מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד axenic בקנה מידה גדול ואוסף של miracidia free-swimming של הלוויתן דם אנושי עלקת הבילהרציה mansoni ועיבוד עוקבות שלהם עבור מבוא לתרבות במבחנה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה
במאמר זה
סיכום
תקציר
פספוסים דם אנושי, עלקת הבילהרציה spp., יש מחזור חיים מורכב שמערב שלבים התפתחותיים אל-זוויגית, מיניות בתוך השבלול ביניים, יונקים הסופי מארח, בהתאמה. היכולת לבודד ולקיים את שלבי מחזור החיים שונים בתנאים תרבות ' במבחנה הנחתה במידה רבה את חקירות של המנגנונים הסלולר, הביוכימי והמולקולרי ויסות טפיל צמיחה, פיתוח, מארח אינטראקציות. שידור של בילהרציה דורש רבייה אל-זוויגית ופיתוח של שלבים רבים זחל בתוך שבלול המארח; מ miracidium זיהומיות, דרך sporocysts ראשיים ומשניים, ועד השלב הסופי cercarial זה מסוגל להזיק לבני. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור המוני הבקיעה ובידוד של עלקת הבילהרציה mansoni miracidia מביצים המתקבל הכבדים של עכברים נגועים, מבוא עוקבות שלהם לתוך התרבות במבחנה . הוא צפוי כי פרוטוקול מפורט יעודד חוקרים חדשים לעסוק ולהרחיב שדה חשוב זה של מחקר schistosome.
מבוא
האדם דם spp. עלקת הבילהרציה פספוסים, הסוכנים סיבתי של בילהרציה, מחלה טרופית מוזנח מתעצמת משוער 230 מיליון בני אדם ברחבי העולם1. המין הנפוץ ביותר, עלקת הבילהרציה mansoni, מופץ גיאוגרפית בדרום אמריקה, האיים הקריביים, המזרח התיכון, אפריקה לסהרה2. מחזור החיים של S. mansoni, ו schistosomes אחרים, היא מורכבת, מעורבים שורה מהווים הסופית יונקים ו חלזונות מים מתוקים של הסוג Biomphalaria המשמשים כפונדקאים ביניים בלבד.
S. mansoni מבוגר זכר ונקבה תולעת זוגות המתגוררים וורידי מצע המעי העליון האחורי להתרבות בתרבית של המארח, וכתוצאה מכך שחרורו של embryonated ביציו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון תחת פרוטוקול אין. V005717. להלן כללי התנהגות כרוך עובד במתקן אבטחה ברמה 2 (BSL2) עבור האדם פתוגנים, אף אחד השלבים schistosome מצטיירת פרוטוקול זה אמנם זיהומיות בני אדם או יונקים אחרים. בצע את מדיניות מוסדית לטיפול פתוגנים האנושי הסיכון קבוצה 2 (RG2).
הערה: אנו משתמשים הנשי עכברים שוויצרי-וובסטר (6 - בן שבועיים) עקב הרגישות שלהם גבוה יותר זיהום10, ובכך מניב בנטל ביצה גדולה יותר. טאקר. et al. תאר את הפרוטוקולים זיהום עכבר וחילזון המשמשים את מערכת דגם11. טבלה ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הרוב המכריע של miracidia בדרך כלל שנאסף ב- "יבולים" שני הראשונים. דגירה של מבודדים miracidia ב CBSS + מפעיל על תהליך הטרנספורמציה miracidium-אל-sporocyst (איור 4A- C). בתוך שעה הראשונה העברה הבא לתרבות בארות המכיל CBSS +, הרוב המכריע של miracidia הפסקת שחייה (איור 4A). ב- 6-אייץ ' בתרבות, miracidia בעיצומו של פעיל ששפך צלחות אפידרמיס ciliated שלהם (איור 4B). חופפת התהליך שפיכת, הזחלי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Miracidia של S. mansoni, מבודד ולמניפולציה כמתואר להלן, יכול להדביק רק חילזון המארח ביניים, ולכן אינם מייצגים הביולוגי האנושי במהלך שלב זה של התפתחות הזחל. עם זאת, כדי למנוע חשיפה מקרית/זיהום של חלזונות, להקפיד לבצע miracidial ומשום במיקום שונה מאזורים שבו רגישים מינים חילזון Biomphalaria עשוי להיות נוכח או מתוחזקים. חדר נפרד, רשום כמרחב BSL2, מומלץ בחום. בנוסף, לשטוף כל פתרונות שימוש בעיבוד של כבדי ובידוד זחל צריכים להיות מטופלים עם חומר חיטוי (למשל, 1% מלבין) לפני סילוק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לעורכים יש דבר לחשוף.
