מאמר שיטה

סינתזה של ליבה-קליפה מסטול לנתניד Upconversion Nanocrystals עבור אפליקציות לסלולר

DOI:

10.3791/56416

⸱

10 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical & Mathematical Sciences, Nanyang Technological University, 2Institute of Materials Research & Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מוצג הסינתזה של ליבה-קליפה מסטול לנתניד upconversion nanocrystals (UCNs) והיישומים הסלולר שלהם עבור ערוץ חלבון רגולציה על תאורה אור אינפרא אדום (ניר).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לנתניד מסטול upconversion nanocrystals (UCNs) משכו תשומת לב רבה בשנים האחרונות על בסיס מבטיח, לשליטה אופטי המאפיינים שלהם, אשר מאפשרים קליטת אור אינפרא אדום (ניר), לאחר מכן באפשרותך להמיר אותו לתוך מרובב פליטת המתפרסים על פני טווח רחב של אזורים מן UV כדי גלוי ניר. מאמר זה מציג הליכים מפורטים ניסיוני של משקעים משותף טמפרטורה גבוהה סינתזה של ליבה-קליפה UCNs זה לשלב יונים שונים לנתניד nanocrystals להמרת ביעילות רקמות עמוק נחדרת ניר עירור (808 ננומטר) לתוך פליטה כחול חזק-480 ננומטר. על ידי שליטה של השינוי משטח עם מסתיימים פולימר (חומצה polyacrylic, במספר דוכנים), UCNs כמו איך מכינים רוכש מסיסות נהדר מאגר פתרונות. Nanocrystals הידרופילית נוסף functionalized עם ליגנדים ספציפיים (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) עבור לוקליזציה על קרום התא. על אור ניר (808 ננומטר) הקרנה, הפליטה upconverted כחול ביעילות ולהפעיל את החלבון ערוץ ממותגת אור על קרום התא או במיוחד לווסת את זרם הקטיון (למשל, Ca2 +) בציטופלסמה. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ריאלי לסינתזה של ליבה-קליפה מסטול לנתניד UCNs, שינוי פני השטח מסתיימים עוקבות עבור עוד אפליקציות לסלולר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, upconversion מסטול לנתניד nanocrystals (UCNs) היה בשימוש נרחב כחלופה צבע אורגני קונבנציונלי ו נקודות קוונטיות ביישומים הביו-רפואי, אשר מבוססים בעיקר על כימיקלים מצטיינים, התכונות האופטיות שלהם, כולל הביו מעולה, עמידות גבוהה photobleaching ורוחב פס צר פליטה1,2,3. ויותר חשוב, הם יכול לשמש nanotransducer מבטיח עם רקמות מצוינת חדירה לעומק ויוו להמיר אינפרא אדום עירור (ניר) לתוך טווח רחב של פליטת UV, גלוי, ואת האזורים ניר דרך פוטון מרובה תהליך upconversion4,5. המאפיינים הייחודיים להפוך UCNs מסטול לנתניד לשמש וקטור מבטיח במיוחד חישה ביולוגיים, ביו דימות של מחלות theranostics6,7,8.

הרכיבים כללי של UCNs מבוססים בעיקר על היונים לנתניד מסומם המטריצה מארח בידודית הכולל של sensitizer (למשל, י. ב3 +, Nd3 +) activator (למשל, Tm3 +, Er3 +, הו 3 +) בתוך הקריסטל homogeneously9. הפליטה אופטי שונה מן nanocrystals מיוחס המעבר אלקטרונית מקומי בתוך המסלוליםf 4 dopants לנתניד עקב שלהם רמת האנרגיה מסודרים כמו סולם10. לכן, חיוני לשלוט במדויק את גודל ואת המורפולוגיה של UCNs מעוצבות עם לנתניד ל dopants. מאת נכון, כמה שיטות מבטיח טוב הוקמו עבור הכנת UCNs לנתניד מסטול, לרבות פירוק תרמי, משקעים משותף טמפרטורה גבוהה, סינתזה הידרותרמי, עיבוד סול-ג'ל, ועוד11 , 12 , 13 בין הגישות הללו השיטה משקעים משותף טמפרטורה גבוהה הוא אחד הכי פופולריים ונוחים אסטרטגיות סינתזה UCNs, אשר יכול להיות נשלט בקפדנות כדי להכין nanocrystals הרצוי באיכות גבוהה עם צורה אחידה, התפלגות זמן תגובה קצר יחסית, בעלות נמוכה14. עם זאת, רוב nanostructures מסונתז על ידי שיטה זו בעיקר מכוסה ליגנדים הידרופובי כגון חומצה אולאית, oleylamine, אשר בדרך כלל להפריע שלהם bioapplication נוסף בשל המוגבלת של ליגנד הידרופובי מסיסות בתמיסה המימית 15. לכן, יש צורך לבצע טכניקות שינוי פני השטח מתאים להכין UCNs מסתיימים יישומים ביולוגיות vitro בתוך ו ויוו.

