Method Article

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האדם norovirus האסלאם נוקם בריאות הציבור ניכר והפסדים כלכליים ברחבי העולם. מתעוררים במבחנה טיפוח ההתקדמות עדיין אינם ישימים עבור זיהוי שגרתית של הנגיף. כימות טכניקות, אשר מסתמך בעיקר על הגברה חומצת גרעין, וזיהוי הנוכחי לא להפלות זיהומיות של נגיפים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה היא להציג פרטים ספציפיים על ההתקדמות טכניקות המשמשות ביחד כדי לקבל עוד מידע על מצב infectivity של נגיפים. טכניקה אחת כוללת הערכת קשירה של aptamer ssDNA norovirus כדי capsids. Aptamers יש את היתרון של להיות מסונתז בקלות והוא שונה, ויש זול ויציב. טכניקה נוספת, דינאמי פיזור אור (DLS), יש את היתרון של התנהגות capsid בפתרון. מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של שלמות המבנה של capsids נגיפי. למרות והבטיחה, יש מספר חסרונות כל טכניקה, כגון aptamer שאינם ספציפיים מחייב מפרוטונים שמטענם מולקולות של מטריצות לדוגמה, הדרישה של capsid מטוהרים עבור DLS, ורגישות המסכן עבור מיקרוסקופ אלקטרונים. ובכל זאת, כאשר שיטות אלה משמשים בשילוב, הגוף של נתונים המיוצר מספק מידע מקיף יותר על תקינות capsid norovirus ניתן להסיק infectivity, מידע חיוני עבור הערכה מדויקת של השתקה של כרומוזום שיטות או פרשנות של וירוס האיתור. מאמר זה מספק פרוטוקולים בשיטות אלה להפלות norovirus האנושי זיהומיות חלקיקים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Norovirus האנושי הוא אחראי על נטל ניכר בבריאות הציבור ברחבי העולם, גורם על 685 מיליון מחלות ותמותה 212,000 מדי שנה1, בעלות של מיליארדים של דולרים2,3. היום, norovirus זיהוי, כימות כרוך הגנום הגברה ו/או פלטפורמות מבוססות-ליגנד. הראשון הוא בדרך כלל עדיף כפי שהוא רגיש יותר, מספק מידע כמותי, יש סיכון נמוך יותר באופן כללי של תוצאות חיוביות שגויות4. הנפוץ ביותר norovirus זיהוי, כימות הגנום הגברה הטכניקה היא תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (RT-qPCR). כי היא מטרות, מגביר את מקטע קטן של הגנום האנושי norovirus, RT-qPCR לבד אינה מסוגלת האפליה בין זיהומיות ופגעו חלקיקים שאינן זיהומיות, כמו ה-RNA הגנומי חינם, capsids המכיל הגנום, capsids עם אנושות מוטציה/קטום הגנום יכול עדיין להיות מוגבר על ידי RT-qPCR. בעוד שני במבחנה הטיפוח-תרגול טכניקות חדשות norovirus אנושי5,6 דווחו לאחרונה, שניהם עדיין לסמוך על RT-qPCR על וירוס כימות, עדיין לא ריאלי שיטות שגרתיות קליני/סביבתיים בדיקת noroviruses האנושית. לפיכך, RT-qPCR נשאר תקן הזהב בדיקה קלינית/סביבתיים.

