic תא מוות הפרופילים, בהתבסס על מחקרים רבים על ידי הקבוצה שלנו ותיאר אחרים כדלקמן1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-induced אפופטוזיס בתאים נוצרו מגידולים מוצקים בעיקר מתרחשת כמה ימים לאחר הקרנה. (ii) X-ray-induced קטסטרופה mitotic בתאי סרטן מתרחשת בולטת השנייה או השלישית מיטוזה לאחר שחרורו מן המעצר זמני מחזור התא המושרה על ידי הקרנה. השחרור מתרחשת בדרך כלל כ- 24 שעות לאחר הקרנה, ולאחר מכן על-ידי mitoses חוזרות ונשנות במרווחים של 24 ח' (iii) X-ray-induced הזדקנות ביולוגית הסלולר הופך לברור לאחר מרווח זמן תלוי שורת התאים המדובר: 2 ימים לאחר הקרנה על כמה מקרים מוקדם, ו 7 ימים לאחר הקרנה עבור רוב שורות תאים. לאחר קבלת תמונה כוללת של התא clonogenic מוות פרופילים של ההקרנה הראשונית, זמן הקורס ניסויים תספק הבהרה מפורטת יותר של הזמן. השיא עבור כל מצב של מוות של תאים clonogenic שורת תאים מסוים ו/או תנאי עניין4.

יצוין, כי דאפי מכתים assay ואת וזמינותו להישרדות clonogenic, שיטה תקן הזהב להערכת רגישות לקרינה, אינם ניתנים להחלפה. אפופטוזיס ולאסון mitotic רק להימשך שעות. לפיכך, דאפי מכתים assay עבור נקודת זמן נתון מזהה ואפופטוזיס ו mitotic קטסטרופה המתרחשת בנקודת הזמן של המבדק. מצד שני, התוצאות של הישרדות clonogenic assay בזמן נתון נקודת לכלול את הסכום הכולל של אפופטוזיס ועל mitotic האסון שהתרחש בזמן תקופת הדגירה של בדרך כלל 10-14 ימים לאחר הקרנה. שונה מן אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic, התאים senescent להישאר על המנה תרבות; הם להצטבר בהדרגה לאורך זמן לאחר הקרנה. לכן, התוצאות של שניהם דאפי מכתים assay ואת וזמינותו להישרדות clonogenic משקפים את הסכום הכולל של הזדקנות ביולוגית שאירעו במהלך תקופת הדגירה. חשוב לציין, שחלקן של אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הנגרמת על ידי הקרנה משתנה מאוד לפי תא במינון קו והקרנה. יחדיו, באופן תיאורטי, התוצאות של assay אחד יכול להיתרגם ישירות לאלה של אחרים וזמינותו.

דאפי מכתים assay יש מספר מגבלות. קודם כל, זה נשאר שנוי במחלוקת אם אסון mitotic הוא מצב מובהק של מוות של תאים. בתחום של קרינה הביולוגיה, קטסטרופה mitotic נחשב מצב הגדולות הנוצרות על-ידי אינפרא-אדום של מוות של תאים זה נבדל מנגנונים אחרים של מוות של תאים clonogenic1. מצד שני, אחרים טוענים שאותו אסון mitotic אינה מצב מובהק של מות תאים אלא דווקא תהליך המופיע לפני מות תאים כולל13,של אפופטוזיס ועל נמק-14. לפיכך, אפופטוזיס ולאסון mitotic ייתכן חופפים במידה מסוימת. השני, הקודם מחקרים מראים כי הזדקנות ביולוגית הסלולר יכול להתרחש בהיעדר SAHF כמה שורות תאים וטיפול הגדרות2. -מבחני הנוכחי, שתוכנן במיוחד עבור כל תא clonogenic מצב המוות אמור לשמש כדי להגביר את היציבות של המסקנות של ניסוי נתון. שלישית, דאפי מכתים assay לא יכול להעריך מצבים של מוות של תאים clonogenic שאינם אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic או הסלולר הזדקנות ביולוגית (למשל, נמק, autophagy). רביעית, השירות של דאפי מכתים assay כמנבאת גידול בתגובה הקרנות יש לא כבר מבואר במרפאה. מנקודת המבט הזו, וזמינותו להישרדות clonogenic, הבודק את הסכום הכולל של מוות של תאים clonogenic, עדיפה דאפי מכתים assay כי מתאם הקימה בין SF2, השבר ששרד של תאים מוקרן עם 2 Gy צילומי רנטגן, וגם התגובה הגידול הקרנות15. עם זאת, ראוי לציין כי וזמינותו להישרדות clonogenic לא מנוצל באופן נרחב במרפאה, בעיקר בשל הדרישה רמה גבוהה של מומחיות, תקופה ארוכה של זמן (כלומר, 14 ימים) עבור רכישת נתונים. לשם השוואה, ההליך דאפי מכתים assay פשוט יותר, לוקח באופן משמעותי פחות זמן, כ 3-4 ימים, כדי להפיק תוצאות. השירות של ההכתמה דאפיassay כמנבאת גידול בתגובה הקרנות ייבדק במרפאה בעתיד הקרוב.

לסיכום, דאפי מכתים assay הוא הנועד חסכונית בשלב אחד בו זמנית להעריך שלושה מצבים עיקריים של מוות של תאים clonogenic IR-induced. גישה זו מאפשרת על המסך בקלות עבור המצבים של מוות של תאים clonogenic שורות תאים שונים, טיפול הגדרות של נקודות זמן, עם המטרה של שחקרתי את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי הריבית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים גברת אקיקו Shibata לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid מ משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן לתוכניות המובילות בוגר בתי הספר, טיפוח מנהיגי הכללית הרפוי יון כבדים, הנדסת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תלוש כיסוימטסונאמיC013001
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'P6148-1KG
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'84097-250G
מי מלח חוצץ פוספטCosmo Bio16232000
אזמלקאי רפואימס' 20, 520-A
צלחת תרבית תאים 35 מ"מפלקון
trypsinWako201-16945
מיקרוסקופ פאזה הפוכהShimazu114-909
רדיאטור רנטגןFaxitron ביופטיקהFaxitron RX-650
צלחת תרבות מרובעתקורנינג431110
זכוכית שקופיותMatsunamiPro-11
מגיבצביעה DAPIאיתות תאים8961S
מיקרוסקופ פלואורסצנטיNikonECLIPSE מיקרוסקופ
מסנן DAPINikonU-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
עדשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (20&)Nikon20X/0.75
(60&, שמן)NikonPlan Apo λ 60X/1.40 שמן
שמן OlympusN5218600
מצלמת CCDNikonDS-Qi2
תוכנה לרכישת תמונות דיגיטליותNikonNIS-Elements מנקה
אולימפוסOT0552
כלורופורםוואקו035-02616
353001 פלואורסצנטי Ni Plan Apo λ עדשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עדשות מסמכים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588(2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121(2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950(2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DAPIescence

מאמרים קשורים