במסמך זה, אנו מציגים בהליך ניסיוני מפורט לסינתזה של ליבה-קליפה UCNs nanostructures באמצעות שיטת משקעים משותף טמפרטורה גבוהה, טכניקה שינוי ריאלי functionalize פולימר מסתיימים על השטח UCNs עבור עוד אפליקציות לסלולר. זה nanoplatform UCNs מובהקים שלוש יונים לנתניד (י. ב3 +, Nd3 +ו- Tm3 +) nanocrystals לרכוש פליטה כחול חזק (~ 480 ננומטר) על עירור אור ניר-808 nm, שבו יש יותר עומק החדירה ב רקמה חיה. ידוע כי Nd3 +-UCNs מסומם להציג אפקטים הקליטה של התחממות יתר המים ממוזער בכל חלון ספקטרלי זה (808 ננומטר) לעומת UCNs המקובלת על 980 nm הקרנה16,17, 18. יתר על כן, כדי לנצל את UCNs במערכות ביולוגיות, ליגנדים הידרופובי (חומצה אולאית) על פני השטח של UCNs ראשית יוסרו על ידי sonication תמיסה חומצית19. אז UCNs ללא ליגנד לשינוי נוסף עם פולימר מסתיימים (חומצה polyacrylic, במספר דוכנים) לרכוש מסיסות נהדר פתרונות מימית20. יתרה מזאת, כמושג הוכחה-של-ביישומים הסלולר, UCNs הידרופיליות הם functionalized עוד יותר עם ליגנדים מולקולרית (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) בלוקאליזציה ספציפי על N3-מתויג קרום התא. על אור ניר (808 ננומטר) הקרנה, הפליטה upconverted הכחול-480 ננומטר ביעילות ולהפעיל חלבון ערוץ ממותגת אור, channelrhodopsins-2 (ChR2), על פני התא או ובכך להקל על זרם הקטיון (למשל, Ca2 + יון) על פני הקרום של תאים חיים.

פרוטוקול וידאו זה מספק מתודולוגיה ריאלי עבור מסטול לנתניד סינתזה UCNs, שינוי פני השטח מסתיימים UCNs bioapplication בתאים חיים. כל ההבדלים טכניקות סינתזה, ריאקטיבים כימיים המשמשים nanocrystal צמיחה השפעה על גודל הפצה, מורפולוגיה, upconversion הפריה חוץ גופית (UCL) הספקטרום של nanostructures UCNs הסופי נעשה שימוש בניסויים תא. פרוטוקול וידאו מפורט זה מוכן לעזור חוקרים חדשים בתחום זה לשפר את הפארמצבטית של UCNs עם השיטה משקעים משותף טמפרטורה גבוהה ולהימנע מן הטעויות הנפוצות ביותר ב- UCNs שינוי פני השטח מסתיימים עבור עוד יותר אפליקציות לסלולר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אזהרה: נא היוועץ כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני השימוש. נא להשתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע הסינתזה של UCNs בטמפרטורה גבוהה (~ 290 ° C), כולל השימוש של פקדים הנדסה (fume הוד), ציוד מגן אישי (למשל, בטיחות משקפי מגן, כפפות, חלוק המעבדה מכנסיים באורך מלא, ונעליים סגורות).