שיטות אחרות במבחנה פותחו במטרה להעריך טוב יותר את המצב infectivity של חלקיקים norovirus. שיטות אלה יכולים להיות מסווגים בדרך כלל כ אלה המטפלות שלמות capsid norovirus ואלה הערכת תקינות הגנום. הגישה פופולרי יותר. השיטה הנפוצה היא RNase רעלני לפני מיצוי של נגיפי RNA הגנומי, אולם זה אינו חשבון נגיפים נשארים בעינם, אך חוסר היכולת לאגד מארח קולטנים/co-גורמים, כמו גם חלקיקים נגיפיים כי יש מוטציה אנושות או יש נחתך או שולית פגום הגנום7. שלמות capsid גם ניתן להעריך בהתבסס על היכולת של הווירוס כדי לאגד norovirus האנושי co-receptor/co-גורמים, אשר הם פחמימות המכונה אנטיגנים קבוצה היסטו-דם (HBGAs). HBGAs נמצאים בתאי האפיתל במעי מארח כחלק glycoproteins או glycolipids (בין מספר רקמות אחרות), עשוי להיות מופרש בנוזלי גוף שונים כמו רוק. בה חיידק המכילים חומרים דמויי-HBGA על משטחים שלהם יש גם הוכח כדי לאגד norovirus האנושי8,9,10, אינטראקציות כאלה עשויים לקדם norovirus זיהום5. התפיסה הבסיסית של ניצול HBGA מחייב הוא כי רק מסוגל מחייב את בשם הקולטן/co-factor נגיפים יהיה מסוגל להדביק תאים. מחקרים רבים מראים כי מבוסס-חרוז איגוד HBGA שקדמו חומצת גרעין הגברה היא שיטה מבטיחה infectivity אפליה11,12,13,14, 15,16. האתגר העיקרי לגבי HBGAs היא כי אין סוג HBGA יחיד באפשרותך לאגוד כל norovirus אנושיים אחרים. כדי לטפל בבעיה זו, שימש חזירי mucin קיבה, אשר מכיל HBGAs, במקום פחמימות מטוהרים HBGA כדי לשמור על נוחות של סינתזה, עקביות, עלות מופחתת.

פרסום זה התבצעה על ידי מור. et al. 17 הציג סט של טכניקות חדשות עבור הערכת תקינות capsid norovirus אנושי. במקום HBGAs, מור. et al. 17 חקרו את הכריכה של חומצת גרעין בהרחבה תגובתי aptamer (M6-2)18 ו ש GII.4 סידני שילדת norovirus capsids (חלקיקים דמויי וירוס או האח מים)19 בהרחבה תגובתי נוגדנים חד שבטיים (NS14), לעומת זאת על הכריכה כדי HBGAs סינתטי. חומצת גרעין aptamers הם קצר (~ 20-80 nt) יחיד נטושים חומצות גרעין (ssDNA או RNA) לקפל לתוך מבנים תלת מימדיים ייחודיים כתוצאה הרצף שלהם, לאגד מטרה. כי הם חומצות גרעין, הם פחות יקר; בקלות כימית מסונתז מטוהרים, שונה; יציב לחום קיימים מספר דיווחים של aptamers שנוצר נגד noroviruses, עם חלק מהם מציג תגובתיות רחב מגוון של זנים18,20,21,22. דוגמה, מור. et al. 17 הפגינו את aptamer M6-2 קשורה norovirus האנושי מטוהרים, שהורכב capsids (האח מים) ו התנהגה באופן דומה כדי HBGA והתלות capsid ויראלי כדי לשמור על מבנה החלבון סדר (למשל, משניות ושלישוניות) גבוה יותר עבור כריכת להתרחש. מצד שני, חלק ניכר norovirus האח מים מחייב נוגדן NS14 נותרה לאחר היו capsids שפגע בסימני לחלוטין. הערכה של איגוד norovirus במחקר על ידי מור. et al. 17 נעשתה באמצעות שיטה פשוטה, המבוססים על צלחת דומה, אליסה, למעט כי aptamers משמשים במקום נוגדנים (ומכאן השיטה נקראה ELASA). זו השיטה הניסיונית של תפוקה גבוהה שימש כדי להעריך את ההשפעות של טיפולים שונים על capsid norovirus, עבודה זה חשוב להבנת המנגנון של איון ויראלי בתגובה לחשיפה לחצים פיזי או כימי. עם זאת, חסרון אחד לשיטה זו הוא נמוך יותר רגישות חוסר סובלנות כלפי מזהמים מטריקס-הקשורים ברמות גבוהות יותר, הגורמות מחייב שאינם ספציפיים על-ידי aptamers.

מור. et al. 17 להשתמש בשיטה אחרת, אור דינאמי פיזור (DLS), כדי לפקח על צבירה של נגיפים בתגובה טיפול בחום. DLS משמש בדרך כלל כדי להעריך את הגודל של ננו-חלקיק המתלים, הורחבה חלבונים23,24 ווירוסים25,26,27. עוצמת האור מפוזר על ידי חלקיקים בתמיסה תנודות כפונקציה של גודל החלקיקים, המאפשר חישוב מקדם דיפוזיה ולאחר מכן קוטר חלקיקים באמצעות נוסחות ומבוססת. הטכניקה DLS יכולים להבחין הקוטר hydrodynamic של חלקיקים התפזרו עד הננומטרי, המאפשר זיהוי של וירוסים התפזרו, חלבונים capsid בודדים או הדימרים אגרגטים וירוס מבוסס על גודל27. מצבור וירוס, המיוצג על-ידי עלייה גודל החלקיקים, הוא מרמז על אובדן של capsid שלמות. Capsid הוא שפגע בסימני, המבנה שלו משובשות, שאריות הידרופובי הופכים חשופים וגורמים החלקיקים להישאר ביחד ויוצרים אגרגטים. DLS יכול לשמש כדי למדוד את גודל החלקיקים לאחר טיפול שצוין או את קינטיקה של מצבור בזמן אמת17,28. בשיטה זו יש את היתרון של ומאפשר תצפית בהתנהגות capsid בפתרון אך דורש ריכוז גבוה של capsid מטוהרים, אשר ייתכן שאינו לגמרי נציג של הוירוס במצבו הטבעי.

השיטה האחרונה מנוצל על ידי מור. et al. 17 היה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). למרות ששיטה זו חסר רגישות, אינו מייצר נתונים כמותיים, היא מאפשרת הדמיה של ההשפעות של טיפולים שונים על המבנה capsid ויראלי. למרות שלא עדיין אידיאלי עבור הגדרות קליני/סביבתיים, השימוש בשיטות אלה בשילוב הוא חשוב בהבנת האדם norovirus איון. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקולים מעמיק המבוסס על צלחת איגוד וזמינותו (ELASA), DLS, והשתמשו בשיטות הכנה TEM כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים תרמיים על capsid norovirus בהקשר של ההשפעות של הטיפולים על capsid שלמות כפי שהוצג במור. et al. 17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מבוססת על צלחת איגוד וזמינותו עבור הערכת אובדן של סדר Norovirus Capsid למבנה גבוה

הערה: פרוטוקול ELASA דומה מאוד לאחד המוצגים כאן כבר פורסם 29, מבחני ELASA דומה בעבר דווחו חלק ממחקר מאמרים במקום 17 , 18 , 22-

  1. טיפול בחום של האדם norovirus סידני GII.4 capsids
    1. להשיג norovirus האנושי מטוהרים capsid הגדולות חלבון (VP1) של סידני GII.4 (ההצטרפות: JX459908) התאספו capsids.
      הערה: Capsids במחקר התקבלו באדיבות Atmar ר (ביילור לרפואה, יוסטון, טקסס).
    2. Dilute capsids ל µg/mL 50 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.2) באמצעי אחסון מרבי של 15 µL של הפרט הכתיר המבחנות. להבטיח כי הצינור מכיל לפחות 600 ng של capsid. ודא כי יש 600 ng של capsid לכל שילוב טיפול-ליגנד.
    3. מחממים הצנטרפוגה תרמי לטיפול החום הרצויה.
      הערה: למטרות של פרוטוקול זה, טיפול ב 68 מעלות צלזיוס בזמנים שונים (0 - 25 דקות) נבחר.
    4. מחממים הצנטרפוגה תרמי נוסף של עד 4 ° C לקירור מיידי. להוסיף צינורות עם פתרון capsid הצנטרפוגה תרמית עבור הזמן המבוקש. מיד להעביר הצנטרפוגה טרום מקורר-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לאחר חימום. טיפול
      1. כלול 95 ° C עבור 5 דקות כפקד capsid שפגע בסימני. כולל פתרון capsid לא מטופל (23 ° C) כפקד חיובי. כוללים PBS עם אין capsid כפקד שליליים נוספים של.
    5. בקצרה ספין למטה ומפרידה כדי לקבל טיפות כל לתחתית הצינור ו לדלל את הפתרונות capsid שטופלו ב- PBS 3 µg/mL. ודא שיש לפחות 200 µL של capsid מדולל, מטופלים (100 µL היטב).
  2. µL 100 להחיל capsid לפתרון כל טוב, ולהבטיח ישנן לפחות שתי בארות לכל טיפול. בנוסף, כוללים 2 בארות שליטה עם 100 PBS µL עבור כל ליגנד; פעולה זו מספקת את ספיגת רקע של וזמינותו. כסה את הצלחת עם מכסה, החותם הקצוות עם פרפין סרט כדי להקטין התאדות, ולהשאיר לילה על חממה חזק ב 4 ° C או עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  3. הכן המאגר חסימה על ידי 5% חלב רזה מוצקים (w/v) ב- PBS עם 0.05% Tween 20 (PBST).
  4. להסיר את הפתרונות capsid שטופלו לצלחת. להוסיף 200 µL/טוב של מאגר חסימה. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר או בן לילה, אטום ב-4 מעלות צלזיוס
    5. הכן ליגנד מחייב פתרונות aptamer biotinylated 18 , M6-2 29 ו- biotinylated-סוג דם HBGA-סינתטי-A או סוג biotinylated ה
    1. Dilute aptamer biotinylated 1 מיקרומטר במים נטולי נוקלאז. ודא שיש מספיק לפתרון 200 µL הכולל עבור כל טיפול. לדלל שבחרת biotinylated HBGA כדי µg/mL 30 במאגר חסימה. ודא שיש מספיק פתרון עבור 200 µL הנפח הכולל עבור כל טיפול.
      הערה: כדי להשתמש פחות HBGA, 10 µg/mL של HBGA ב- 0.25% חלב רזה-PBST הרבה. יש כבר אופטימיזציה, דיווחו בעבר ריכוזים עבור biotinylated M6-2 ו- HBGA.
  6. להסיר חסימה מאגר ולשטוף את הצלחות 3 פעמים עם µL 200/PBST טוב. ללטף את הצלחת במהופך על מגבות נייר סטרילי לייבוש הלחות שיורית.
  7. µL להוסיף 100/טוב של ליגנד מחייב פתרונות, המבטיח כי ישנם 2 בארות לכל שילוב טיפול בחום-ליגנד. דגירה לצלחת מכוסה עם מכסה שייקר מסלולית-בערך 60 סל ד לשעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: הקפד לכלול 2 בארות כל לא מטופל capsids ו לחלוטין שפגע בסימני capsids עבור כל ליגנד כפקדי חיוביים ושליליים, בהתאמה. בנוסף, כוללים 2 " אין capsid " בארות כל ליגנד כמו צלחת רקע שליטה.
  8. להסיר את הפתרונות ליגנד ולשטוף הבארות 3 פעמים עם µL 200/PBST טוב. לטפוח את הצלחת במהופך על מגבות נייר סטרילי לייבוש לחות שיורית.
  9. µL להוסיף 100/טוב של פתרון של 0.2 peroxidase streptavidin-חזרת µg/mL, ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין-תפקודי לב / נשימה.
    הערה: streptavidin שונים-חזרת peroxidase conjugates יש ריכוזים שונים. להתייעץ עם המשתמש ' s ידני עבור הטווח האידיאלי של ריכוזים ליישומים אליסה של האנזים ולהיות בטוח זה אופטימלי.
  10. להסיר הפתרון תרכיב. לשטוף 3 פעמים עם µL 200/PBST טוב. לטפוח את הצלחת במהופך על מגבות נייר סטרילי לייבוש לחות שיורית.
  11. להוסיף 100 µL/טוב 3,3 ', 5, 5 '-המצע tetramethylbenzidine (שוייץ), ולאפשר את הצבע לפתח עבור 5-15 דקות להתבונן בארות שליטה שלילי עבור כל צבע ולהיות בטוח לפתח בעקביות באותו הזמן בין לוחות שכפל. להיות מודע הטווח לקורא צלחת בשימוש, כמו גם ספיגת.
    הערה: הזמנים המתפתח עשויות להשתנות בהתבסס על האיכות של ליגנדים/ריאגנטים להשתמש.
  12. לעצור את התפתחות התגובה בחומצה זרחתית 1 מ' µL/טוב 100. מיד קרא הצלחת 450 ננומטר. לשמור את הנתונים.
    הערה: מבוא של החומצה בדרך כלל מאיטה את התגובה באופן דרסטי. אבל לא לגמרי לעצור אותו אל תשאירו את הצלחת הפסיק בסכום ממושכת של זמן לפני קריאת את ספיגת.

