הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

19.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56420

⸱

27 בדצמבר 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

במאמר זה

סיכום

אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

תקציר

ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.

מבוא

בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח"כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.

ח"כ טסיות התוצרת מן בליטות cytoplasmic שנקרא proplatelets, אין ויוו, כ עונה 1 פרק 1011 טסיות הם יצרו מדי יום כדי לקיים את ספירת טסיות של 150-400 x 109/L. טסיות ייצור במבחנה הוא עד 1000 -מקפלים נמוך יותר מאשר ה- ויוו הערכות3, זה נתן עלייה לתנאים תרבות רבים באמצעות CD34+ ובתאים hematopoietic כדי לשפר את ח"כ, טסיות ייצור במבחנה. המקור הראשוני של CD34+ התאים המשמש ח"כ בידול היה דם היקפיים אנושי4. מקורות תא אחרים כוללים את מח העצם5,6, עובריים תאי גזע/המושרה pluripotent תאי גזע (ESC/iPSC)7הטבור דם (UCB)8,9,10 . מח עצם האדם CD34+ 11 ו העכבר שושלת היוחסין שלילי מח עצם תאים5 התוצרת ח"כ ולבנים וטסיות דם בתוך חוץ גופית; ובכל זאת, חוסר זמינות של מח עצם האדם מגביל את השימוש בו כמקור CD34+ תאים. לעומת זאת, ESC, iPSC מייצגים מקור מוגבל של תאים עבור ייצור טסיות במבחנה . טסיות ייצור של תאים אלה דורש מזין תאים תאים OP9 מאתר ו תקופות ארוכות יותר של תרבות. טסיות נגזר בתנאים ללא מזין להיראות פחות פונקציונלי12. טסיות נגזר iPSC נוטים להיות השימוש בהגדרות קליני מאז הם ניתן להרחיב בקנה מידה גדול. תהליך זה דורש lentiviral בתיווך התמרה חושית של גורמי שעתוק, תא לטווח ארוך תרבות13.

UCB הוא מקור נגיש של CD34+ התאים יכולה בקלות לשמש מחקר הגדרות. TPO לבד יכול לקדם את הבידול של כבל דם-derived CD34+ תאים וזה מעורר חברי כנסת מאוד טהור, בוגר ללא צורך תוספי סרום או תרבות משותפת עם מזין תאים. ציטוקינים אחרים כגון SCF עשויה להקטין בידול מ- UCB CD34+ תאים, בעוד ליגנד Flt-3 ו- IL-11 לקדם את הייצור של ילדותי megakaryocytes14. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של תרבויות ח"כ מאוד טהור של דם טבורי CD34+ תאים בתנאים ללא סרום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי דרום מזרח סידני האנושי מחקר ועדת האתיקה, שאושררה על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של האוניברסיטה של ניו סאות וויילס. דם טבורי שהושג מתורמים בריאים סופק על ידי סידני בנק דם טבורי (NSW, סידני, אוסטרליה). כרכים של 100 מ ל שימשו עבור הליך זה.

הערה: עבודה ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic Class II אבטחה. Decontaminate החיצוני של שקית הדם טבורי עם 70% אתנול. להשתמש בכלים סטריליים (מספריים, פינצטה) עבור הליך זה.

