הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56391

⸱

1 ביוני 2018

 ,  , 
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

תקציר

תאי גזע עובריים (ES) יש את היכולת להבדיל בין לכל אחת משלוש שכבות הנבט (האנדודרם, והמזודרם או האאקטודרם), ניתן להפיק שושלות רבות עבור רפואה רגנרטיבית. ES תא תרבות במבחנה כבר זמן רב בנושא חששות נרחבת. באופן קלאסי, העכבר ES תאים נשמרים בסרום ו לוקמיה מעכבות פקטור (LIF)-המכיל בינוני. עם זאת, בתנאים סרום/LIF, תאים להראות הטרוגניות מורפולוגיה, לפרופיל ביטוי של גנים הקשורים pluripotency, בעיקר במצב והשלמת. יתר על כן, בתרבית תאים ES התערוכה הכללית hypermethylation, אך נאיבי ES תאים של התא הפנימי מסה (ICM), בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) במצב של hypomethylation העולמית. מדינת hypomethylated ICM, PGCs קשורה קשר הדוק pluripotency שלהם. כדי לשפר את העכבר ES תא תרבות שיטות, לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה המבוססת על ניצול סלקטיבי משולב של שתי תרכובות מולקולה קטנה כדי לשמור על המדינה hypomethylated ו pluripotent הדנ א. כאן, אנו מציגים את הטיפול שיתוף של ויטמין C (Vc), PD0325901 יכול למחוק כ 90% 5-methylcytosine (5mC) ב 5 ימים העכבר ES תאים. התוכן שנוצר 5mC דומה לזו של PGCs. החקירה מכניסטית מראה כי PD0325901 up-מווסת את הביטוי Prdm14 לדכא את Dnmt3b (de novo דנ א methyltransferase), Dnmt3l (קופקטור של Dnmt3b), על-ידי הפחתת סינתזה 5mC de novo . Vc מקלה את ההמרה של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בעיקר על ידי Tet1, Tet2, המציין את מעורבותם של demethylations ה-DNA פסיביים ואקטיביים. יתר על כן, בתנאים Vc/PD0325901, העכבר ES תאים מראים pluripotent המדינה ומורפולוגיה הומוגנית. באופן קולקטיבי, אנו מציעים הרומן ושיטת כימית-סינרגיה תרבות להשגת DNA hypomethylation ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים. השיטה תלויי-כימית מולקולה קטנה מתגבר את החסרונות העיקריים של התרבות סרום, מביאות הבטחה לייצר הומוגניות תאים ES עבור יישומים קליניים נוספים מחקרים.

מבוא

ES תאים שמקורם את ICM של הבלסטוציסט1. התאים נמצאים במצב pluripotency והוא יכול ליצור כל שושלות הסומטית, תאים germline2. הקמת תאים ES מספק ההזדמנות לחקור את ההתפתחות תהליכי במבחנה ניתן להפיק תאים של הרלוונטיות רפואי עבור רפואה רגנרטיבית בהתבסס על שלהם pluripotency3.

שתי קבוצות seminally נוסדה הקווים תא העכבר ES בשנת 1981, כאשר תאים שמקורם העובר העכבר בתחילת היו תרבותי בנסיוב שור עוברית (FBS)-המכיל בינוני עם העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מזין שכבה1,4 . MEFs היו לא פעיל mitotically, גדלו מראש במנות לפני culturing תאים ES. MEFs מספקים תמיכה עבור העכבר ES תא מצורף ומפיקים גורמי גדילה כדי לקדם את הפצת ותרסן את הבידול5, בעוד FBS מציעה גורמים עם מחלות חיוניות והורמונים עבור התפשטות תאים. מחקרים מאוחרים יותר ציין כי LIF המיוצר על ידי תאי מזין היה ציטוקין מפתח התחדשות עצמית ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים, התוספת של LIF לתוך האמצעי יכול תחליף מזין תאים6. כיום, התפרסות של העכבר ES התאים FBS/LIF בינוני-מזיני הוא עדיין השיטה הרגילה שאומצה על ידי חוקרים רבים. עם זאת, כמה בעיות עולות מתוך תפיסה זו התרבות הקלאסית. ראשית, מזין התאים מפרישים גורמי עודף בלתי מבוקרת, עלול לגרום זיהום פתוגניים7. כדי למנוע הפרעה זו, ציפוי המשטח של מנות עם ג'לטין ותוספת של LIF בסרום המכיל בינוני הן שיטות אלטרנטיביות לשמירה על העכבר ES תאים ללא תאים בשכבה מזין. בנוסף, העכבר ES התאים גדלו בתנאים סרום/LIF התערוכה מורפולוגי הטרוגניות אוכלוסיית תאים, אפילו ברמת הביטוי של גורמים הקשורים pluripotency8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי בתנאים סרום/LIF, גורמי שעתוק הקשורות pluripotency הליבה (כולל SOX2, Nanog ו- OCT4) יכול לקיים את pluripotency דרך LIF ונ ט איתות; עם זאת, ראוי לציין, הם גם מפעילים אות פיברובלסט גורם הגדילה (FGF) כדי לעורר בידול8. עקב פעולה כפולה אמביוולנטי גורמי שעתוק הליבה, העכבר ES תאים בתרבית בנסיוב מציגים הטרוגניות, בהיקף של שתי האוכלוסיות להחלפה, אחד דומה ICM ועוד הדומה המדינה כאשר הבחינה epiblast8. יתר על כן, העכבר ES תאים בנסיוב לעתים קרובות להפגין hypermethylation העולמי9, בעוד ICM ו- PGCs הם במצב hypomethylated הכללית, אשר קשורה קשר הדוק שלהם9,pluripotency10.