2. ניתוח תוצאות Assay המבוסס על צלחת

  1. לשמור את הנתונים הגולמיים ספיגת בתוכנית גיליון אלקטרוני. לייצר את absorbances הממוצע עבור כל זוג טוב עם טיפול מיוחד, ליגנד. להשתמש אלה ממוצעים עבור כל ניתוח עוקבות.
    הערה: להשוות שני absorbances טוב כדי להיות בטוח כי אין זוגות של וולס יש ערכים שונים משמעותית.
  2. כדי לנתח את שלמות מוחלטת capsid (מחייב כל), להפחית את ספיגת raw של " capsid אין " שליטה של כל ערך ספיגת מדגם אחר.
    הערה: לחלופין, אבדן האיגוד עקב אובדן למבנה (משנית, שלישוני, רבעוני) סדר גבוה ניתן ישירות לנתח. במקום לחסר את ספיגת של הפקד שלילי (אין capsid), לחסר את ערך הפקד capsid שפגע בסימני לחלוטין. זה מסיר את איגוד כל אות לא ספציפית מחייב את המנגנון לקיומן מחייב בשל הרצף capsid. HBGA, aptamer M6-2 להציג מחייב הקטנה לחלוטין שפגע בסימני capsid, אז אחת מהשיטות מייצרת תוצאות דומות. אות חיובי כוזב לייחס aptamer לא ספציפית מחייבת יש לקחת בחשבון בעת בחירת איזה ניתוח להשתמש.
  3. עם שלילית או שפגע בסימני מנוכים שליטה absorbances, לחלק את הטיפול absorbances על ידי חיובית שלהם בהתאמה (ללא טיפול) לשלוט absorbances ולהתרבות ב- 100. פעולה זו מספקת את האחוז של סימן capsid שטופלו ביחס הפקד אינו מטופל.
  4. כדי להעריך את מידת איגוד השידור עבור כל ליגנד לייחס רצף capsid, להפחית " אין capsid " שליליות שליטה absorbances הראשוני, ולקחת את ספיגת מנוכי עונתיות של capsid denatured. זה מתחלק ספיגת מנוכי עונתיות של האות בקרה חיובית, הכפל אותה ב- 100. זה נותן את אחוז אות בשל הכריכה ליגנד לרצף שפגע בסימני capsid/capsid לכאורה.

3. DLS לגילוי וירוס צבירת לאחר טיפול בחום

הערה: השלבים שלהלן עשויות להיות ספציפיות התוכנה, מכשיר בשימוש, אבל יכול להיות מותאם וחלים מכשירים דומים.

  1. צור גודל חדש סופ ב DLS כלי התוכנה באמצעות: חומר = חלבון, Dispersant = PBS, טמפרטורה = 25 ° C, Equilibration זמן = 0 שניות, סוג התא = cuvette חד פעמיות (קטן נפח, ZEN0040), מדידת זווית = 173° Backscatter, משך זמן המדידה = אוטומטי, מספר המדידות = 3, עיכוב בין מדידות = 0 שניות, עיבוד נתונים: ניתוח מודל = למטרה כללית (הרזולוציה הרגילה). השתמש בהגדרות ברירת המחדל עבור הפרמטרים האחרים.
  2. בחר בחץ לרוץ הירוק בתוך התוכנה, ותנו שם את הדגימה.
  3. בצע שלבים 1.1.1 דרך 1.1.4 לטיפול חום האח מים.
  4. Dilute החום מטופלים האח מים 1:10 ב- PBS 1 x עבור ריכוז הסופי של 5 µg/mL. (אופציונלי) לסנן את הדגימה עם 1 מיקרומטר גודל הנקבוביות כדי להסיר חלקיקי אבק; DLS הוא מאוד רגיש לאבק, כמו חלקיקים גדולים פיזור האור הרבה יותר מאשר חלקיקים קטנים.
    5. Cuvette
  5. µL 50 להעביר באחמי מדולל לאמצעי אחסון קטנות חד פעמיות. להוסיף את cuvette לתוך התא מדגם של המכשיר-
  6. להתחיל לרוץ, ולהשתמש ' Correlogram ', ' Cumulants מתאים ', ו ' ייעוץ מומחה ' הלשוניות כדי להעריך את איכות הנתונים.
    1. במהלך הריצה, בדוק כי ערך אינדקס polydispersity הוא פחות מ- 0.3, המייצג מדידת איכות. בבית ‘ multi-view ’ טאב, ודא מקדם המתאם הוא קבוע, קרוב, אך לא יותר מ 1, בזמן קצר, טיפות את חדה ל- 0 במועד מאוחר יותר, האופייניים גודל החלקיקים. השתמש ‘ ייעוץ מומחה ’ טאב לקבלת משוב על איכות הנתונים במהלך המדידות.
    2. לאחר המדידה תושלם, בדוק שוב כי ערך אינדקס polydispersity הוא פחות מ- 0.3. ודא כי cumulants מתאימים כדלקמן שורת הנתונים מצביע מקרוב, ‘ Cumulants מתאים ’ בכרטיסיית
  7. לקחת הממוצע של הקוטר של חלקיקים Z-הממוצע שדווחו עבור כל מדידה כמו גודל החלקיקים של כל דגימה. מגרש בקוטר של nm לעומת טמפרטורה של ° C.

4. DLS לצורך זיהוי צבירת וירוס בזמן אמת

הערה: השלבים הבאים עשויים להיות ספציפיים התוכנה, מכשיר בשימוש, אבל יכול להיות מותאם וחלים מכשירים דומים.

  1. צור גודל חדש סופ ב DLS כלי התוכנה באמצעות: חומר = חלבון, Dispersant = PBS, טמפרטורה = כזמן Equilibration הרצויה, = 0 שניות, סוג התא = קוורץ cuvette, מדידת זווית = 173° Backscatter, משך זמן המדידה = אוטומטי, מספר המדידות = 50 (עשוי להיות קצב צבירת מוגבר או ירד בהתאם), עיכוב בין מדידות = 0 שניות, עיבוד נתונים: ניתוח מודל = מספר מצבי צר (רזולוציה גבוהה). השתמש בהגדרות ברירת המחדל עבור הפרמטרים האחרים.
  2. בחר בחץ לרוץ בתוך התוכנה כדי לפתוח ולתת שם מדגם חדש, ולאפשר את המכשיר להגיע את האיזון טמפרטורה.
  3. להשעות את האח מים ב- PBS X 1 צינור microcentrifuge-ריכוז של µg 5/mL ואמצעי בין 200-500 µL. מערבולת ההשעיה.
  4. ספין למטה ההשעיה האח מים במשך 5-10 s ומפרידה שולחן לגז ולהשתחרר. הדבר מסייע למנוע היווצרות בועה במהלך הטיפול חום המפריע מדידות גודל.
  5. העברת האיש החשוב הבולם כדי קוורץ נפח קטן cuvette-להימנע בועות, פיפטה לאט הקיר של cuvette. לאחר המכשיר הגיעה הטמפרטורה שיווי משקל, להוסיף את cuvette אל החדר דגימה.
  6. לחכות 10 s עבור הטמפרטורה מדגם equilibrate, לאחר מכן התחל ההפעלה. להפעיל טיימר בתחילת המרוץ. לעצור את שעון העצר בסוף המדידה הראשונה. לנצל את הזמן כנקודה בפעם הראשונה. להשיג נקודות זמן עוקבות, עת המדידה שהוקלט על ידי התוכנה-
  7. להתחיל לרוץ, ולפקח על correlogram, הפצה מתאימה ולאחר ייעוץ מומחה כדי להעריך את איכות הנתונים.
    הערה: PDI לא בהכרח יהיה שפחות מ 0.3 למדידות אלה כמו הדוגמה צפוי להיות polydisperse במהלך צבירה.
    1. לוודא מקדם המתאם הוא קבוע, קרוב, אך לא יותר מ-1 בזמן קצר, נופל בחדות ובזמנים אחד או יותר מאוחרים האופייניים גודל החלקיקים.
    2. ודא כי ההתפלגות מתאימים כדלקמן שורת הנתונים מצביע מקרוב.
  8. לנתח את הנתונים גודל.
    1. לקבוע בכל נקודת ההבדל בזמן בין מדידה בכל נקודת זמן הראשונית. מדידה משכים אינם בדיוק אותו הדבר.
    2. באמצעות הפצה של אינטנסיביות, להקליט את הגודל של הפסגות עם האזורים הגדול ביותר עבור כל נקודה מדידה/שעה-
    3. העלילה על הקוטר שיא ב- nm לעומת זמן בדק.

