ההערכה המדויקת של תגובת כאב במודל בעלי חיים נוירופתי חיוני לחקור הפתופיזיולוגיה של כאב מחלות ולפתח משככי כאבים חדשים. אנו מציגים שיטה אובייקטיבית רגיש כדי לקבוע את תפקוד חושי למכרסמים הינד כף של מערכת ניתוח הילוך אוטומטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אוטומטיות והרצתי ניתוח אצל עכברים עם פציעה כרונית הכיווץ
במאמר זה
סיכום
תקציר
הבדיקה פון פריי הוא שיטה קלאסית זה כבר בשימוש נרחב כדי לבחון את תפקוד חושי כאב נוירופתי חיות. עם זאת, יש כמה חסרונות כגון נתונים סובייקטיבית לבין הדרישה הנסיין מיומנים, מנוסים. עד כה, מגוון של שינויים שיפרו את שיטת פון פריי, אבל עדיין יש כמה מגבלות. דיווחים אחרונים הראו כי והרצתי ניתוח מייצרת נתונים אובייקטיביים ומדויקים יותר מהחיות נוירופתי. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ניתוח הילוך אוטומטי כדי לקבוע את מידת כאב נוירופתי בעכברים. אחרי כמה ימים של והפיזיולוגי, העכברים הורשו ללכת בחופשיות על רצפת זכוכית כדי להאיר את העקבות. לאחר מכן, כימות של עקבות של דהירה בוצעו באמצעות סרטוני וידאו עם ניתוח אוטומטי של פרמטרים הליכה שונים, כגון אזור כפת בזמן ההדפסה, להתנדנד, זווית כף היד, וכו '.
המטרה העיקרית של מחקר זה היא לתאר את המתודולוגיה של ניתוח הילוך אוטומטי ולהשוות אותם בקצרה עם נתוני הבדיקה חושית קלאסית באמצעות פילמנט פון פריי.
מבוא
שינויים פתולוגיים של מערכת העצבים הנגרם על ידי הטראומה, תפקוד מטבולי, דלקת, זיהום, איסכמיה, או מחלות אוטואימוניות מדי פעם לגרום כאב נוירופטי, אשר מוגדר כאבים הנובעים כתוצאה ישירה של פגיעה או מחלה להשפיע על מערכת המגע1. כאב נוירופטי הוא בדרך כלל בלתי נסבל, למרבה הצער, משככי כאבים רגילים בדרך כלל אינם מייצרים מספיק כאב הקלה2. תכונה מרכזית של כאב נוירופתי מכיל ספונטנית ועוררו על-ידי גירוי כאבים (קרי, allodynia ו- hyperalgesia). Allodynia היא תגובה nociceptive המתרחשת לגירויים שאינם כואבים בדרך כלל, כגון במגע קל או גירוי חמים. Hyperalgesia מציין מענה כאב משופרת יתמודד גירויים מכניים ו/או תרמי3. למרות שתי תופעות אלה הן לפגוע אנושות איכות החיים של המטופל, allodynia מכני עורר על ידי גירוי חוש המישוש עדין הוא בתופעה הכי מרגיז כי מגע רך, קשה להימנע בחיי היומיום.
כדי לחקור את המנגנון הבסיסי ואת משככי כאבים חדשים לטיפול בכאב נוירופטי, המדידה המדויקת של התגובה לכאב הוא חיוני. מודלים בעלי חיים רבים של כאב נוירופתי פיתחו תגובות nociceptive באחוריים כף של האזור בגלל שלה נגישות גבוהה4,5,6,7. לכן, רוב הערכות תגובת כאב בוצעו על-פני plantar או הגבי הכפה האחוריות על-ידי החלת גירויים מכני באמצעות מכשירים מיוחדים, כגון חוטים פון פריי. אחת של השיטה השכיחה היא הלמעלה ולשנות את השיטה המתוארת על ידי דיקסון8 ו מאוחר יותר גירסאות9,10. עם זאת, ניסויים מאוד מיומנים, מנוסים הנדרשים לביצוע הבדיקה פון פריי, התוצאות עלולות להיות סובייקטיבי.