יש ביקוש רב לפתח שיטות חדשות culturing העכבר ES תאים. מספר פרוטוקולים משופרת הוקמו מאז 200311 אבל שם ממשיך להיות כמה מגבלות, חסרונות7. מאז 2008, ניצול בשילוב של שני מעכבי קינאז מולקולה קטנה, PD0325901 (החומר המדכא של חלבון mitogen מופעל (MAPK) / חוץ-תאית-אות-מוסדר קינאז (טיפשה) (MEK)), CHIR99021 (המדכא של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3)), N2ב'27 בינוני עם LIF ובלי סרום פתחה אופקים חדשים עבור culturing העכבר ES תאים12. בינוני מוגדר החדש מאופיין על ידי שימוש שני מעכבי (2i). העכבר ES התאים תרבותי במדיום 2i/LIF הם הומוגנית אוכלוסיות התאים ואת הביטוי של גורמים pluripotency. בנוסף, העכבר 2i/LIF-תרבותי ' ES תאים התערוכה DNA hypomethylation ברחבי העולם, אשר קרובה יותר תאים דמויי ICM9,13. למרות זאת, תרבות 2i יש החסרונות. PD0325901, CHIR99021 אינם מסיסים במים, בדרך כלל הם מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-מבוסס מניות פתרון כדי להוסיף אותם תרבות בינוני. מחקרים הראו כי לטווח ארוך, חשיפה במינון נמוך של תאים דימתיל סולפוקסיד יכול להוביל cytotoxicity14.

כאן, אנחנו מנוצל שתי תרכובות מולקולה קטנה פיתחה שיטה תרבות חדשה של העכבר ES תאים. שיטת תרבות הרומן משלב Vc מעכב MEK PD0325901 כדי לקדם את ה-DNA hypomethylation במהירות, ביעילות לרמה המקבילה של PGC, בשם פרוטוקול culturing Vc/PD0325901. העכבר ES התאים Vc/PD0325901-נוסף בינוני המכילים סרום התערוכה עניי מורפולוגיה, מתקיימים במצב הקרקע. בהשוואה ל- 2i תרבות, העכבר ES התאים תרבותי בתנאים Vc/PD0325901 שהפגינו קינטיקה מהירה יותר של ה-DNA demethylation, יכול להגיע לרמה hypomethylation לזו של PGC. בנוסף, השימוש מעכב יחיד (PD0325901) מפחית את כמות דימתיל סולפוקסיד. קלט לתוך בינוני בהשוואה בשימוש 2i (PD0325901/CHIR99021) ומפחית את הנזק לתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכשירים

  1. היכונו פתרון של 1.0 מ מ PD0325901 (מעכב MEK) ו- 3.0 מ מ CHIR99021 (מעכב GSK3).
    1. שוקל 2 מ ג של PD0325901 ולהוסיף 4.15 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
    2. שוקל 2 מ ג של CHIR99021 ולהוסיף 1.43 מיליליטר דימתיל סולפוקסיד ב בקבוקון זכוכית ענבר.
    3. שיחזור הבאים, לאחסן aliquots (50 µL/צינור ב 200 µL המבחנות) ב-20 ° C, מוגן מפני אור. הסר את שפופרת המכילה את המניה קפואים במקפיא, להפשיר בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  2. שוקל 0.0176 גר' Vc לתוך 1 מ"ל של שפופרת צנטרפוגה, לשקם אותו עם 1 מ"ל מים סטריליים ריכוז סופי של 100 מ מ לפני השימוש.
  3. הפוך ללא פעיל FBS: דגירה 500 מ"ל של FBS באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. היכונו culturing העכבר ES תאים 600 מ של מדיום בסיסי.
    1. השתמש בקבוק של DMEM/גבוהה גלוקוז בינוני (500 mL) והסר 40 מ.
    2. תוספת 460 מ של DMEM/גבוהה בינונית גלוקוז עם 20% לא פעיל FBS (120 מ ל), 1,000 LIF U/mL (60 µL של פתרון מניות U/mL7 10), מ מ 0.1 שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA) (6 מ"ל של פתרון מניות 10 מ מ), 1 מ מ נתרן פירובט (6 מ"ל של פתרון מניות 100 מ מ) , 2 מ מגלוטמין (6 מ"ל של פתרון מניות 200 מ"מ), מ מ 0.1 β-mercaptoethanol (600 µL של פתרון מניות 100 מ מ), ואת 33 IU/mL פניצילין µg/mL 33 סטרפטומיצין (2 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין מעורב פתרון (פניצילין 10,000 IU/mL ו- 10,000 סטרפטומיצין µg/mL)) . להגדיר את המדיום בסיסיים כמו סרום בינוני.
    3. פיפטה 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ) ו- Vc (100 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר 1.0 PD0325901 ו 100 מיקרומטר Vc), ולהגדיר את המדיום כמו Vc/PD0325901 בינונית.
      הערה: להכין Vc/PD0325901 הטרייה בינונית לפני השימוש עקב חוסר היציבות של Vc.
    4. באמצעות פיפטה של, להעביר 50 µL של פתרון מניות של PD0325901 (1.0 מ מ), CHIR99021 (3.0 מ מ), בהתאמה, לתוך 50 מ של המדיום סרום (הריכוז הסופי: מיקרומטר PD0325901 1.0 ו- CHIR99021 3.0 מיקרומטר), ולהגדיר את המדיום כמו 2i בינוני.
  5. להכין את הכלים מצופים ג'לטין.
    1. להכין את הפתרון ג'לטין 0.1%: להמיס 0.3 גרם ג'לטין לתוך 300 מ ל מים הנדסה גנטית בתוך בקבוק ריאגנט זכוכית עם כובע ולחטא ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס מינימלית 20 לחנות את פתרון סטרילי בטמפרטורת החדר.
    2. דגירה המנות התרבות התא (קוטר 6 ס"מ) עם 2 מ של 0.1% פתרון ג'לטין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז האחות הג'לטין. יבש את הכלים אוויר ולהשתמש בהם בתוך 12 שעות.
  6. הכינו 10 מ"ל של העכבר ES תא הקפאה במדיום שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל: 90% FBS (9 מ ל) ו- 10% דימתיל סולפוקסיד (1 מ"ל). השתמש המדיום בתוך יום אחד.
  7. להכין מיכל ההקפאה: להוסיף 100% אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא, ולמחוק את האלכוהול איזופרופיל הישן. להוסיף אלכוהול איזופרופיל חדש ישירות לאחר כל שימוש החמישי.
  8. להפוך את המאגר עיכול אנזימטי: שוקלים 1.2114 גר' אבקה טריס לתוך 100 מ של מים הנדסה גנטית כדי להכין 100 מ מ פתרון טריס ולהוסיף מרוכז פתרון HCl (כ- 12 מ') בתוך תמיסת טריס כדי להתאים את ה-pH ל 7.6 (בערך 0.6 מ"ל של תמיסה HCl מרוכזת).
  9. הכנת 50 מ של רדיו immunoprecipitation assay מאגר (מאגר ריפה): 20 מ מ טריס, pH 7.4, 1 מ MgCl2, 150 מ מ NaCl, 20% גליצרול, 0.5% NP40, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA. תוספת עם 1 מ DTT, 1 X מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 1 מ מ PMSF לפני השימוש. פעם נוספת את PMSF, להשתמש המאגר תוך 30 דקות.

2. לגדול העכבר ES תאים על מנות מצופים ג'לטין

  1. חם מראש העכבר ES תאים (סוג הפרוע, 129 SvEv) תרבות בינוני טריפסין, פתרון פוספט buffered (PBS) באמבט מים בטמפרטורה 37 º c
  2. המעבר את התאים. האחות המדיום לחלוטין מן המנה פיפטה 2 מ של PBS לשטוף הכלים לשטוף את התאים.
    1. להסיר את PBS עם פיפטה ולשטוף את התאים שוב עם 2 מ"ל ל- PBS.
    2. הסר את PBS ולהוסיף mL 0.3 של טריפסין-EDTA (0.25%) כל מנה.
    3. מכסים את כל טריפסין במהירות ולאחר מכן הסר אותו באופן מיידי.
    4. הכניסו את המנה אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה לנתק את התאים מתוך קערה. להוציא את הכלים מן החממה ולהוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת בינוני כדי לסיים את הפעולה של טריפסין.
    5. מביצועם המושבות תא להשעיה תא בודד על-ידי resuspending עם פיפטה (tip פיפטה 5 מ"ל) 10 פעמים.
  3. להעביר µL 150 של 2 מ של הפתרון הסלולרי (כ- 190,000 תאים על ידי ספירת עם hemocytometer) לתוך תבשיל חדש מצופים ג'לטין, להשלים עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים לכל מאכל תרבות 6 ס מ. התרבות התאים חממה 37 ° C עם 5% CO2.
  4. כל 24 שעות ביממה תוך המקננת, להסיר את המדיום התרבות הישנה ולהוסיף 3 מ"ל של טרי Vc/PD0325901-בינוניים לתוך המנה תרבות עקב חוסר היציבות של Vc. מצפה 70 – 80% confluency לאחר 2-3 ימים.
  5. כשמגיעים 70-80% confluency, המעבר את התאים ולהמשיך תרבות אותן כמתואר בצעדים 2.2-2.4.

3. הקפאה והפשרה העכבר ES תאים

  1. להקפיא העכבר ES תאים.
    1. ניתוק התאים מתוך מבחר המאכלים עם טריפסין צעד בעקבות 2.2.
    2. העבר את התאים לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל צנטריפוגה-800 x g ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    3. זורק את תגובת שיקוע בעדינות לתוך גביע, resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל של טריות בינוני מקפיא. הכינו את המקפיא בינוני 30 דקות לפני שלב זה על מנת להבטיח כי זה בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    4. העברת תאי הקפאה בינוניים עד צינור microcentrifuge מ ל 1.8 עם פיפטה 1 מ"ל ולמקם את הצינור microcentrifuge לתוך מיכל ההקפאה. להוסיף אלכוהול איזופרופיל לקו המילוי של המיכל מקפיא ולשמור אותו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    5. להשאיר את מיכלי הקפאה בן לילה במקפיא-80 ° C.
    6. העברת הצינורות microcentrifuge מיכל חנקן נוזלי עד 2-3 שנים.
      הערה: לא לשמור תאים המדיום קפוא במשך הרבה זמן, מהר להעביר את התאים מקפיא-80 ° C בשל הרעילות של דימתיל סולפוקסיד.
  2. הפשרת העכבר ES תאים.
    1. לחמם 50 מ של סרום בינוני באמבט מים 37 º C.
    2. להוציא בקבוקון המכיל תאים מהגורם המכיל חנקן נוזלי, לטבול את המבחנה רצ'ט באמבט מים 37 º C. לנער את זה במהירות באמבט מים להפשיר. העבר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל עם פיפטה 1 מ"ל. להוסיף 2 מ של סרום מראש ומחוממת תרבות בינוני לתוך צינור כדי לדלל את המדיום קופא, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
    3. הסר את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend כדורי תא עם 3 מ"ל של מדיום Vc/PD0325901 טריים באמצעות פיפטה 5 מ.
    4. להעביר את התאים מהצינור 15 מ"ל מאכל מצופה ג'לטין, התרבות התאים עבור ה 24 התרבות התאים שוב כפי שמתואר בשלב 2.

4. לחלץ את החלבון הכולל של תאים

  1. לשטוף את התאים שנאספו מ ל 1 ל- PBS, ואז צנטריפוגה-g 800 x ובטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ביסודיות באמצעות מאגר ריפה בתוספת עם DTT, מעכבי פרוטאז קוקטייל PMSF pipetting בעדינות. אמצעי האחסון ריפה המאגר נמצא כ 5 x זה של התא גלולה.
    הערה: לבצע את resuspension תא על קרח.
  3. שמור את התאים במאגר ריפה במשך 30 דקות על קרח, צנטריפוגה ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. להעביר את תגובת שיקוע צינור ולאחסן aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. לקבוע את הריכוז של החלבון עם ערכת וזמינותו של חלבון ברדפורד.

5. לחלץ את הדנ א מן התאים תקציר DNA לתוך נוקלאוטיד יחיד באמצעות אנזימים

  1. לאסוף את התאים עם טריפסין כפי שתואר בשלבים 3.1.1 ו- 3.1.2.
  2. לבצע את החילוץ DNA עם ערכת טיהור DNA גנומי ההוראות של היצרן.
  3. אחסן את ה-DNA שחולץ צינורות 1-mL צנטריפוגה. להוסיף 100 µL של הנדסה גנטית מים לתוך הצינור צנטריפוגה, לפזר את ה-DNA על-ידי pipetting כ 15 פעמים. לקבוע את הריכוז ולהעריך את איכות ה-DNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm ו- 280 ננומטר15. ריכוז הדנ א הוא כ-500 ng/µL.
  4. µG 5 תקציר של ה-DNA במערכת פתרון 50 µL: להוסיף µL 5 מ"מ טריס-HCl פתרון, pH 7.6 (הריכוז הסופי: 10 מ מ), 2 U עגל פוספטאז במעי, 1 U DNase אני, 0.005 U נחש ארס phosphodiesterase, 5 µg של ה-DNA (לחשב את עוצמת הקול שנוספו על-פי measu ריכוז ה-DNA אדום, µL ~ 10) לתוך צנטריפוגה צינור להגביר עוצמת הקול של פתרון µL 50 עם מים הנדסה גנטית. דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Centrifuge הפתרון DNA מעוכל-1000 g ובטמפרטורת החדר במשך 1 דקה לאסוף את הפתרון לחלק התחתון של צינורות.
  5. להעביר את פתרון ה-DNA מעוכל מן הצינורות צנטריפוגה לתוך צינורות אולטרה-סינון (משקל מולקולה הקיצוץ: 3 kDa), צנטריפוגה-13,000 g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להסיר את אנזימי עיכול.
  6. להכין את הדגימות 5mC וניתוח 5hmC.
    1. לניתוח 5hmC: pipet 36 µL מסנן לפתרון צנטריפוגה חדש צינור (1 מ"ל) ולהוסיף 4 µL של 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) עם הריכוז הסופי של 3 ננומטר.
    2. לניתוח 5mC: להוסיף 196 µL של הנדסה גנטית מים לתוך שפופרת צנטרפוגה חדש pipet 4 µL של פתרון סינון הצינור (דילול 50-fold), עקב צפיפות גבוהה של 5mC ב- DNA גנומי. להעביר µL 36 של הפתרון מדולל שפופרת צנטרפוגה חדש ולהוסיף 4 µL של (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) עם הריכוז הסופי של 50 ננומטר. שימוש [D3]-5hmC [D3]-5mC כמו תקן פנימי לכיול 5hmC ו- 5mC, בהתאמה.
  7. להעביר את הפתרון מדגם צינורות מדידה ולאחסן ב 4 º C. לנתח את 5mC ואת 5hmC עם ביצועים מעולים במיוחד נוזלי כרומטוגרפיה-טריפל פאול ספקטרומטר מסה עם מרובה-תגובה ניטור (UHPLC-MS/MS (MRM)) כפי שמתואר הדוח הקודם15.