5. הכנת הדוגמא TEM

  1. קבל פחמן תמיכה רשתות הקולנוע (ניקל) תוכנן עבור TEM.
    הערה: התייעץ עם המתקן הליבה על ריאגנטים המומלצת והטיפול שלהם לשימוש עם המיקרוסקופ מתקן. הקפד לאחסן רשתות בתוך קופסה המכילה סופג לחות או תא ואקום כדי למזער את החשיפה לחות.
  2. דמעה כ 5 ס"מ x 5 ס"מ פיסות נייר סינון. להשיג זכוכית פטרי, סגירה עצמית נאותה להפוך פינצטה מיועד לשימוש במיקרוסקופ.
  3. לחתוך כ 2.5 ס מ x 5 ס מ חתיכת סרט פרפין. במקום benchtop.
  4. טיפול בחום של norovirus סידני GII.4 capsids
    1. פעל בהתאם לנוהל טיפול בחום בדיוק כפי שתואר לעיל צעדים 1.1.1 - 1.1.5 חוץ: להשתמש 10 מ מ HEPES (pH 7.4) לטיפול במקום PBS ו לא לדלל יותר capsids לאחר הטיפול (שמור פתרון-µg 50/mL). Pipette µL ~ 15 כל טיפת פתרון capsid שטופלו על גבי הסרט פרפין.
  5. לתפוס את הקצה לרשת עם פינצטה, ומאפשר להם לסגור על הקצה כדי להחזיק את הרשת, ומניחים על רשת הפחמן לצד השני על גבי הירידה של פתרון שטופלו. תן תקופת דגירה של 10 דקות לאפשר את capsid לצרף לרשת.
    1. בהתאם הטוהר של הכנת capsid, להוסיף במידת הצורך בצורה של 10-15 טיפות µL ממוקם בשורה לאחר ה-droplet capsid שטופלו שוטף של הפתרון HEPES 10 מ מ.
    2. אחרי 10 דקות, להרים את הרשת עם ה-droplet. מניחים את הרשת כמעט בניצב פיסת נייר סינון עד לפתיל משם ה-droplet. להרים את ה-droplet של 10-15 µL HEPES מאגר עם הרשת, להחזיק 30 s, אז ויק משם עם עוד פיסת נייר סינון כדי ווש
  6. במקום 15 µL droplet של 2% uranyl אצטט פתרון על הסרט פרפין אזור ריק.
    1. לאסוף את ה-droplet אצטט uranyl עם הרשת והחזק למשך הפתיל ס' 45 משם את אצטט uranyl, הקפד להסיר את מרבית הפתרון. המקום הפחמן-הצד רשת על פיסת נייר סינון, להיות זהיר כי הרשת אינה " מקל " לחות על הפינצטה. מניחים נייר הסינון עם הרשת על זה בכוס פתוח פטרי.
      הערה: אין להשתמש פלסטיק צלחות פטרי, כמו הרשתות יהיה electrostatically נמשך אליהם ולא להיות תקוע על צלחת-
  7. חזור על כל הטיפולים. הכנס את החצאים צלחת פטרי עם הרשתות desiccator בין לילה להתייבש לפני תצפית עם TEM.
  8. להתייעץ עם המתקן מיקרוסקופ במוסד בהתאמה בנוגע התבוננות הרשתות מוכן. במתקנים מסוימים להתיר למשתמש לעבור הכשרה על פעולת המתקן שלהם ' s המכשיר. פרטים ספציפיים לגבי ההתקנה ו התבוננות במיקרוסקופ ספציפי זה ב'eyond הטווח של מאמר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלמות. המבנית של האדם norovirus סידני GII.4 capsids (האח מים) הוערכה באמצעות מספר שיטות רומן כפי שהוצגו על ידי מור. et al. 17. קודם