1. סינתזה של NaYF 4: י. ב/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocrystals ליבה-קליפה Nd(20%)

  1. סינתזה של NaYF 4: ננו-מבנה ליבה Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
    1. הכנה של רי (CH 3 CO 2) 3, 4 F NaOH, NH מתנול פתרון מניות
      הערה: נדיר-earth (מחדש) לנתניד יונים כוללים איטריום (Y), איטרביום (י. ב), Thulium (Tm), ניאודימיום (Nd).
      1. לפזר 500 מ"ג Yttrium(III) אצטט מימה ב 5 מ ל מתנול (100 מ"ג/מ"ל), 250 מ ג מימה אצטט איטרביום (III) ב 5 מ ל מתנול (50 מ"ג/מ"ל), 10 מ ג מימה אצטט תוליום (III) ב 1 מ"ל מתנול (10 mg/mL), ו- 10 מ ג מימה אצטט ניאודימיום (III) ב 1 מ"ל מהטה נול (10 מ"ג/מ"ל) בצלוחיות זכוכית עם ניקוי באמבט אולטרא עבור 2 דק
      2. לשלב 400 מ"ג NaOH בשפופרת צנטרפוגה 50 מ עם 20 מ ל מתנול עם ניקוי באמבט אולטרא להכין פתרון מניות NaOH (20 מ"ג/מ"ל).
      3. לשלב 600 מ"ג NH 4 F בשפופרת צנטרפוגה 50 מ עם מתנול 30 מ עם ניקוי באמבט אולטרא להכין NH 4 נ מניות פתרון (20 מ"ג/מ"ל).
        הערה: הנח הפתרון מניות של מתחמי לנתניד NaOH, NH 4 F בצלוחיות זכוכית, חותם עם מצלמות-מיקרוסקופים ולאחסן אותם במקרר ב ~ 4 ° C עד שהוא נדרש. הפתרונות מניות מתנול מוכן מוחלפים אחת לשבועיים.
    2. הכנה של NaYF 4: י. ב/Tm/Nd ננו-מבנה ליבה
      1. פיפטה 3 מ"ל של חומצה אולאית, 7 מ ל 1-octadecene לתוך בקבוקון 3-צוואר 50-mL-
        2. פתרון
      2. 1.089 לשלב מ"ל של Y (CH 3 CO 2) 3 מניות הפתרון, 0.608 מ של י. ב (CH 3 CO 2) 3 מניות הפתרון, µL 83.6 של המניה 3 (CH 3 CO 2) Tm, ו µL 128.5 של Nd (CH 3 CO 2) 3 מניות הפתרון לתוך הבקבוק.
      3. להשתלב מד חום (0 - 360 מעלות צלזיוס טווח) הבקבוקון ולתת את קצהו לגעת הפתרון. מקם את הבקבוק. את מיכל הזכוכית עם שמן סיליקון phenylmethyl.
      4. חום הפתרון עד 100 ° C עם צלחת חמה מתמוססות הנחה מתנול. להתחבר schlenk ב קו עם יריעה ואקום כפול/גז כדי להסיר את שאריות מתנול ולשמור את תערובת התגובה תחת ואקום למשך 2-3 דקות תוך כדי ערבוב את הבקבוקון.
      5. מעלה את הטמפרטורה עד 150 ° C ולשמור את החום במשך 60 דק. שמור על מהירות מלהיב של 700 סל ד במהלך הסינתזה.
        הערה: הגדרת בינונית תוך ערבוב במהירות כדי למנוע מתיז הפתרון.
      6. לעצור את הכיריים ולשמור את הבקבוקון בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את הפתרון להתקרר לאט.
        הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
      7. לשלב 2 מ"ל NaOH-נמכרים מניות פתרון ו- mL 2.965 של NH-4 פתרון מניות F-מתנול לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להדק את הצינור עם הכובע שלו ולערבב את הפתרון על-ידי vortexing רב עוצמה עבור 5 ס
      8. הוסף התערובת F 4 NaOH-NH לאט לתוך הבקבוק מאת פיפטה מזכוכית מעל 5 דק.
      9. מעלה את הטמפרטורה של התערובת עד 50 מעלות צלזיוס ולשמור את החום במשך 30 דקות
        הערה: הגדרת את הטמפרטורה ב יותר מ 50 ° C בגלל הטמפרטורה הגבוהה יקדם את קריסטל התגרענות וצמיחה.
      10. מעלה את הטמפרטורה (~ 100 ° C) להתאדות הנחה מתנול ולחבר את הבקבוקון לקו schlenk עם יריעה ואקום כפול/גז כדי להסיר את שאריות מתנול ולשמור את תערובת התגובה תחת ואקום במשך 2-3 דקות
      11. להחליף את המיקום של צימוד למלא את הבקבוק עם חנקן-
      12. להגדיל הטמפרטורה עד 290 ° C בקצב חימום של ~ 5 ° C לדקה לשמור את התערובת התגובה ב 290 ° C עבור ה 1.5
      13. לעצור את הכיריים ולהסיר את הבקבוק כדי לאפשר את תערובת התגובה להתקרר לאט הטמפרטורה בחדר תוך כדי ערבוב.
        התראה: להיות זהיר של הכיריים עם טמפרטורה גבוהה (> 400 מעלות צלזיוס) כדי למנוע כוויות חמורות בעת מגע עם העור.
      14. להעביר את התערובת בתוך הבקבוק לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. לשטוף את הבקבוק עם 30 מ של אתנול ולהעביר את הפתרון הצינור צנטריפוגה.
      15. Centrifuge את המוצר ב 4,000 g × במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.
      16. להוסיף 10 מ ל הקסאן צנטריפוגה שפופרת, לפזר מחדש המוצר עם sonication (60 kHz, 240 W) עבור 2 דק.
      17. להוסיף 30 מ של אתנול ברכבת התחתית. ספין למטה המוצר ב 4,000 g × במשך 8 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
      18. לפזר מחדש את המוצרים מוצק בחלקו התחתון של צינור צנטריפוגה עם 5 מ"ל הקסאן. לאחסן את הפתרון במקרר ב ~ 4 ° C עבור שלב נוסף-
        הערה: פליטת upconversion ליבה-קליפה UCNs נבדק על ידי בין הפתרונות עם 808 ננומטר לייזר (2 W).
  2. הכנה של NaYF 4: י. ב/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocrystals ליבה-קליפה Nd(20%)
    1. לשלב 3 מ"ל של חומצה אולאית, 7 מ ל 1-octadecene לתוך בקבוקון 3-צוואר 50-mL. להוסיף 1.082 מ"ל של הפתרון מניות של 3 Y (CH 3 CO 2) ו- mL 2.87 של הפתרון מניות של 3 Nd (CH 3 CO 2) לתוך הבקבוק.
    2. להוסיף את ננו-מבנה ליבה שהושג (80 מ ג ב- 5 מ"ל הקסאן מהשלב 1.1.2.18) לתוך הבקבוק תוך כדי ערבוב.
    3. להשתלב מד חום (0 - 360 מעלות צלזיוס טווח) הבקבוקון ולתת את קצהו לגעת את התערובת. מקם את הבקבוק. את מיכל הזכוכית עם שמן סיליקון phenylmethyl.
    4. מחממים את התערובת ב 100 מעלות צלזיוס על פלטה מתמוססות מתנול, הקסאן. להתחבר schlenk ב קו עם יריעה ואקום כפול/גז כדי להסיר הממס שיורית ולשמור את תערובת התגובה תחת ואקום למשך 2-3 דקות תוך כדי ערבוב את הבקבוקון.
    5. מעלה את הטמפרטורה עד 150 ° C ולשמור אותו במשך 60 דק שמור על המהירות מלהיב-700 סל ד בסינתזה.
      הערה: הגדרת בינונית תוך ערבוב במהירות כדי למנוע מתיז הפתרון.
    6. לעצור את הכיריים ולהסיר את הבקבוק כדי לאפשר את הפתרון להתקרר לאט בטמפרטורת החדר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
      7. פתרון מניות
    7. פיפטה 2 מ"ל NaOH-נמכרים ו- mL 2.965 של NH-4 פתרון מניות F-מתנול לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להדק את הצינור עם הכובע שלו ולערבב את הפתרון על-ידי vortexing רב עוצמה עבור 5 ס
    8. הוסף התערובת לתוך הבקבוק מאת פיפטה מזכוכית לאט במשך 5 דק.
    9. מעלה את הטמפרטורה של התערובת עד 50 מעלות צלזיוס ולשמור אותו ב 50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
      הערה: הגדרת מ 50 ° C הטמפרטורה בגלל הטמפרטורה הגבוהה יקדם את קריסטל התגרענות וצמיחה.
    10. מעלה את הטמפרטורה (~ 100 ° C) להתאדות הנחה מתנול ולחבר את הבקבוקון לקו schlenk עם יריעה ואקום כפול/גז כדי להסיר את שאריות, מתנול, לשמור את התערובת התגובה תחת ואקום במשך 2-3 דק
    11. להחליף את המיקום של צימוד למלא את הבקבוק עם חנקן-
    12. מעלה את הטמפרטורה עד 290 ° C בקצב חימום של ~ 5 ° C לדקה לשמור את התערובת התגובה ב 290 ° C עבור ה 1.5
    13. לעצור את הכיריים ולהסיר את הבקבוק כדי לאפשר את תערובת התגובה להתקרר לאט בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
      התראה: להיות זהיר של הכיריים עם טמפרטורה גבוהה (> 400 מעלות צלזיוס) כדי למנוע כוויות חמורות בעת מגע עם העור.
    14. להעביר את התערובת בתוך הבקבוק לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. לשטוף את הבקבוק עם 30 מ של אתנול ולהעביר את הפתרון הצינור צנטריפוגה.
    15. Centrifuge את המוצר ב 4,000 g × במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.
    16. להוסיף 10 מ ל הקסאן צנטריפוגה שפופרת, לפזר מחדש המוצר עם sonication (60 kHz, 240 W) עבור 2 דק.
    17. להוסיף 30 מ של אתנול ברכבת התחתית. ספין למטה המוצר ב 4,000 g × במשך 8 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
    18. לפזר מחדש את המוצרים מוצק בחלקו התחתון של צינור צנטריפוגה עם 5 מ"ל הקסאן. לאחסן את הפתרון במקרר ב ~ 4 ° C עד הצורך.
      הערה: פליטת upconversion ליבה-קליפה UCNs נבדק על ידי בין הפתרונות עם 808 ננומטר לייזר (2 W).