6. לנתח 5mC ואת 5hmC באמצעות UHPLC-MS/MS15

  1. כוונן פרמטרים שונים עבור ניתוח 5mC ו- 5hmC שימוש בתוכנת UHPLC-MS.
    1. להקים שיטה חדשה. פתח את התוכנה ולחץ על "קובץ | חדש | שיטת". התערוכה תיבת ההודעה של "שיטת עורך" עם התוכן "האם ברצונך לשמור את השינויים עבור השיטה הנוכחית" ולחץ על "לא".
    2. לבנות את הפרמטרים של דוגם. לחץ על "דוגם | ההתקנה | הזרקת". בחרו "הזרקת רגיל", קלט "5 µL בווליום הזרקת".
    3. לבנות את הפרמטרים של המשאבה ב- UHPLC.
      1. לחץ על "BinPump2 | הגדרת"לבנות את הפרמטרים של המשאבה. הגדר "זורם" "0.25 mL/min" ו- "לעצור את הזמן" ב- "15 דקות".
      2. הגדרת "ממיס B ב-5%" ולחץ "גבולות"-"מקס 600 בר".
      3. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"כדי לבנות איזוקראטית • תנאי פרמטרים עבור ניתוח 5mC. לחץ על 'הוספה' כדי להוסיף שורה. קלט "0.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %".
      4. לחץ על "BinPump2 | לוח זמנים"לבנות את הפרמטרים • תנאי מעבר לניתוח 5hmC. לחץ על "הוספה כדי להוסיף שורה. קלט 0.00-זמן ו- 5.0-"B %". לחץ על "הוספה" פעם נוספת כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "3.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב "B %". לחץ על "הוספה" עבור עוד 6 פעמים להוסיף שורות 6. קלט "3.01" ב "הזמן" ו "15.0" ב- "B %", "6.00"-"הזמן" ו- "15.0" ב- "B %", "6.01" ב "זמן" ו- "100" ב- "B %", "10.00" ב "זמן" ואת "100.0" ב- "B %", "10.01"-"הזמן" ו- "5.0" ב- "B %", "15.00" ב "זמן" ו- "5.0" ב- "B %" ברצף.
        הערה: לבצע הניתוח של 5mC ו- 5hmC בנפרד בשל תנאי ההפרדה שונה UHPLC.
    4. לבנות את הפרמטרים של הטמפרטורה של תא עמודה (TCC) ב- UHPLC.
      לחץ על "TCC | ההתקנה | טמפרטורה (משמאל) "קלט"30 ° C".
    5. להקים את הפרמטרים של דני מוליארצוק-MS/MS.
      1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | לעצור את הזמן | לא הגבלת/כמו משאבה"," מקור יון | ESI"," זמן סינון | שיא רוחב: 0.07 דקות ". הגדרת "זמן מקטעים: שעת התחלה: 0"; "סוג סריקה: MRM"; "ערך Div: ל MS"; "דלתא EMV (+): 200" ו- "דלתא EMV (-): 0".
      2. לבנות את הפרמטרים של ניטור המעברים של 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC ו- D3-5hmC
        1. לחץ על "דני מוליארצוק MS | רכישה | לסרוק קטעים: לשכון:-90 אינץ '; "Fragmentor: 90"; "אנרגיית התנגשות: 5"; "תא מאיץ מתח: 4" ו- "קוטביות: חיובי".
        2. קלט "5mC"-מתחם "שם", "242" ב "קודמן יון", "126" ב- "מוצר יון" לניתוח 5mC. לחץ על הלחצן הימני ובחר באפשרות "הוסף שורה" כדי להוסיף שורה חדשה. קלט "D3-5mC"-מתחם "שם", "245" ב "קודמן יון", "129" ב- "מוצר יון" D3-ניתוח 5mC.
        3. תוספת אחרת שלוש שורות באמצעות של אותו מצב. קלט "dC"-מתחם "שם", "228" ב "קודמן יון", "112" ב- "מוצר יון" לניתוח dC. קלט "5hmC"-מתחם "שם", "258" ב "קודמן יון", "142" ב- "מוצר יון" לניתוח 5hmC. קלט D3-5hmC-מתחם שם, "261" ב "קודמן יון", "145" ב- "מוצר יון" D3-ניתוח 5hmC.
      3. לבנות את הפרמטרים של מקור גז. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מקור | מקור פרמטרים: גז Temp: 300 ° C "; "גז זרימה: 11 L/min"; "מפוחים: 15 psi"; "חיובי-נימי: 3500 V".
      4. לשמור את השיטה המוצעת. לחץ על "דני מוליארצוק MS | מכשיר | שמור שיטה כמו". בחר נתיב עבור השיטה המוצעת על ידי "מדריך" ותן שם עבור פעולת השירות על-ידי הזנת התוכן "שיטה", לדוגמה: 5mC וניתוח 5hmC.
  2. UHPLC ההפרדה וניתוח MS/MS של mononucleosides
    1. הכן השלב ניידים עבור 5mC ו ציטוזין (C) ניתוח: יוצרים שלב ניידים של פתרון A ו- B. פתרון א': 500 מ ל מים הנדסה גנטית עם 500 µL חומצה פורמית (הריכוז הסופי: 0.1%), ואת פתרון ב': 500 מ ל 100% מתנול. לערבב פתרון A ו- B 95:5 (v: v) כמו השלב נייד כדי elute 5mC ו- C (מוגדרת בשלב 6.1.3.3). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
    2. הכן השלב ניידים על ידי ממס A ו- B לניתוח 5hmC. הממס הוא 2.0 מ מ NH4HCO3 תמיסה מימית (pH 9.0) (500 mL), והוא ממיס B 100% מתנול (500 mL). 5hmC נפרדות על-ידי • הדרגתיות אופטימיזציה תנאי: 0-3 דקות, 5.0% B ל- 95% (v: v); 3-6 דקות, 15.0% B ו- 85% A; 6-10 דקות, 100% ב'; 10-15 דקות, 5.0% B ל- 95% A (מוגדרת בשלב 6.1.3.4). לקבוע את קצב הזרימה 0.25 mL/min (מוגדרת בשלב 6.1.3.1).
  3. לנצל ספקטרומטריית electrospray MS/MS עם מצב MRM (מוגדרת בשלב 6.1.5.1) כדי לנתח את • תנאי מהעמודה ולאמץ את מצב יון חיובי (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.1).
    1. לפקח על המעברים: 5mC, 242→126 מ/z (אנרגיית התנגשות, 5 eV); [D3]-5mC, 245→129 מ/z (5 eV); dC, מ/z 228→112 (5 eV); 5hmC, 258→142 מ/z (5 eV); [D3]-5hmC, 261→145 מ/z (5 eV) (מוגדרת בשלב 6.1.5.2.2).
    2. להגדיר את המתחים נים, פרגמנט +3,500 V (מוגדרת בשלב 6.1.5.3) ולהגדיר 90 וולט (בשלב 6.1.5.2.1), בהתאמה.
    3. לקבוע את עוצמת הקול של הזרקת 5 µL ולנתח כל מדגם 3 פעמים (מוגדרת בשלב 6.1.2). מעסיקים את עקומות סטנדרטי המתאים כדי להעריך את כמות 5mC ו- 5hmC.
      1. להקים את עקומת סטנדרטית של 5mC: העברת 1 – 50 ננומטר (1, 5, 10, 20, 50 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5mC לתוך צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 50 ננומטר [D3]-5mC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5mC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5mC (שלב 6).
      2. לבנות את עקומת סטנדרטית של 5hmC: העברת 1 – 20 ננומטר (1, 2, 5, 10, 20 ננומטר, הריכוז הסופי) תמיסה סטנדרטית של 5hmC צנטריפוגה צינורות ולהוסיף 3 ננומטר [D3]-5hmC על הצינורות. תוספת לנפח הכללי ל- µL 50. לבצע הניתוח של 5hmC תקן ביצוע ההוראות עבור הדגימה 5hmC (שלב 6).