1. כבל תאי הדם הכנה ובידוד של CD34 תאים+

  1. להכין את ההפרדה סטרילי מאגר (SB) בתמיסת פוספט buffered (PBS), ב- pH 7.2, המכילה 0.5% שור אלבומין ו- 2 מ מ EDTA.
  2. לוותר על 10 מ"ל של SB לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (צינור אחד לכל 10 מ"ל של דם זה נדרש). באמצעות מחט בוטה G18 רכוב על מזרק 10 מ"ל, לצייר 10 מ"ל של דם מתוך התיק, לוותר על תוך הצינורות 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של SB.
  3. להוסיף 15 מ"ל של לימפוציטים ההפרדה מדיה (ראה טבלה של חומרים) לתחתית הצינור המכיל את הדם מדולל, יצירת שתי שכבות.
    הערה: לוותר על מדיה לאט בחלק התחתון של צינור כדי להימנע מערבוב הרבדים השונים.
  4. צנטריפוגה צינורות ב g × 1,200 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם בלי הפסקה, אין האצה.
  5. להעביר את השכבה ליד המרכז של הצינור המכיל תאי תאים (כ 5-10 מ"ל מהצינור כל) לתוך צינור 50 מ ל באמצעות פיפטה של פסטר. להוסיף SB כל שפופרת את הנפח הכולל של 50 מ.
  6. Centrifuge ב 400 g × 10 דקות ב RT. להשליך את תגובת שיקוע.
  7. Resuspend תא כדורי בזהירות עם פיפטה פסטר ב 5-10 מ ל SB. לשלב את התאים מושעה ולהביא נפח 50 מ עם SB.
  8. ספירת תאים באמצעות צביעת Trypan blue ו- hemocytometer או אוטומטיות תא מונה (ראה טבלה של חומרים). כדי לקבוע את אחוז CD34+ תאים במדגם, resuspend 2.5 × 105 תאים µL 100 של SB, כתם על-ידי הוספת 10 µL של נוגדן anti-CD34-PE למשך 15-30 דקות ב 4 º C. ניתוח על ידי cytometry זרימה (איור 1 א').
  9. צנטריפוגה צינורות ב 400 g × 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    הערה: אם לא מיידית, תאי תאי שיכול להיות קפוא בשלב זה.
  10. Resuspend תאים µL 300 של SB לכל 108 תאים. להוסיף 100 µL של ה-FcR האנושי IgG (חסימת ריאגנט, ראה טבלה של חומרים) ו- µL 100 של CD34 beads מגנטי לכל 108 תאים. לערבב בעדינות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות.