2. סינתזה של מסתיימים UCNs Nanostructures

  1. הכנה של ליגנד חופשי nanoparticle UCNs
    1. לשלב 30 מ"ל אתנול עם איך מכינים הכתיר אולאט UCNs הפתרון (שלב 1.2.18) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל. Centrifuge את התערובת ב 4,000 g × במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.
    2. לשלב 10 מ ל תמיסה מימית חומצה (ה-pH = 4) מותאם על ידי HCl (0.1 M) עם התמיסה בצינור צנטריפוגה 50 מ ל, לפזר את התמיסה על ידי sonication (60 kHz, 240 W) במשך 30 דקות
    3. העברת הפתרון בכוס בקבוקון עם נמרצת זע עבור ה 2
    4. לחלץ את תמיסה מימית עם 30 מ ל דיאתיל אתר כדי להסיר את חומצה אולאית, חוזר שלוש פעמים.
    5. להוסיף 10 מ ל מים הרבדים אתר משולב עם טלטול עדין.
    6. לאסוף את מימית שלב ביחד (20 מ ל) ולהוסיף 20 מ ל אצטון עם vortexing 5 ס
    7. ספין למטה את המוצר ב 35,000 g × 10 דקות ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע. להמיס את התמיסה במים 2 מ"ל.
  2. הכנה של פולימר שונה UCNs (על-UCNs)
    1. לשלב 200 מ ג של חומצה polyacrylic (במספר דוכנים, Mw = 1,800) עם 20 מ ל מים על ידי sonication (60 kHz, 240 W) במשך 20 דקות להוסיף את UCNs הנ ל ללא ליגנד בפתרון במספר דוכנים עם בחישה נמרצת.
    2. להתאים את ערך ה-pH 7.4 על-ידי פתרון NaOH (1 מ') עם sonication (60 kHz, 240 W) עבור 30 דקות להעסיק את התערובת במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
    3. לאסוף את התמיסה על ידי צנטריפוגה ב 35,000 × g עבור 10 דקות מחדש להשעות את המוצר ב- 10 מ"ל מים על ידי sonication (60 kHz, 240 W) במשך 5 דקות, צנטריפוגה שוב ב 35,000 g × במשך 10 דקות חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    4. מחדש לפזר את המוצר 8 מ ל מים על ידי sonication (60 kHz, 240 W) עבור 5 דק לאחסן את הפתרון במקרר ב ~ 4 ° C עד הצורך.
  3. הכנת פונקציונלי nanoparticle DBCO-UCNs
    1. ספין למטה איך מכינים PAA@UCNs (מ ג 1) על ידי צנטריפוגה ב 35,000 × g עבור 10 דקות מחדש להשעות את התמיסה ב 1 מ"ל יבש DMF מאת sonication (60 kHz, 240 W) עבור 1 דקות ו צנטריפוגה שוב ב 35,000 × g עבור 10 דקות חזור על שלב זה פעמיים.
    2. להמיס התמיסה ב 200 µL יבש DMF בבקבוקון זכוכית. להוסיף HOBT (12.2 מ ג), EDC (14 מ ג), DBCO-NH 2 (5 מ ג) ו- DIPEA (16 µL) בבקבוקון עם ערבוב מגנטי עבור ה 24
    3. לאסוף את המוצר על ידי צנטריפוגה ב 35,000 × g עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התמיסה ב 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד צנטריפוגה שוב ב 35,000 g × במשך 10 דקות חזור על שלב זה שלוש פעמים.
    4. לפזר את המוצר ב- 0.2 מ"ל דימתיל סולפוקסיד וחנות במקרר-~ 4 ° C לפני השימוש.

