לכימות מיקרואורגניזמים בריכוזים נמוכים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)

Manuel Bedrossian; Casey Barr; Chris A. Lindensmith; Kenneth Nealson; Jay L. Nadeau

doi:10.3791/56343

Method Article

לכימות מיקרואורגניזמים בריכוזים נמוכים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)

DOI:

10.3791/56343

⸱

November 1st, 2017

Manuel Bedrossian¹ , Casey Barr² , Chris A. Lindensmith³ , Kenneth Nealson² , Jay L. Nadeau¹

¹Department of Medical Engineering, California Institute of Technology, ²Department of Earth Sciences, University of Southern California, ³Jet Propulsion Laboratory, California Institute of Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) היא טכניקה הנפחי המאפשרת הדמיה דגימות ש-50-100 X עבה יותר brightfield מיקרוסקופ ברזולוציה דומות, עם התמקדות ביצע עיבוד דפוס. כאן סוג התושבות שלהם מופיעים משמש לזיהוי, סופר, ומעקב מיקרואורגניזמים-מאוד נמוך צפיפות לעומת מדידות צפיפות אופטית צלחת ספירה, ספירה ישירה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי וספירת דגימות בקטריאליות דליל במדויק היא נדבך מזון ומשקאות, תעשיות התרופות עיבוד, בתוכנית האבחון הרפואי, ועל גילוי החיים על ידי משימות רובוטיות אחרות כוכבי לכת, ירחים של מערכת השמש. כיום, דגימות בקטריאליות דליל נספרים על ידי מיקרוסקופ ציפוי או epifluorescence תרבות. תרבות צלחות דורשים זמן דגירה פעמים (ימים עד שבועות), ודורש מיקרוסקופ epifluorescence מכתים נרחב וריכוז של המדגם. . הנה, נדגים כיצד להשתמש מהציר דיגיטלי מיקרוסקופ הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים) כדי ספירת חיידקים בתרבויות שתדללו מאוד (100-10⁴ תאים/mL). ראשית, נדון הקמת סוג התושבות שלהם מופיעים מותאם אישית, יחד עם הוראות מפורטות על בניית כלי נגינה בעלות נמוכה. העקרונות של הולוגרפיה נידונות, ומשמשת מודל סטטיסטי כדי להעריך כמה זמן צריך קטעי וידאו ניתן לזהות תאים, בהתבסס על מאפייני ביצועים אופטיים של המכשיר ועל הריכוז של הפתרון חיידקי (טבלה 2) . זיהוי וידאו של תאים ב-10⁵, 10⁴, 10³ותאים למ"ל 100 הוכח בזמן אמת באמצעות הולוגרמות האו ם המשוחזרת. שחזור של משרעת ותמונות שלב הוא הפגין באמצעות חבילת תוכנות קוד פתוח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנחישות של ספירת חיידקים מדויק בדגימות שתדללו מאוד חיוני ביישומים רבים: כמה דוגמאות מים ומזון באיכות ניתוח¹^,²^,³; זיהוי של פתוגנים דם, נוזל מוחי שדרתי או sputum⁴^,⁵; ייצור של מוצרים פרמצבטיים, כולל במים סטריליים⁶; וניתוח סביבתי קהילתי בסביבות oligotrophic כגון פתוח האוקיינוס ואת משקעים⁷^,⁸^,⁹. גם גוברת ההתעניינות גילוי החיים מיקרוביאלי אפשרי הקיימים על הירחים הקפואים של יופיטר ושבתאי, במיוחד Europa

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. וצמיחה של ספירה של חיידקים

הערה: זה חל על כמעט כל זן חיידקי גדל בינונית המתאימה ³⁶. בדוגמה שלנו, אנו משתמשים שלושה זנים: בסרישיה marcescens כמו זן נפוץ, קל לזיהוי המעבדה; קטן יותר, מאוד תאי סביבתיים זן, מר Shewanella oneidensis-1. כדי להשוות בין גילוי של תאי לעומת בתאים שאינם תאי, שאינם תאי מוטציה Shewanella, Δ FlgM, משמשת גם השוואה ³⁷. כל הזנים גדלים מרק lysogeny (LB).

הכן אמצעי סטרילי ליברות (לליטר מים מזוקקים: 10 גרם מה נשארתי טריפטון, 5 g מה נשארתי שמרים, 10 גרם NaCl; מסנן או אוטוקלב). להכין סטנדרטי 100 מ מ קוטר LB-אגר צלחות (באותו מתכון בינוני פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות צריך לציין את היכולת לזהות חיידקים חי וגם מת ברמות נמוכות מאוד על ידי סוג התושבות שלהם מופיעים. מספר החיידקים נספרים צריך להיות עקבי עם התוצאות המתקבלות באמצעות Petroff-האוזר הספירה קאמרית וצלחת הסעיפים. שיטות סטטיסטיות סטנדרטי לספק מידע על הדיוק של שיטות זיהוי שונה בריכוזים שונים חיידקי.

איור 1 מראה לחדר הספירה Petroff-Hausser משמש גם מיקרו לשכת הספירה המשמש בספירה ישירה של תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחזור המספרי של הולוגרמות: את שיקומה המספרי של הולוגרמות, משמשת השיטה ספקטרום זוויתי (ASM). פעולה זו כרוכה קונבולוציה של ההולוגרמה עם פונקציית גרין עבור סוג התושבות שלהם מופיעים. ניתן לחשב את חזית גל מורכבים של התמונה-מטוס מוקד מסוים על ידי העסקת את משפט קונבולוציה פורייה כדלקמן:

figure-discussion-1 (1)

איפה figure-discussion-2 הוא האופרטור טרנספורם פורייה,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים להכיר את גורדון ואת בטי מור קרן מענקים 4037 4038 אל המכון הטכנולוגי של קליפורניה למימון העבודה הזאת.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto שמרים	BD Biosciences	212750
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich	7710	אפשרויות רבות לרכישה
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
10 ס"מ צלחות פטרי	VWR	10053-704
15 מ"ל צינורות תרבית	בז ( Corning Life Sciences)	352002
תא פטרוף-האוזר	עם מכסה רופף מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	3920
מזרקים 10 מ"ל	BD Biosciences	309604	קצה Luer-Lok אינו הכרחי
זכר Luer ל-1/16 אינץ' התאמת דוקרנים	McMaster-Carr	51525K291
ניתן לחיטוי 1/16 אינץ' תעודת זהות צינורות PVC לזרימה	Nalgene	8000-0004	נמכר לפי אורך, רכוש בהתאם
משאבת מזרק	מכשיר הרווארד	PHD 2000
תא מדגם	מותאם אישית	n/a	ראה סעיף חומרים
מיקרוסקופ הולוגרפי	מותאם אישית	n/a	ראה וואלאס ואחרים.
תוכנת קוד פתוח	https://github.com/bmorris3/shampoo		מותאמים אישית

רופף

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akineden, O., Weirich, S., Abdulmawjood, A., Failing, K., Buelte, M. Application of a Fluorescence Microscopy Technique for Detecting Viable Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Cells in Milk. Food Anal. Methods. 8, 499-506 (2015).
Deibl, J., Paulsen, P., Bauer, F. Rapid enumeration of total aerobic microbial counts on meat and in meat products by means of the direct epifluorescence filter technique. Wien Tierarztl Monat. 85, 327-333 (1998).
Huang, J., Li, Y., Slavik, M. F., Tao, Y., Huff, G. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

לכימות מיקרואורגניזמים בריכוזים נמוכים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles