הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

18K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56437

⸱

5 באוקטובר 2017

 , 
1Systems Biotechnology Research Center, Korea Institute of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

תקציר

הערכה רעילות חיוני להבנת השפעת כימיקלים על היצורים החיים בתחומים במדעי הביולוגיה בסיסי ויישומי. קרקע ללא מידע יונקים עגול תולעת, Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל ערך מחקרים הרעלים בשל הנוחות שלה חוסר סוגיות אתיקה בעלי חיים לעומת מערכות בעלי חיים יונקים. ב פרוטוקול זה, מתואר הליך מפורט הערכה רעילות של כימיקלים C . elegans. תרופה נגד סרטן קליני, etoposide, אשר מטרות טופואיזומראז האדם השני, מעכב שכפול ה-DNA של תאים סרטניים אנושיים, נבחרה כמודל בדיקה כימית. גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים נחשפו דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או etoposide ולאחר מכן הצמיחה של C. elegans נוטרה כל יום במשך 4 ימים על ידי התצפית סטריאו מיקרוסקופ. המספר הכולל של ביצים זיון של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide נספר גם באמצעות המיקרוסקופ סטריאו. טיפול Etoposide מושפע באופן משמעותי את הצמיחה ואת רבייה של C. elegans. על ידי השוואה של המספר הכולל של ביצים זיון של תולעים עם טיפול שונה תקופות של כימיקלים, אפשר לפתור אותה כי הרבייה רעילות של כימיקלים על רבייה C. elegans הוא הפיך או בלתי הפיך. פרוטוקולים אלה עשוי להיות שימושי עבור שני בפיתוח של תרופות שונות, הערכת סיכונים של חשיפה לרעלים סביבתיים.

מבוא

הערכה רעילות חיוני עבור הפיתוח של תרופות, בריאותיים, cosmeceuticals, כמו גם את הערכת הסיכונים של רעלנים סביבתיים שונים. המודל מכרסמים הוא אחת ממערכות הפופולרי ביותר ויוו ניסיוני במחקר זה רעלים; לחלופין, ללא מידע יונקים אורגניזמים כגון C. elegans גם בשימוש נרחב. מודלים להערכה רעילות Non-מידע יונקים מועילים בגלל לא רק בעלי חיים סוגיות אתיות אבל גם שמתאים להם והתועלת בהתחשב משתלמת, לתחזוקה בקלות שמאפשר, מהירות ואת הפארמצבטית1,2 3, ,4.

C. elegans, קרקע סביב התולעת נוצלה כחיה מודל בחקר ביולוגיה וכימיה בסיסי ויישומי שונים. . זה באורך של 1 מ מ, תולעים נימיות שקוף, אשר פשוט נשמר ב מוצק או נוזלי תולעים נימיות צמיחה מדיה (NGM) נמאס את הנבג החיידק Escherichia coli OP50 C. elegans יש מחזור חיים קצר, והוא N2 פראי-סוג C. elegans מטילה כ 300 ביצים. לכן, זה בקלות הופץ כדי לשמש חומרים ניסיוניים3,4,5. C. elegans גם כבר בשימוש נרחב במחקרים רעילות של הרבה סמים, מזהמים סביבתיים6,7,8,9.

משום תרופות נגד סרטן רבות למקד במהירות חלוקת תאים סרטניים, הם יכולים גם לפגוע במהירות חלוקת תאים נורמליים כגון מח העצם, אפיתל המעי, התאים זקיק השיער. לדוגמה, תרופות מעכבות טופואיזומראז למקד את תהליך שכפול ה-DNA של תאים סרטניים; לכן, גם מונעים במהירות חלוקת תאים נורמליים. כל היצורים החיים יש topoisomerases, אלה טופואיזומראז מעכבי ככל הנראה השפעה סביבתיות אקולוגיות6,10,11. לכן, פלטפורמה הערכה רעילות התרופה באמצעות חיית מודל הוא יקר עבור שניהם הפיתוח של תרופות ושל הערכת סיכונים סביבתיים.

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לבדוק הרעילות של etoposide, אשר הוא סוכן נגד סרטן קליני הזה טופואיזומראז מטרות II, כמו כימי רעיל דגם C. elegans. לענין זה, נתאר את שיטת המדידה לגודל הגוף ואת המספר הכולל של ביצים זיון ב- C. elegans שטופלו etoposide.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הניסוי כולו חייב להתבצע בתוך מעבדה מבודד נקי ומתוחזק על 20 ° C עם אבק נמוך ועם צמצום זיהום במהלך תולעת וטיפול חיידקי. למטרה זו, יש לבצע ניסויים תחת הלהבה של מנורת אלכוהול או שימוש ספסל נקי.

1. תחזוקה של C. elegans, ביצה ההכנה לבחינה כימי

  1. שמור על C. elegans N2 (var. בריסטול) על צלחת אגר NGM נמאס לחיות e. coli OP50 ב- 20 ° C 12 , 13.
  2. הכן גיל-מסונכרנות ביצים באמצעות אקונומיקה פתרון טיפול 5 או הזמן ביצה הנחת בשיטה 6 , 14 , 15-
    הערה: לפני הכנת ביצה, המעיל המכילות etoposide NGM לצלחת עם חום-לא פעיל e. coli OP50 כמפורט להלן. חום-לא פעיל E. coli OP50 משמש כדי למזער את הפעילות המטבולית של e. coli 6 , 16.

2. הכנת להשבית חום e. coli OP50 להזנה C. elegans במהלך מבחן רעילות

  1. להכין 500 mL שמרים זוגי טריפטון (DYT) בינוני כפי שמתואר בטבלה 1, לחסן מושבה בודדת של e. coli OP50 תרבותי אגר לוריא-Bertani (LB) צלחת 5.
  2. דגירה של e. coli OP50 ב חממה חזק עבור 14 h ב 37 ° C ו- 150 סל ד.
  3. לאחר צנטריפוגה למשך 30 דקות-3,220 x g ו- 20 ° C, הסר כל supernatant בינוני DYT ולהוסיף תערובת מראש של 25 מ ל S-buffer 250 µL של 1 מ' MgSO 4, 25 µL של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל (מומס באתנול). כל הפתרונות הללו בדרך סטרילית.
  4. Resuspend החיידק ומעבירים אותם אל צינור פלסטיק חד פעמיות 50-mL-
  5. עבור החום-איון, דגירה של resuspended e. coli OP50 באמבט מים למשך 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס
  6. מגניב עד לטמפרטורת החדר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. זה ניתן לאחסן עד לחודש אחד.

3. הכנת דימתיל סולפוקסיד NGM צלחות המכיל או של 1% או 750 מיקרומטר Etoposide

  1. הכן שני בקבוקי זכוכית נקי 200 מ ל. להוסיף 0.6 גר' NaCl, 0.5 גר' peptone, 3.4 גרם אגר, 195 מ ל מים מזוקקים, ואת של פגים בקבוק אחד. להוסיף הבקבוק הריק אחרים של פגים.
  2. בקבוקים אוטוקלב שני אלה למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס, ואז ארגע הבקבוקים באמבט מים למשך 30 דקות ב- 55 מעלות צלזיוס
  3. להוסיף 0.2 מ של 1 מ' CaCl 2, 0.2 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ של 1 מ' MgSO 4 ו- 5 מ של 1 מ' KPO 4 (כל הפתרונות הם סטריליים) ומערבבים אותם לאחר מכן על ידי בחישה מגנטית על פלטה בגיל 55 מעלות צלזיוס
  4. לחלק המדיום NGM מעורבים שני בקבוקים באותו אמצעי אחסון (100 מ ל כל אחד). לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד בקבוק אחד, לערבב אותו שוב באמצעות של בחישה מגנטית. לאחסן את הבקבוק השני באמבט מים בטמפרטורה 55 ° C עד השלב הבא. Aliquot 3 מ"ל של המדיום המכיל דימתיל סולפוקסיד כל 35 x 10 מ מ 2 פטרי. יכול להיות עשוי לוחיות המכילות דימתיל סולפוקסיד NGM 33 כ שלב זה.
  5. לערבב את הבקבוק השני באמצעות ערבוב מגנטי את, להוסיף 1 מ"ל של 75 מ מ etoposide (מניות מומס דימתיל סולפוקסיד), מערבבים שוב, חזור על הפעולות aliquot (שלב 3.4). כ 33 etoposide (750 מיקרומטר)-המכיל לוחות NGM יכול להיעשות מתוך שלב זה.
    הערה: ב מתואם הקודם נייר 6, בדקנו 0, 250, 500 ו-1000 מיקרומטר של etoposide. על סמך נתונים אלה, בחרנו את מיקרומטר 750 במינון etoposide? בעיתון הזה.
  6. מגניב למטה את הצלחות NGM המכילות חומר כימי לטמפרטורת החדר על ידי השארת אותם בטמפרטורת החדר במשך כ-3 שעות, ואחסן אותם ב 4 ° C עד שימוש.
    הערה: במקרה של כימיקלים רגישים לאור, לחסום את האור כדי למזער את הריקבון אור-induced.
    הערה: לחלופין, לעשות צלחת NGM נורמלי בלי כימיקלים על הביצה הנחת assay, אשר יכול להתבצע באמצעות שני תנאים שונים טיפול כימי כפי שמתואר להלן.
  7. µL להוסיף 100 של חום-לא פעיל e. coli OP50 (כפי שמתואר בסעיף 2), מפוזר על כל צלחת NGM. מאפשרים לילה יבש בתוך חממה C. elegans ב- 20 ° C עבור בדיקה כימית

4. מדידה של C. elegans צמיחה

  1. העברה גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים לצלחת NGM בתוספת 1% דימתיל סולפוקסיד או 750 etoposide מיקרומטר.
  2. Incubate. C. elegans באינקובטור ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים. לצפות את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לקחת תמונות מיקרוסקופיים כל יום. בדרך כלל 20 X הגדלה (1 עדשה המטרה X 2 X זום הגדלה, 10x עדשה מגדילה) מתאים התצפית צמיחה של C. elegans. גם לקחת תמונה מיקרוסקופית של מיקרומטר הבמה המיקרוסקופ עבור הכיול גודל התולעת.
    הערה: משפיע רעב הבדיקה רעילות. לכן, להאכיל עם מספיק חיידקים או להתאים את שהועברו C. elegans ביצה מספרים בהתחלה. להתבונן עד 3 ימים כדי לא לכלול את האפשרות של הרעבה.
  3. למדוד את אורך הגוף של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide בכל נקודה בזמן שימוש בתוכנה ImageJ.
    הערה: עבור כל אחת מהמידות לדוגמה, תולעים 50 מספיקים לניתוח סטטיסטי.
    1. , ImageJ, פתחו את התמונה מיקרומטר הבמה מיקרוסקופ (' קובץ ' → ' פתח ').
      הערה: התמונה מיקרומטר ואת תולעת תמונות (שלב 4.2) חייב להיות ההגדלה אותו.
    2. גרור שורה של מיקרומטר 1,000 מיקרומטר כיול התמונה על-ידי שימוש ' קו ישר ' כלי.
    3. לחץ ' ניתוח ' → ' לקבוע קנה מידה ' קלט 1000 ומיקרומטר לתוך ' ידוע מרחק ' תיבת ו ' יחידת אורך ' תיבה, בהתאמה. בדוק ' Global ' ולחץ על ' אישור '.
    4. פתח את התמונות תולעת (' קובץ ' → ' פתוח '). ציירו קו לאורך התכונה של כל תולעת באמצעות ' קו ביד חופשית ' בכלי. לקבל נתוני האורך הגוף על-ידי לחיצה על ' ניתוח ' → ' מידה '.
    5. חזור על שלבים אלה עבור תולעים 50-