    הערה: השעיה תא בודד נדרש (אם יש צורך, להעביר התאים למרות מסנן 30 מיקרומטר לפני הוספת ריאגנטים). השתמש את הכרכים ריאגנט המתוארים כאן עבור 108 תאים או פחות. עבור יותר מ-108 תאים, קנה המידה של ריאגנטים (SB, חסימת פתרון ולאחר beads מגנטי CD34) בהתאם.
  11. להכין את העמודה ההפרדה האם במהלך תקופת הדגירה על ידי הצבת העמודה LS בעל מגנטי כביסה עם 3 מ של SB. להשליך למסקנות.
    הערה: ניתן לטעון? האם ההפרדה עמודות עם תאים הכולל8 × 10 עד 2. עמודות קטן יותר, גדול יותר זמינים.
  12. להוסיף 5-10 מ ל SB לתערובת תא וזורקים צנטריפוגה ב 400 × g במשך 10 דקות את תגובת שיקוע.
  13. Resuspend התאים ב- 1.5 מ ל SB וטען התליה תא (1.5 מ ל) אל העמודה LS. לאסוף את הזרימה המכילות את התאים ללא תווית בשפופרת איסוף 15מל (שבר שלילי #1). תן את הנוזל לרוקן ולשטוף את העמודה עם 1.5 מ ל SB.
  14. לטעון את הזרימה (3 מ"ל) שנאספו בחזרה לתוך העמודה ולאסוף את הזרימה לשפופרת אוסף 15 מ"ל זהה (שבר שלילי #1). לשטוף את העמודה LS 3 פעמים עם 3 מ"ל של SB.
    הערה: אם יש צורך, תאים השבר שלילי (12 מ ל) יכול להיות מוכתם נוגדן anti-CD34 לאמת לכידתו של CD34+ תאים לפי העמודה LS.
  15. הסר העמודה במפריד מגנטי ותורידי תאים לאט עם פומפה מזרק לתוך צינור 15 mL החדש עם 2 מ ל SB.
  16. במקום העמודה בחזרה על עומס mL 2 תאים ומפריד מגנטי בחזרה לתוך העמודה. לאסוף את הזרימה, לשטוף עם 2 מ ל SB. זהו השבר שלילי #2 (4 מ ל).
  17. הסר האם העמודה מפריד מגנטי ולהוסיף 2 מ"ל של תאים SB. סומק בהתמדה בנחישות עם פומפה מזרק כדי לאסוף את CD34+ תא שבר. לספור את התאים באמצעות trypan blue מכתים, hemocytometer או מונה תא אוטומטית.
  18. צנטריפוגה צינור עם השבר חיובי ב g × 400 למשך 15 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend תאים בתקשורת ללא סרום עבור CD34+ תאים (SFM, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: אם לא מיידית, תאים שיכול להיות קפוא בחנקן נוזלי בשלב זה.