מערכת ניתוח הילוך אוטומטי לחקור והפרעות נוירולוגיות neuromuscular על ידי מדידת פרמטרים שונים להסתובב בחופשיות הזזת מכרסמים. במגוון של עצב פציעה חייתיים, מידת nociception ואת השפעת antinociceptive מספר טיפולים שניתן להעריכו ללא הוספת של כאב גירוי11,12,13, 14. מערכת ניתוח זו ניתן לזהות פרמטרים הילוך סטטיים ודינמיים, כגון: כף של אזור הדפסה (האזור של טביעת כף מלאה כי המגעים עם הרצפה), כף של אינטנסיביות (עוצמת הממוצע של אזור כף הרגל קשר איתם), סטרייד פיאנו (את אורך המרחק בין מיקומי רצופים של הכפה אותו), עמידת שלב (משך הזמן של הקרקע קשר עבור כפה האחוריות יחיד), רצף שלב (הסדר שבו ארבע הכפות מונחות על הרצפה), סווינג (משך השלב המכריע), וסובב מהירות (מחושב מ סטרייד פיאנו אורך משך סווינג והביע פיקסלים לשנייה). הנייר הזה מדגים את השימוש מערכת ניתוח ומספקת השוואה קצרה של נתוני הבדיקה פון פריי באמצעות כיווץ כרונית פגיעה (CCI) נוירופטי עכברים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות האתי של האגודה הבינלאומית על חקר הכאב ולא אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב (האוניברסיטה הלאומית Chungnam טג'אן, דרום קוריאה).
1. אינדוקציה של CCI בעצב
- בית זכר ICR עכברים במשקל 20-25 גרם תחת מחזור/כהה 12 שעות בטמפרטורת החדר מבוקר (ומתוחזק על 20-25 ° C), לחות (40-60%), עם גישה לאוכל חינם, . מים. לאפשר תקופה להתאקלמות עבור עכברים בחדר טיפול בבעלי חיים לפחות שבוע אחד לפני הניתוח.
- במהלך דיור, להתבונן במראה ובאופן הפעולה של העכברים, אל תשתמש עכברים מראה פעילות מוחית חריגה גינקולוגיות.
הערה: יום אחד לפני הניתוח CCI, למדוד את רגישות מכני הכפה האחוריות על-ידי החלת פון פריי חוטים ולבצע ניתוח הילוך אוטומטי כדי להשיג ערכי בסיס נורמלי. לאחר מכן, להקצות באופן אקראי עכברים שליטה ולקבוצות ניסיוני.
- במהלך דיור, להתבונן במראה ובאופן הפעולה של העכברים, אל תשתמש עכברים מראה פעילות מוחית חריגה גינקולוגיות.
- ביום של הניתוח, עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת 2,2,2-tribromoethanol (250 מ"ג/ק"ג, בקרום הבטן (IP)).
הערה: ללבוש ציוד מגן אישי כגון הניתוחים, כפפות, מסיכה.- שוקל 2.5 גר' 2,2,2-tribromoethanol ומוסיפים 2-מתיל-2-buthanol הנפח הסופי של 5 מ"ל. לשמור את הפתרון מן האור (למשל להשתמש במיכל חשוך או לעטוף בנייר).
- אפשר ריאגנטים להתמוסס לחלוטין על ידי חימום ב 40 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב במשך 10-30 דק...
- להוסיף לנפח סופי של 200 מ ל מים מזוקקים ומערבבים עד מעורבבים טוב.
- אחסן aliquots ב 4 ° C ולשמור באפלה. אחרי שבועיים, ההרדמה צריך להיות מוחלף עם aliquots החדש.
- להזריק נפח של 20 µL לכל 1 גרם משקל. לדוגמה, אם משקל הגוף של העכבר 25 גרם, לתת 500 µL של פתרון. משך ההרדמה הזה אופייני הוא ח' 1
הערה: פתרון זה יהיה רעיל כאשר הם נחשפים לאור ו/או חום כדי להיות זהיר להימנע מחשיפה אור וחום. נתיב הזרקת IP מומלץ בחום.
- כאשר העכבר נופל לתוך הרדמה עמוקה, להניחה על שולחן הניתוחים עם הצד הגבי למעלה (כלומר, שכיבה), לחטא את האזור אמצע הירך החיצונית של הצד הנכון עם מקלון אלכוהול 70%-
הערה: לאשר הרדמה עמוקה על-ידי בדיקת חוסר התגובה לצבוט או לחץ גירוי כפות הרגליים האחוריות או זנב. - לגרום את CCI בעצב נכון של העכבר.
- אעשה חתך על העור מסביב לאזור אמצע הירך של 1.0-1.5 ס מ אורך עם להב אזמל.
- בוטה לנתח את שרירי הירך עם עוצר דימום מיקרו-יתושים כדי לחשוף בעצב.
- מאתרים ומפסיקים בעצב חשוף 3 פעמים עם מרווחי 1.0-1.5 מ"מ באמצעות בתפר כרום 4-0-
הערה: להפוך ligations משוחרר על-ידי קשירת בעצב עד טלטול עדין מופיע על חולשת הכפה האחוריות. הקבוצה המזויפים של עכברים התקבל הפתח כירורגית אותה בתנאים דומים למעט בלי עצב מצדו.
- לסגור את הפתח כירורגית עם 3-4 תפרים קטע פשוט בעזרת חוט משי 5-0 ולחטא עם povidone יוד לחיטוי של האזור החיצוני של ניתוח.
- לאחר הניתוח, מקם את העכבר בתוך כלוב נקי על כרית החימום. כאשר בעלי חיים הם התאוששה מן ההרדמה, להחזיר אותם לכלוב שלהם הביתה.
הערה: במחקר זה, אנטיביוטיקה לא שימשו. CCI + GBP קבוצה קיבל IP gabapentin (GBP) במינון של 50 מ"ג/ק"ג מדי יום כפקד חיובי.
2. מדידה של Allodynia מכני (מבחן פון פריי)
הערה: להעריך את תדירות התגובה נסיגה לגירויים מכני באמצעות 1g של פון פריי פילמנט השטח plantar של חולשת הכפה האחוריות.
- בכל יום המבחן, להביא עכברים לחדר בדיקה התנהגותית, להתאקלם העכברים בכלוב בבית שלהם במשך לפחות 30 דקות לפני ילדי
הערה: ללבוש ציוד מגן אישי כגון הניתוחים, כפפות, מסיכה. - לשים את העכבר בתוך קופסה אקרילי שקוף על הרצפה מתכת רשת שינוי, להתאקלם העכבר במשך 30 דקות
- בעדינות להחיל 1g של פון פריי פילמנט השטח plantar של הכפה האחוריות עד נימה מתכופף.
- החל פילמנט גירוי האחוריות חולשת כף של 10 פעמים לפחות 10 s מרווחי ולהקליט את התוצאה.
הערה: במחקר זה, מספר התגובות נסיגה כפת מניסויים 10 מוצגות כאחוזים של תדר נסיגה כפת (PWF, %). פריי פון הבדיקה בוצעה בכל יומיים לאחר הניתוח CCI.
3. ביצוע ניתוח הילוך אוטומטי
הערה: מערכת ניתוח הילוך מדמיין כל טביעת כף הרגל בזמן החיה הולך ומנתח פרמטרים שונים הילוך באופן אוטומטי, כגון כמו כף של הדפסה, כף של עוצמה, אורך צעד, עמידה שלב שלב הרצף, סווינג, סווינג, מהירות וכו במחקר זה, הראנו אזור הדפסה כפת העמידה יחיד לאחר המרת הנתונים האחוז שינוי בין contralateral שמאל לעומת חולשת כפת ממש האחוריות. לפיכך, תוצאה של 50% מצביע על כך גודל הדפסה הכפה ומשך באזור כף היד במגע עם הרצפה, בין הצד הימני והשמאלי הן אותו. בנוסף, ערכי נתונים התחתון מתקרב 0% מציינים כי גודל והן משך הקשר ירד ביד האחוריות חולשת לעומת הצד contralateral (ראה לוח ב' של איור 2, איור 3).
- עבור והפיזיולוגי, לשמור העכברים בתוך המכשיר ניתוח הילוך 10 דקות פעם ביום תחילת 5 ימים לפני הניתוח CCI.
הערה: והרצתי ניתוח כולל להתאקלמות לבצע בדיקת בחושך. - העכברים לחדר הבדיקה והרצתי ניתוח ומביא להתאקלם בכלוב בבית שלהם במשך לפחות 30 דקות לפני ילדי
- בכרטיסיה התקנה של התפריט של התוכנית, הגדר " אורך שביל " עד 30 ס מ, והינו ממוקם " המקסימום לפעול משך " 5 s ו " המקסימום לפעול וריאציה " ל- 50%.
- בחר מצלמה רשום מ ' ההתקנה ' על כרטיסיית ' תוכנית ' תפריט.
- בחר " לפתוח את רכישת " מ ' לרכוש ' לשונית של ' תוכנית ' תפריט.
- בעקבות הודעת המצב, לחץ ' הצמד רקע ' הלחצן כדי לצלם תמונת רקע של שביל ריק (קרי, ריק).
- לחץ ' להתחיל רכישת ' כפתור ומניחים עכבר על השביל; ההקלטה מופעלת באופן אוטומטי בהתאם לתנועת העכבר.
הערה: כאשר העכבר הולך בבירור לאורך השביל, התוכנית באופן אוטומטי מסווג את הצעד הזה כמו " תואם להפעיל " עם סמל ירוק. אם התוכנה לא הצליחו לזהות את טביעת הרגל, הנסיין תראה סמל אדום, עליך לחזור על ההקלטה. לפחות חמישה מסלולי תואם מוצלח יש צורך בניתוח. - שאחרי הבדיקה, בחר ' לסווג את הרצפים ' מהכרטיסיה רכוש של ' תוכנית ' תפריט.
- בחר למסלולי עבור ניתוח ולחץ ' אוטומטי לסווג ' כפתור.
הערה: לאחר סיווג, כל הפרמטרים של סטטיסטיקות יישמר באופן אוטומטי הנסיין יכול למצוא את התוצאות על-ידי לחיצה על " תצוגה להפעיל את הסטטיסטיקה " בתפריט נתח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יש לבצע את הבדיקה פון פריי ואנו אוטומטית והרצתי ניתוח בעכברים CCI עד 10 ימים לאחר הניתוח CCI. לשם ניתוח סטטיסטי, מידות החוזרות ונשנות של דו כיוונית השונות (ANOVA) קובע הכולל אפקטים ולאחר ניתוח פוסט-הוק של Dunnett בוצע כדי לקבוע ערך p בין הקבוצות ניסיוני.
התוצאות המוצגות באיור 1 מצביעות על מסלול הזמן של נתוני מבחן פון פריי קלאסית. PWF (%) של עכברים CCI היה מוגבר 2 ימים לאחר הניתוח CCI ומתמשכ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כיום, מדידה של allodynia מכני באמצעות חוטים פון פריי הוא הנפוצים ביותר בשיטה במודלים חייתיים כאב להפגין רגישות יתר חוש המישוש. כפי חייתיים כאב נאורופתיות המשיכו להיות מפותח, המתודולוגיה של הערכה לתפקוד חושי היה גם משופר8,9,10,15. בדוחות אלה, זה כבר הציע שלבצע שינויים אלה יכולים לספק תחליף שיטות בוגרים יותר מדויק, מהיר, ידידותי למשתמש. עם זאת, נתונים בשיטות אלה עדיין עלולים להגביל את הסובייקטיבי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי Chungnam האוניברסיטה, קוריאה המכון הלאומי של מזרחי הרפואה (KIOM), מענק של ה-טכנולוגיית R בריאות קוריאה & פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), במימון משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI15C0007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.9% מלח | JW Pharmaceutical | N/A | רכב לתרופות |
| 1 מ"ל מזרק | BD Plastipak | 300013 | מכשיר הזרקה |
| 2, 2, 2-tribromoethanol (97% טוהר) | Sigma | T48402 | חומר הרדמה |
| 2-מתיל-2-בוטנול (99% טוהר) | Sigma | 152463 | Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol |
| Catwalk מערכת ניתוח הליכה אוטומטית | Noldus | N / A | תוכנת ניתוח אוטומטית של הליכה אניאמל |
| Chromic catgut (עובי 4-0) | AILEE | C442 | Ligature לביצוע פגיעה כרונית בהיצרות בעצב הסיאטי |
| Gabapentin | Sigma | Y0001280 | Analgeisc, משמש כתרופת בקרה חיובית במחקר זה |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11051-10 | מכשיר כירורגי |
| כרית חימום | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | ויסות טמפרטורת הגוף |
| עכבר ICR | Samtaco | N/A | חיית ניסוי |
| Mersilk (עובי 3-0) | ETHICON | W598H | חומר תפר לסגירה כירורגית של העור |
| מיקרו-יתוש | FST | 13010-12 | מכשיר כירורגי |
| מיקרו-מספריים | FST | 14090-09 | כירורגי מכשיר |
| מחזיק מחט | FST | 12002-12 | מכשיר כירורגי |
| Povidone Iodine | Firson | N/A | חומר חיטוי למניעת זיהום לאחר ניתוח |
| להב אזמל | FST | 10010-00 (#10) | מכשיר כירורגי לביצוע חתך |
| ידית אזמל | FST | 10003-12 | ) מכשיר כירורגי לביצוע חתך |
| חוטי פון-פריי | הצפוני | NC12775-99 | מכשיר מדידה לבדיקת תפקוד חושי לגירוי מכני |
מקורות
- Loeser, J. D., Treede, R. D. The Kyoto protocol of IASP Basic Pain Terminology. Pain. 137 (3), 473-477 (2008).
- Colloca, L., et al. Neuropathic pain. Nat Rev Dis Primers. 3, 17002(2017).
- Vranken, J. H. Mechanisms and treatment of neuropathic pain. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 9 (1), 71-78 (2009).
- DeLeo, J. A., et al. Characterization of a neuropathic pain model: sciatic cryoneurolysis in the rat. Pain. 56 (1), 9-16 (1994).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 20, 441-462 (1980).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Mol Pain. 10, 26(2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Chen, H., Du, J., Zhang, Y., Barnes, K., Jia, X. Establishing a Reliable Gait Evaluation Method for Rodent Studies. J Neurosci Methods. , (2017).
- Kang, D. W., et al. Antinociceptive Profile of Levo-tetrahydropalmatine in Acute and Chronic Pain Mice Models: Role of spinal sigma-1 receptor. Sci Rep. 6, 37850(2016).
- Huehnchen, P., Boehmerle, W., Endres, M. Assessment of paclitaxel induced sensory polyneuropathy with "Catwalk" automated gait analysis in mice. PLoS One. 8 (10), e76772(2013).
- Vrinten, D. H., Hamers, F. F. 'CatWalk' automated quantitative gait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparison with von Frey testing. Pain. 102 (1-2), 203-209 (2003).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. J Vis Exp. (82), e51212(2013).
- Ferland, C. E., Laverty, S., Beaudry, F., Vachon, P. Gait analysis and pain response of two rodent models of osteoarthritis. Pharmacol Biochem Behav. 97 (3), 603-610 (2011).
- Mogil, J. S., et al. Hypolocomotion, asymmetrically directed behaviors (licking, lifting, flinching, and shaking) and dynamic weight bearing (gait) changes are not measures of neuropathic pain in mice. Mol Pain. 6, 34(2010).
- Ferreira-Gomes, J., Adaes, S., Castro-Lopes, J. M. Assessment of movement-evoked pain in osteoarthritis by the knee-bend and CatWalk tests: a clinically relevant study. J Pain. 9 (10), 945-954 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