5. C. elegans ביצה הנחת Assay

  1. Incubate גיל-מסונכרנות ביצים על NGM צלחת המכיל דימתיל סולפוקסיד או etoposide עבור 64 h (לפני הלידה הראשונה) עד השלב למבוגרים צעירים בגיל 20 מעלות צלזיוס
    הערה: זה אופציונליים לשימוש התולעים מן הניסויים מדידה לצמיחה. זה נוח לעשות את המדידה צמיחה, ביצה assay הנחת ביחד.
  2. 5 להעביר תולעים בוגרות כדי NGM חדש הצלחות ללא כימיקלים (מצב 1, טיפול כימי בתוך תקופה מסוימת של זמן, מביצים לשלב צעירים למבוגרים) או בצלחת NGM חדש המכיל את רעלני כימי זהה (מצב 2, חשיפה מתמשכת של כימיקלים דרך התקופה הכוללת ניסויית), ואז דגירה אותם עבור ה 24
    הערה: מומלץ לבצע ושכפול באמצעות לוחות NGM 3-5 עבור כל טיפול; משכפל אלה ניתן להשתמש לשם ניתוח סטטיסטי.
  3. להעביר לצלחת NGM חדש כפי שתואר לעיל, לספור את מספר ביצים כל יום. לספור את התולעים זחל, מת, ולא היו פנימי הצוהרבעריכת
  4. חזור על שלבים אלה עד התולעים להטיל ביצים יותר אין, בדרך כלל תוך 5 ימים.
  5. לחשב את מספר הביצים זיון לכל תולעת של כל צלחת, לסכם ערכים אלה כל יום במשך 5 ימים לקבוע את המספר הכולל של ביצים זיון.
    הערה: לא לכלול את מספר תולעים זחל ועד פנימי בקעו מן החישוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הטיפול etoposide (24-96 h) מפגר באופן משמעותי את הצמיחה של C. elegans. לאחר h 96 של דגירה, תולעים שטופלו etoposide גדלה 0.86 מ מ אורך הגוף, ואילו התולעים שטופלו הרכב גדל 1.04 מ"מ (איור 1). פיגור גדילה נצפתה גם ככל הנראה תחת השגחה סטריאו מיקרוסקופ (איור 2). התחלנו לראות את הביצים של התולעים רכב שטופלו ב- 72 h של דגירה. מצד שני, ביצים נצפו לאחר 96 שעות של טיפול etoposide. מנתונים אלה, אנחנו משערים כי הטיפול etoposide מושהי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, אנו מתארים את ההערכה רעילות של כימיקלים ב- C. elegans, נמטודות, באמצעות etoposide כדוגמה toxicant. למטרה זו, השתמשנו בשני תנאים ניסיוני. במערכה הראשונה, C. elegans גדלו על etoposide המכיל לוחות מביצים על הבמה למבוגרים צעירים, ואז התולעים הורשו להטיל ביצים על צלחות NGM רגילה ללא כימיקלים. במערכה השנייה ניסיוני, C. elegans טופלו באופן רציף etoposide לאורך כל תקופת כל ניסיוני. על ידי השוואה של המספרים ביצה בין שני התנאים ניסיוני, אנחנו יכולים להחליט אם רעילות הרבייה של תרכובות שנבדקו היה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי את קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה מחקר מגזר גרנט (2E27513), את גבוהה ערך מוסף מזון טכנולוגיה פיתוח התוכנית (IPET) ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון לענייני כפרי (315067-03).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgarAffymetrix, ארה"ב10906
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
כולסטרול, ארה"בC3045
דימתיל סולפוקסידסיגמא, ארה"בD2650
Escherichia coli OP50Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
EtoposideSigma, ארה"בE1383
Image J תוכנה (גרסה 1.4)המכון הלאומי לבריאות, ארה"
https://imagej.nih.gov/ij/ מצלמת מיקרוסקופJenopitk, פרוגרס גריפקס, גרמניה
פפטוןמרק, ארה"ב107213
35 ופעמים; צלחת פטרי 10 מ"מSPL מדעי החיים, דרום קוריאה10035
90 & times; צלחת פטרי 15 מ"מSPL מדעי החיים, דרום קוריאה10090
מיקרוסקופ סטריאוניקון, יפןSMZ800N
תמצית שמריםבקטון דיקינסון, ארה"ב212750
סיגמא מסוג פראיב

מקורות

  1. Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
  2. Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
  3. Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
  4. Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
  5. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
  6. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
  7. Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
  8. Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
  9. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
  10. Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
  11. Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
  12. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  13. Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
  14. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
  15. Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
  16. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
  17. Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
  18. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
  19. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
  20. Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
  21. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

רעילות ב-C. elegansרעילות כימיתמבחן צמיחת נמטודותניטור רבייהמיקרוסקופיה סטריאוסקופיתטיפול ב-Etoposideבקרת DMSOביצים מסונכרנות גילהכנת פלטות NGMמדידת אורך הגוף
מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.