3. Bioapplications של DBCO-UCNs בערוצים רגולציה של קרום בתאים חיים

  1. תרבות HEK293 התאים Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS, 100 יחידות/mL פניצילין, µg 100/mL סטרפטומיצין, לשמור על חממה humidified עם 5% CO 2-37 ° C. זרע 1 × 10 5 תאים 1 מ"ל DMEM/טוב בצלחת 12-ובכן ולשמור אותו בחממה עבור ה 24
  2. לשלב את פלסמיד (pCAGGS-ChR2-ונוס, 1 µg) עם ריאגנט תרביות תאים P3000 (2 µL) הנשר ' s מינימום הכרחי מדיה (מאמ) (100 µL) ב microcentrifuge הצינור A, ולהוסיף תקנים ריאגנט (1.5 µL) במם (100 µL) בצינור ב'
  3. דגירה התערובת של פתרונות צינורות A ו- B 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לשלב את הפתרון ב שפופרת A ו- B עם 400 µL מם. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל DMEM ללא סרום פעמיים.
  5. להוסיף את התערובת תרביות תאים 600 µL לתוך כל טוב של צלחת 12-ובכן, דגירה התאים-חממה 37 ° C עבור 4 h הסרה של המדיום, לשטוף פעמיים עם 1 מ ל DMEM.
  6. מוסיפים 1 מ"ל DMEM המכיל 1 µL Ac 4 ManNAz (50 מ"מ דימתיל סולפוקסיד) הבאר, לשמור על החממה במשך יומיים.
  7. להסיר את המדיום, לשטוף פעם עם 1 מ"ל PBS. מוסיפים 1 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%) פתרון כל טוב של צלחת 12-ובכן, דגירה ב 37 ° C עד תאים יש תלושים (~ 2 דקות). תרבות מחדש את התאים בקערה קונאפוקלית × 10 1 5 תאים/טוב ב 1 מ"ל DMEM נלון.
  8. להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל DMEM טריים עם 2 µL DBCO-UCNs (50 מ"ג/מ"ל) לתוך המנה כבר שעתיים ב 37 º C. עבור הדמיה קונאפוקלית, לשטוף תאים פעמיים עם DMEM ולהוסיף 1 µL רוד-N 3 (10 מ מ) ב-30 דקות
  9. לניתוח סידן תאיים, דגירה התאים עם התערובת של 1 µL רוד-3 בבוקר (10 מ מ), 10 µL Probenecid (250 מ מ), ו- µL 10 טעינת מאגר (Pluronic חומרים פעילי שטח polyols,0.1% w/v)) 1 מ"ל DMEM בינוני למשך 30 דקות בחושך.
  10. התאים עם DMEM ללא סרום וקונטה להאיר אור ניר nm 808 המינון של W/cm 0.8 2 למשך 20 דקות (5 דקות הפסקה לאחר 5 דקות תאורה).
  11. להקליט את תוצאות הדמיה-מיקרוסקופ קונפוקלי (מקור לייזר: 561 ננומטר לייזר; טווח גלאי: 610/75 ננומטר; עדשה: 100 x 1.4 נה שמן, זמן החשיפה: 100 ms). מוסיפים 1 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%) פתרון טוב לכל, דגירה ב 37 ° C עד תאים יש תלושים (~ 2 דקות). להשעות מחדש תאי 1 מ"ל PBS לניתוח (FCM) cytometry זרימה (לשעבר: 561 nm, Em: 582/15 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך סינתזה סכמטי של ליבה-קליפה מסטול לנתניד UCNs מוצגים באיור 1 ו- 2 איור. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) של שידור ברזולוציה גבוהה תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים (HRTEM) של nanostructures UCNs core ו- core-shell שנאספו בהתאמה (איור 1). UCNs ללא ליגנד שהוכנו על ידי הסרת חומצה אולאית הידרופובי על פני השטח של UCNs תמיסה חומצית, שונה עם פולימר הידרופיליות (במספר דוכנים). ואז הכתיר COOH במספר דוכנים-UCN...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה הציג שיטת הסינתזה של ליבה-קליפה מסטול לנתניד upconversion nanocrystals (UCNs) והסבת השטח שלהם עם moieties פונקציונלי עבור אפליקציות לסלולר. Nanomaterial הרומן הזה סגולות מצטיינים אופטי, אשר יכול לפלוט UV ו האור הנראה על עירור אור ניר באמצעות תהליך upconversion פוטון מרובה. ב פרוטוקול זה, nanostructures UCNs ליבה-קליפה (NaYF4: י. ב/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) מוכנות בשיטה משקעים משותף טמפרטורה גבוהה בתערובת של חומצה אולאית 1-octadecene. TEM התמונות להדגים המורפולוגיה של הליבה האלה והם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן בחלקו על ידי NTU-AIT-נאם MUV/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13), (RG 35/15) זכה ב אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang, סינגפור ו נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (NSFC) (מספר 51628201).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-OctadeceneSigma AldrichO806בדרגה טכנית
Sigma Aldrich364525כיתה טכנית
מתנולפישר מדעיA412כיתה טכנית
אתנולפישר מדעיA405כיתה טכנית
אצטוןפישר מדעיA18כיתה טכנית
HexaneSigma AldrichH292בדרגה טכנית
תוליום (III) אצטט הידרט (Tm(CH3CO2)3)Sigma Aldrich36770299.9% מתכות קורט על בסיס
ניאודימיום (III) אצטט הידרט (Nd(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32580599.9% מתכות קורט בסיס
Ytterbium (III) אצטט הידרט (Yb(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32601199.9% מתכות קורט בסיס
Yttrium(III) אצטט הידרט (Y(CH3CO2)3)Sigma Aldrich32604699.9% מתכות קורט בסיס
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Sigma אולדריץ'S5881בדרגת ריאגנט