תודות
מומן בחלקו על ידי מענק-NIH RO1AI015503. עכברים נגועים schistosome נמסרו על ידי המרכז משאב NIAID בילהרציה מכון המחקר הביו-רפואי (Rockville, MD) דרך NIH-NIAID חוזה HHSN272201000005I להפצה באמצעות משאבים BEI.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>תמיסת מלח מאוזנת של צ'רנין (CBSS+) | <חזק>עבור 1 ליטר תמיסה | ||
| 2.8 גרם נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | S271-3 | ממיסים מלחים, למעט סידן כלורי, ו |
| 0.15 גרם אשלגן כלורי | Sigma-Aldrich | P5405 | ב-800 מ"ל ddH2O |
| 0.07 גרם נתרן פוספט, דו-בסיסי נטול מים | Fisher Scientific | S374-500 | ממיסים סידן כלורי בנפרד ב-200 |
| 0.45 גרם מגנזיום גופרתי heptahydrate | סיגמא-אולדריץ' | M1880 | מ"ל ddH2O |
| 0.53 גרם סידן כלוריד דיהידרט | Mallinckrodt | 4160 | מוסיפים לאט לאט סולן סידן לסולן המלח/סוכר עם |
| 0.05 גרם נתרן ביקרבונט | פישר סיינטיפיק | S233-3 | עם ערבוב קבוע |
| 1 גרם גלוקוז | MP ביומדיקל | 152527 | להתאים ל-pH 7.2 ולעקר מסנן באמצעות a |
| 1 גרם טרהלוז | Sigma-Aldrich | T0167 | 0.22 ומיקרו; m מסנן בקבוק חד פעמי |
| 10 מ"ל 100X פניצילין/סטרפטומיצין | Hyclone | SV30010 | הוסף פניצילין מסונן וסטרפטומיצין soln שימוש קודם |
| <חזק>Bge בינוני (Ibge) | <חזק>לתמיסה של 900 מ"ל | ||
| 220 מ"ל שניידר' s Drosophila בינוני שונה | Lonza | 04-351Q | ערבב את המדיום של שניידר עם 680 מ"ל ddH2O |
| 4.5 גרם הידרוליזט אנזימטי לקטאלבומין | Sigma-Aldrich | L9010 | הוסף הידרוליזט לקטאלבומין וגלקטוז |
| 1.3 גרם גלקטוז | Sigma-Aldrich | G0625 | התאם ל-pH 7.2 ועקר מסנן באמצעות 0.22 ומיקרו; m מסנן בקבוק חד פעמי מעוקר מראש |
| <חזק>מדיום Bge שלם (cBge) | <חזק>עבור 100 מ"ל תמיסה | ||
| 90 מ"ל מדיום | לביטול חום FBS: דגירה FBS מופשר ב | ||
| 9 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) (אופטימה) | Atlanta Biologicals | S12450 | אמבט מים ב-60&80; C למשך שעה בעדינות |
| 1 מ"ל 100X פניצילין/סטרפטומיצין | Hyclone | SV30010 | לסובב את הבקבוק כל 10 דקות Aliquot FBS מומת בחום לתוך צינורות של 15 מ"ל ולאחסן ב-20°C. מערבבים מסנן בינוני + FBS ו מעקרים באמצעות 0.22 & מיקרו; M מעוקר מראש מסנן בקבוק חד פעמי הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לפני השימוש |
| <חזק>מי בריכה (תמיסת מלאי) | <חזק>1 ליטר של תמיסת מלאי | ||
| 12.5 גרם סידן פחמתי | Fisher Scientific | C64-500 | מערבבים את כל המלחים ב-1 ליטר של ddH2O |
| 1.25 גרם מגנזיום קרבונט | Fisher Scientific | M27-500 | שימו לב שהמלחים לא יהיו לגמרי |
| 1.25 גרם נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | S271-3 | מומס. יש לנער נמרצות כדי להשהות |
| 0.25 גרם מלחי אשלגן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | P5405 | לפני הכנת הסולן העובד |
| <חזק>מי בריכה (תמיסת עבודה) | <חזק>1.5 ליטר תמיסה | ||
| 0.8 מ"ל תמיסת מלאי מי בריכה (לנער לפני שימוש) ב | מערבבים ציר ל-ddH2O | ||
| 1500 מ"ל של ddH2O | מעקרים את מי הבריכה על ידי חיטוי (איטי מחזור) | ||
| 1.5 מ"ל של 100X פניצילין/סטרפטומיצין | Hyclone | SV30010 | הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לשימוש קודם |
| <תמיסת מלח חזקה>(1.2% NaCl) | <חזק>1.5 ליטר תמיסה | ||
| 18 גרם נתרן כלורי ב-1500 מ"ל של תמיסת מלח DDH2O | Fisher Scientific | S271-3 | Autoclave לעיקור |
| 1.5 מ"ל של 100X פניצילין/סטרפטומיצין | Hyclone | SV30010 | הוסף פניצילין וסטרפטומיצין לשימוש קודם |
| <חזק>ציוד וחומר נוסף: | |||
| 7-ליטר תא | בעקבות פרוטוקול IACUC מאושר מס' V001551 | ||
| עכברים | Taconic Biosciences | Swiss-Webster, נקבה, בת 6 שבועות, מורין | |
| CO2 מיכל ווסת | צלחת | ||
| תרבית רקמות 24 בארות | TPP | 92424 | |
| צלוחיות | |||
| מקור אור (150W) | Chiu Tech Corp | דגם F0-150 | |
| צנטריפוגה, מקוררת, דלי מתנדנד | צנטריפוגה אפנדורף | דגם 5810R | |
| בקבוקים (250 מ"ל) | Nalgene | ||
| 15 מ"ל, | קורנינג | 430053 | |
| צינורות העברה חד פעמיים סטריליים | פישר סיינטיפיק | 1371120 | |
| 0.22 ומיקרו; מסנן בקבוק חד פעמי מעוקר מראש | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| בלנדר נירוסטה | Waring | מסחרי דגם 51BL31 | |
| בלנדר, קיבולת 100 מ"ל | Waring מסחרי | ||
| מיקרוסקופ תרכובת הפוך | Nikon Instruments | ליקוי חמה של TE300 |
מקורות
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