2. טוהר הסימון של CD34 מבודד התאים+

  1. כתם 2 x 104 תאים מן השבר חיובית עם נוגדן anti-CD34-PE µL, 20 µL נוגדן anti-CD45-PerCP למשך 15 דקות ב 4 ° C (שימוש נפרד צינור עבור פקדים isotype) 10 (איור 1B).
  2. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend צנפה ב 200 µL של SB.
  3. לבצע ניתוח תזרים cytometric, שער האוכלוסייה תא חי כדי לא לכלול פסולת (איור 1B). להגדיר את השער עבור אוכלוסיות חיובי PE ו- PerCP באמצעות PE ו- PerCP isotype שולטת (איור 1B), לקבוע את אחוזי CD34+/CD45+ תאים.

3. מגקריוציט בידול

  1. זרע 5 × 105 תאים למ"ל CD34+ תאי 2 מ של SFM בתוספת 50 ng/mL רקומביננטי האנושי thrombopoietin (rhTPO) לכל טוב בצלחת 12-. טוב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באווירה humidified. אם התאים נמצאים confluent לפני שהם נדרשים לניתוח, לקצור את התאים, התפצל ולס מרובים עם rhTPO ומדיה חדשה.
    הערה: צריך להיות מוכן בארות שניים או שלושה במיוחד כדי לפקח על בידול בנקודות זמן שונות (למשל, ימים 7, 9 ו-10).
  2. קציר תאים מן הבארות להפריש לפקח בידול מבלי להפריע התאים הבארות אחרים.
  3. כתם תאים עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC 20 µL, 10 µL, אנטי-GPIX/CD42a-Alexa עבור חיל הים 647 נוגדן באמצעי אחסון הסופי של µL 100. הגדר פקד צינור באמצעות נוגדנים שליטה isotype בהתאמה. תקופת דגירה של 15-30 דקות ב 4 º C.
  4. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף.
צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 200-300 µL של נתח SB. על ידי cytometry זרימה.
  • עבור כל fluorophore, לנתח את הפקדים isotype כדי להגדיר את gating לאוכלוסיות חיובית FITC, אלכסה הקמח 647. לנתח את הדגימות תא מוכתם כדי לקבוע את אחוז CD41+/CD42a+ להכפיל תאים חיובית, אשר מייצג את ח"כ בוגרת (איור 1C).
  • להמחשת מיקרוסקופי של תאים סמני פני כתם תאים כמתואר ב- 3.3.
    1. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה-400 g × עבור 10 דקות Resuspend בגדר 100 µL של SB, ספין על זכוכית-1000 g x עבור 5 דק תאים תיקון בשקופית על-ידי טבילה ב מתנול 30 ס' אוויר יבש, להוסיף 20 µL של טעינת המדיה המכילה דאפי (ראה טבלה של חומרים) , מכסים עם coverslip ולאחר להמחיש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א).
  • עבור ויזואליזציה של אנטיגנים תאיים, resuspend תאים ב- PBS ותקן עם paraformaldehyde (ריכוז סופי 1%) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כדי permeabilize את התאים, להוסיף טריטון-X 100 (0.1%), תקופת דגירה של תאים 15 דקות לשטוף עם 2 מ"ל PBS/0.1% טריטון-X 100. Resuspend ב µL 100 של PBS/0.1% טריטון-X 100, להוסיף אנטי-vWf, אנטי CD62p נוגדנים (דילול 1:200), תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, צנטריפוגה ב 400 g × 10 דקות, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף העכבר אנטי איג-Alexa 594 וארנבת אנטי-488 IgG-Alexa (1: 100). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף עם טריטון PBS/0.1% 2 מ ל- X 100, resuspend ב µL 100 באותו מאגר ולהוסיף 20 µL של אנטי-CD42b-APC. ואז לסובב את התאים על גבי מדרון זכוכית כפי שמתואר בשלב 3.6.1, הכנת דוגמאות להמחשת מיקרוסקופיים כפי שמתואר בשלב 3.6.1.
  • עבור פלואידיות נחישות, הקציר תאים ב ימים 12 או 13 של בידול. להוסיף 1 מ"ל של SB לשטוף. צנטריפוגה ב 400 × g 10 דקות, הכתם עם נוגדן anti-GPIIb/CD41-FITC µL 20 בנפח סופי של 100 µL. Incubate ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    1. לשטוף פעם עם 1 מ"ל של SB, resuspend צנפה ב- 300 µL של ציטראט היפוטוניק מאגר (1.25 מ"מ סודיום ציטרט, 2.5 מ מ נתרן כלורי, 3.5 מ מ דקסטרוז) המכיל 20 µg/ml propidium יודיד ל- 0.05% 100 טריטון-X. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    2. להוסיף RNase ריכוז סופי של 20 µg/mL, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור. לקבוע את עוצמת יודיד propidium על ידי cytometry זרימה על ידי איסוף אירועים 30,000 כדי 50,000 מכלל האוכלוסייה CD41-FITC+ (איור 2C).