7. לנתח את מובהקות סטטיסטית

  1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה.
    1. לפתוח את התוכנה ובחר "טור" "טבלה חדשה & גרף". הגדר את פרמטרי כדלקמן: "דגום נתונים | התחל עם טבלת נתונים ריק"; "בחר מצב קודם את גרף"; "יצירת גרפים משכפל או קווי שגיאה | מגרש | מתכוון עם SEM."
    2. לחץ על "צור" קלט את שלושת משכפל בקבוצת הבקרה וטיפל Vc/PD0325901 בשורה "A" ו- "B", בהתאמה. בחר את הנתונים שש ' ולחץ על 'נתח' בניתוח"" '.
    3. בחר "בדיקותt (וגם בדיקות nonparametric)" ב- "טור ניתוחים" ולחץ "אישור" כדי להזין את הממשק הבא.
    4. הגדר את פרמטרי כדלקמן: "בחר מבחן | שם הבדיקה | מבחן אינטראקצית t ; אפשרויות | דו-זנבית"; "מרווחי ביטחון: 95%"; "ספרות משמעותיות | הצג 4 ספרות משמעותיות". לחץ על "אישור" כדי לרכוש את ערך p בין הטיפול ובקרה Vc/PD0325901.
  2. להעריך את משמעות סטטיסטית בין הפקד הקבוצות ניסיוני העסקת הסטודנט דו-זנבי, אינטראקצית t-מבחן16.
    הערה: p < 0.05 מציין את ההבדל בעלי מובהקות סטטיסטית. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Vc/PD0325901 המושרה בסינרגיה מחיקה הכללית של העכבר ES התאים. העכבר ES התאים בנסיוב התערוכה DNA hypermethylation, ואילו תאים pluripotent ICM PGCs מראים מחיקה הכללית של מתילציה DNA המדינה hypomethylated קשורה קשר הדוק עם שלהם9,pluripotency10.

בעבר, אנחנו ואחרים מצאו כי Vc עשוי לשפר את בתיווך ט 5mC demethylation15,17

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה, הפגנו שיטה של שילוב Vc, PD0325901 כדי לקיים את העכבר ES תאים על מצב מובחן ו hypomethylated, אשר הושגה על ידי פעולה סינרגטי של קידום DNA demethylation מאת Vc ודיכוי דה נובו דנ א מתילציה על-ידי PD0325901. יתר על כן, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה נהדר תחת מערכת התרבות Vc/PD0325901.