אמוניום פלואוריד (NH4F)סיגמא אולדריץ'338869מגיב ACS
מימן כלורי (HCl)פישר סיינטיפיקA144בדרגת ריאגנט
(PAA)סיגמא אולדריץ'323667ממוצע Mw 1800
1-הידרוקסיבנזוטריאזול הידראט (HOBT)סיגמא אולדריץ'54802מגיב ACS
1-אתיל-3-(3-דימתיל-אמינופרופיל) קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)סיגמא אולדריץ'E7750
דיבנזוציקלאוקטין-אמין בדרגה מסחרית (DBCO-NH2)סיגמא אולדריץ'761540מגיב ACS
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)מגיב סיגמא אולדריץ'D125806ACS
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)פישר סיינטיפיקBP231
קו תאים HEK293ATCCCRL-1573סרום בקר עוברי אנושי
(FBS)סיגמא אולדריץ'F1051מגיב
ACS פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר1514012210,000 U/mL
פלסמיד (pCAGGS-ChR2-Venus)Addgene15753פלסמיד נשלח כחיידקים בדקירת אגר
Dulbeccoתרמו פישר מדיום נשר שונה (DMEM)תרמו פישר11965092גלוקוז גבוה
נשר שונה (MEM)תרמו פישר51985034מדיה סרום מופחתת
ליפופקטמין 3000 טרנספקציה ריאגנטתרמו פישרL3000015טרנספקציה על בסיס שומנים
N-אזידואצטילמנוסאמין, אצטילציה (Ac4ManNAz)Sigma AldrichA7605מגיב ACS
טריפסין-EDTA (0.25%)תרמו פישר25200056פנול אדום
רוד-3 AM ערכת הדמיית סידןThermo FisherR10145צבע פלואורסצנטי
5-קרבוקסי-טטרמתילרודמין-אזיד (Rhod-N3)Sigma Aldrich760757Azide-fluor 545
Confical dishibidi GmbH81158תחתית זכוכית, 35 מ"מ
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"לגריינר ביו-וואן227261פוליפרופילן
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםגריינר ביו-וואן188271פוליפרופילן
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה חרוטייםגריינר ביו-וואן616201פוליפרופילן
פנילמתיל שמן סיליקוןקלירקו63148-52-7פחות מ-320 מעלות צלזיוס
מדחום זכוכיתGH ZealL0111/10מ -10 עד 360 מעלות צלזיוס
צלחת 12 בארותסיגמא אולדריץ'Z707775פוליסטירן
חומצה אולאית חומצה פוליאקרילית בדרגה טכנית אופטי מדיום מוצרי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10 (12), 968-973 (2011).
  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543 (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28 (24), 3987-4011 (2016).
  4. Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
  5. Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136 (6), 2248-2251 (2014).
  6. Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  7. Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44 (6), 1416-1448 (2015).
  8. Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3 (5), 317-330 (2013).
  9. Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51 (25), 6121-6125 (2012).
  10. Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
  11. Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6 (8), 560-564 (2012).
  12. Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22 (30), 3266-3271 (2010).
  13. Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4 (1), 129-154 (2014).
  14. Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44 (6), 1346-1378 (2015).
  15. Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25 (28), 3758-3779 (2013).
  16. Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1608-1634 (2015).
  17. Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
  18. Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54 (27), 7915-7919 (2015).
  19. Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11 (2), 835-840 (2011).
  20. Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44 (6), 1379-1415 (2015).
  21. Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44 (6), 1318-1330 (2015).
  22. Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9 (7), 1634-1644 (2014).
  23. Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1680-1713 (2015).
  24. Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51 (13), 3125-3129 (2012).
  25. Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44 (6), 1526-1560 (2015).
  26. Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45 (36), 14101-14108 (2016).
  27. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  28. Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56 (11), 3031-3035 (2017).
  29. Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5173-5178 (2016).
  30. Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47 (10), 3052-3060 (2014).
  31. Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9 (11), 3698-3718 (2017).
  32. Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6 (13), 2439-2457 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DBCO

מאמרים קשורים