    • 4. proplatelet סופרים, ספירת טסיות, והפעלה טסיות

    1. הקציר תאים (מתוך שלב 3.1) ב ימים 8 או 9 של בידול, זרע-1 × 104 תאים/טוב ב- 48-ובכן הצלחות µL 200 של SFM טרי בתוספת 50 ננוגרם למ"ל rhTPO. תרבות במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2-
      הערה: לצורך כימות, זרע בארות דולר. צפיפות נמוכה זה נדרש עבור ויזואליזציה, ספירת proplatelet מניבי קרונית דחיפה קלה Proplatelets בדרך כלל מתחילים להופיע לאחר יומיים של תרבות. הפסגה היא בין ימים 4 ו- 5.
    2. לספור את מספר proplatelet מניבי ח"כ בבאר שלם על מיקרוסקופ אור הפוך באמצעות 10 X או מטרות X 20.
      הערה: שלב מיקרוסקופ מחוממת (37 מעלות צלזיוס) היא עדיפה, מאז להשאיר את התאים בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת גורמת הצטמקות של הרחבות proplatelet. Proplatelets הם נצפו כהרחבות ארוך מהגוף MK. כל ח"כ ייתכן כמה בליטות proplatelet. כפי proplatelets לפתח, הגוף של ח"כ הקטנת גודל.
    3. קציר תאים, צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות בטמפרטורת החדר. כתם תאים עם נוגדן אנטי-האדם CD41-FITC µL 20, כפי שתואר בשלבים 3.3 ו- 3.4. לחשב את האחוזים של ח"כ מניבי proplatelet (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet מניבי חברי כנסת/טוב) / (סה כ CD41+ תאים / טוב)] x 100
    4. כדי לספור טסיות שוחרר לתוך המדיום תרבות, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות.
      1. כתם עם נוגדנים CD41-FITC נגד µL 20 למשך 20-30 דקות ב 4 º C. להגדיר את צינור שליטה באמצעות הנוגדן שליטה isotype בהתאמה.
      2. להוסיף 150 µL של SB ו 50 µL של ספירת חרוזים.
      3. לניתוח cytometric זרימה, הגדר את FSC ואת האס על סולם לוגריתמי. שימוש רגיל האנושית טסיות דם של טסיות דם עשיר פלזמה מוכתמים CD41-FITC כמתואר בסעיף 4.4.1 כדי להגדיר את דרך השער של טסיות הדם (איור 3 א).
      4. לנתח את טסיות הדם ויטראז'ים עם סופר חרוזים מאת cytometry זרימה. לאסוף 1,000 אירועים של ספירת חרוזים באמצעות את FSC מול מגרש פיזור האס (איור 3 א). לחשב את מספר טסיות בהתבסס על CD41-FITC חיובי אירועים (איור 3B) תוך שימוש בנוסחה:
        טסיות לכל µL = [(מספר אירועים חיוביים CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/לדגום נפח)]
    5. כדי לנתח טסיות הפעלה, בעדינות לערבב את התאים עם פיפטה פסטר ולאסוף 100 µL ימים 14 או 15 של תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מאגר (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, MgCl 1 מ2, 1.8 מ"מ CaCl2, 0.2 מ מ נה2HPO4, 12 מ מ NaHCO3, 5.5 מ מ D-גלוקוז, pH 6.5) של Tyrode, צנטריפוגה g x 200 עבור 5 דקות כדי הצניפה תאים.
      1. לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב g 800 x 10 דקות הצניפה חלקיקים בגודל טסיות.
      2. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר של Tyrode. להוסיף 20 µL של נוגדן PAC1-FITC, אדנוזין diphosphate (ADP) ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות נתח מאת cytometry זרימה כדי לקבוע את אחוז FITC אירועים חיוביים. טסיות דם אנושי טרי לשימוש מטופלים באופן זהה כפקד חיובי (איור 3C).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרבויות ח"כ הטהור מאד מכבל דם-derived CD34+ תאים. האחוז של CD34+ תאים כבל דם הוא כ 1.3%15 (איור 1 א') ואת המספר הכולל של תאי תאי (שלב 1.8) נע בין 90-300 x 106 ליחידה UCB. טוהר CD34 + CD45 + תאים לאחר בידוד נעה בין 90 ל 99% (איור 1B). ח"כ (כהגדרתו CD41+ תאים) הם נצפו בתחילת CD34 ללא סרום+ תא תרבויות בנוכחות rhTPO. יום 7, האחוז של ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח"כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.

    מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספת של ציטוקינים כגון גורם לתאי גזע, Flt 3 ליגנד, IL-3 ו- IL-6 תומך CD34+ תא התפשטות. עם זאת, התרחבות זו התוצאה טוהר ח"כ מופחת ב תרבות14. השיטה המוצגת כאן, באמצעות מדיה ללא סרום rhTPO ל...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <חזק>ריאגנטים לתרבית תאים
    רקומביננטי TPO אנושיMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605מדיה נטולת סרום עבור תאי CD34+
    שםחברהCatalog NumberComments
    >CD34 Isolation Reagents
    CD34 MicroBead kit ultrapureMiltenyi Biotec130-100-453ערכה זו כוללת את המגיב חוסם IgG האנושי FcR ומיקרו-חרוזי CD34. חרוזים אלה מכילים את שיבוט הנוגדנים נגד CD34 QBEND/10. השתמש בשיבוט אחר נגד CD34 לבדיקת טוהר (למשל שיבוט 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545אמצעי הפרדת לימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם/מ"ל)
    מאגר הפרדה סטרילי (SB)Miltenyi Biotec130-091-221מאגר זה מכיל תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2 המכיל 0.5% אלבומין בסרום בקר ו-2 מ"מ EDTA. ניתן להכין אותו באמצעות רכיבים סטריליים בדרגת תרבית תאים. הסר גז לפני השימוש מכיוון שבועות אוויר עלולות לחסום את העמוד.
    nameCompanyCatalog NumberComments
    Flow Cytometry and Cell Staining Reagents
    PE עכבר אנטי-אנושי CD34BD Biosciences340669Clone 8G12. זה יכול לשמש לבדיקת טוהר CD34. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.
    עכבר PerCP אנטי אנושי CD45BD Biosciences347464 דילול 1:10
    בקרת איזוטיפ PerCP BDBiosciences349044דילול 1:10
    FITC עכבר אנטי אנושי CD41aBD Biosciences340929דילול ריכוז נוגדנים סופי 1:5.
    APC Mouse אנטי-אנושי CD42bBD Biosciences551061נוגדן זה יכול לשמש גם לאיתור MK בוגר (אחוז התאים החיוביים בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם אנטי CD42a). ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.
    Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human CD42aAbD SerotecMCA1227A647Tמופץ כיום על ידי Bio-Rad. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10.
    Alexa Fluor 647 Mouse Negative ControlAbD SerotecMCA928A647מופץ כיום על ידי Bio-Rad. נוגדן בקרת איזוטיפ
    אנטי פון ווילברנד גורם ארנב פוליקלונליAbcamAB69941:200 דילול
    V450 עכבר אנטי הומנה CD41aBD Biosciences584251: 20 דילול
    V450 בקרת איזוטיפBD Biosciences5803731:20 דילול
    PAC1-FITC נוגדן BDBiosciences340507דילול 1:10
    עכבר אנטי CD62p חד שבטיAbcamAB66321:200 דילול
    Alexa Fluor 488 עז אנטי ארנב IgGInvitrogenA110081:100 דילול
    Alexa Fluor 594 עז אנטי עכבר IgGInvitrogenA110201:100 דילול
    Ig Isotype Control קוקטייל-CBD Biosciences558659נוגדן לבקרת איזוטיפ
    Propidium iodideSigma AldrichP4864
    CountBright חרוזי ספירה מוחלטתבדיקות מולקולריות, InvitrogenC36950ספירת חרוזים
    <חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
    <חזק>חומרים
    עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401עמודים קטנים וגדולים יותר זמינים גם מסחרית
    מגנט מפריד MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5 מ"ל צינורות FACS מפוליפרופילן תחתון עגול, עם מכסה הצמד, טכנולוגיות סטריליותבמבחנה352063
    שקופיותזכוכיתמדיית הרכבה של Menzel-GlaserJ3800AMNZ
    עם מדיום הרכבה DAPIVector LaboratoriesH-1200Antifade עם DAPI
    strong>שםCompanyCatalog NumberComments
    Equipment
    מיקרוסקופ הפוךLeicaDMIRB מיקרוסקופ
    מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissVert.A1
    מנתח תאיםBD BiosciencesFACS Canto II
    צנטריפוגה ציטוספיןThermoScientificCytospin 4
    Name>CompanyCatalog NumberComments
    Software
    Cell analyzer softwareBD BiosciencesFACS Diva תוכנה
    לניתוח תאים בודדיםTree StarFlowJo
    תוכנת מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissZen 2 blue edition
    <הפוך

    מקורות

    1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
    2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
    3. Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
    4. Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
    5. Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
    6. Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
    7. Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
    8. Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
    9. Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
    10. Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
    11. Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
    12. Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
    13. Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208(2016).
    14. De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
    15. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
    16. Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
    17. Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
    18. Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
    19. Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
    20. Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
    21. Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
    22. Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    תגיות

    CD34
    מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+
    צור קשר
    המלצה לספרייה

    פרטיות

    תנאי שימוש

    מדיניות

    2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.