לקיים יותר של המדינה של העכבר ES תאים במערכת התרבות Vc/PD0325901, ישנם כמה צעדים קריטיים. ראשית, אצוות FBS צריך להיות ממוסך מראש כדי למצוא במלאי את הטוב באצוות. כמו כן, החלפה בתדירות גבוהה של סרום מזיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לחשוף אין פוטנציאל ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (21435008 ו- 21327006 ל ה. ו), התוכנית האסטרטגית של מחקר עדיפות של האקדמיה הסינית למדעים (XDB14030200 ל ה. ו).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר עוברי מקוראוסטרליה Corning35-076-CVרכיב של מדיום תא ES של עכבר
DMEM/גלוקוז גבוהHycloneSH30022רכיב של מדיום תא ES של עכבר
LIFMilliporeESG1107רכיב של מדיום תאי ES
של עכבר חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)Gibco11140050רכיב של מדיום תא ES של עכבר
נתרן פירובטGibco11360070רכיב של מדיום תא ES של עכבר
L-גלוטמיןGibco25030081רכיב של תמיסת סטרפטומיצין בינונית של תא ES של עכבר
Gibco15140122רכיב של מדיום תא ES של עכבר
PBSSigmaP5493תאים שוטפים
טריפסיןHycloneSH30042דיסוציאציה של תאים
ג'לטיןסיגמא48722ציפוי כלים
PD0325901Stemolecule04-0006-10כימיקל מולקולה קטנה לתרבית תאים
CHIR99021Stemolecule04-0004כימיקל מולקולה קטנה לתרבית תאים
ויטמין CSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd כימיקלמולקולות קטנות XW00508171 לתרבית תאים
מערכת טיהור מים Ultra BiosciencePurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418הקפאת תאים
צנטריפוגרEppendorf5427RDNA ומיצוי חלבון
קוקטייל מעכב פרוטאז SigmaP8340רכיב של מאגר
מעכב פרוטאז PMSFThermoFisher Scientific36978רכיב של מאגר RIPA
DTTSIGMA43815רכיב של מאגר RIPA
EGTASIGMAE3889רכיב של מאגר RIPA
ערכת טיהור DNA גנומי PromegaA1125מיצוי DNA גנומי
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000קביעת ריכוז DNA
עגל פוספטאז מעייםניו אינגלנד BiolabsM0290DNA עיכול
DNase Iניו אינגלנד BiolabsM0303DNA
עיכול ארס נחש פוספודיאסטראז ISigmaP4506עיכול DNA
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35סינון DNA מעוכל
מערכת 1290 UHPLCAgilent 1290הפרדת UHPLC
G6410B ספקטרומטר מסה מרובע משולשAgilent G6410BMS/MS ניתוח
Zorbax Eclipse Plus C18 עמודהAgilent Zorbax Eclipse Plusקולום להפרדת UHPLC
5-מתילציטוזיןSolarbio Life SciencesSM8900 סטנדרט 5mC
5-הידרוקסימתילציטוזין (סטנדרטי)טורונטו מחקר כימיקליםM295900סטנדרטי 5hmC
Prdm14 נוגדןbioworldBS7634ניתוח כתמים מערביים-נוגדן
ראשוני Dnmt3aנוגדן bioworldBS6587ניתוח כתמים מערביים-נוגדן
ראשוני Dnmt3b נוגדןabcamab13604ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני
נוגדן Dnmt3labcamab3493ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני
Dnmt1 נוגדןabcamab13537ניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני
ובטא;-נוגדן טובוליןbioworldBS1482MHניתוח כתמים מערביים-נוגדן ראשוני
נגד ארנב עז IgGabcamab6721ניתוח כתמים מערביים-נוגדן
משניעז אנטי עכבר IgGabcamab6789ניתוח כתמים מערביים-נוגדן
משני טריזולInvitrogen15596-026מיצוי RNA
PromegaA3500RNA שעתוק הפוך
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG אלקליין פוספטאז צביעה וערכת בדיקת פעילותתאים ביולאבס, בע"מCBA-302  ניתוח צביעת פוספטאז אלקליין
תאי ES של עכבר: WT, 129 SvEvסופק על ידי פרופסור Guoliang Xu (מכוני שנחאי למדעי הביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, שנחאי, סין)זן תאים של תאי ES של עכבר
מיקרוסקופZeissLSM510תצפית תאי
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0ניתוח סטטיסטי
בינוני RIPA, מערכת שעתוק הפוך

מקורות

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156(2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171(2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194(2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

היפומתיליזציה של DNAטיפול בוויטמין Cאנליזת UHPLC MSMSזיהוי 5-מתיליציטוזיןאנליזה של 5-הידרוקסימתיליציטוזיןביטוי של Prdm14דיכוי של Dnmt3bפרוטוקול תרבית תאים
שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.