כל, נעשה ניסוי שהיו על capsids השלמות כפונקציה של היכולת שלהם לאגד בשם קולטן/co-factor (HBGA) או של ssDNA aptamer (M6-2) בהשוואה (איור 1). התוצאות מוצגות הוצגו בעבר על ידי מור. et al. 17, להדגים אופן הפעולה של איגוד aptamer M6-2-capsid היה דומה לזה של וירוס-HBGA ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול ואת הטכניקות המתוארות כאן מספקים אמצעי הערכת norovirus האנושי capsid תקינות/הפונקציונליות של.... שיטות אלה יכול לשמש להשגת תובנה מכניסטית ההשפעות של איון טיפולים נגד הנגיף, באופן פוטנציאלי יכול לשמש כתוספת מסורתיים יותר שיטות ההערכה איון כמו assay RT-qPCR או פלאק. למשל, הערכת איון כימיים או פיזיים על-ידי פלאק assay לבד מספקת אמצעי מדידה של מידת איון וירוס אבל לא המנגנון הבסיסי של איון זה. גם, צבירת וירוס יכול לגרום underestimation של כייל נוגדנים, ולכן מגזים יעילות טיפול30. שיטות אלה יכו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי חקלאות, מזון המחקר יוזמת תחרותי מענק מס 2011-68003-30395 מחלקת החקלאות של ארצות הברית, המכון הלאומי של המזון, החקלאות באמצעות הפרויקט NoroCORE. מימון עבור גישה פתוחה תשלום סופק על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ברצוננו להודות רוברט Atmar (ביילור לרפואה, יוסטון, טקסס) בחביבות לספק לנו את capsids מטוהרים ואת ואלרי לפאם על הסיוע עם תמונות TEM. אנחנו רוצים גם פרנק נ' בארי. תודה שעזרת לנו להתחיל את הניסויים שהוצגו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>מבחן קשירה מבוסס צלחת להערכת אובדן מבנה קפסיד נורו-וירוס מסדר גבוה יותר
96 בארות, צלחת EIA מחייבת בינוניתפישר (קוסטאר)07-200-36
מכסה לצלחת 96 בארותתרמו פישר3098
סרט פרפין (פרפילם)תרמו פישרPM999
1x PBS (pH 7.2)Life Technologies20012-050
פוליסורבט 20סיגמא-אולדריץ'P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% פוליסורבט 20N/AN/A
נורו-וירוס אנושי מטוהר ומורכב GII.4 קפסידיםN/AN/A
צינורות PCR בודדים 0.2 מ"לGenesee Scientific22-154G
2 thermocyclersBio-Rad
מיני צנטריפוגה שולחניתפישר סיינטיפיק12-006-901
מוצקי חלב רזהתרמו פישרLP0031B
היסטו-דם סינתטי סוג A דו-סוכר, גליקוטק ביוטיניל01-017
אפטמר ביוטיניל M6-2 (ריכוז מלאי 100 ומיקרו; M במים נטולי נוקלאז): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'טכנולוגיות DNA משולבותN/A
מצומד סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז (דרגת ELISA), אנו משתמשים ב-Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
מצע 3,3',5,5'-טטרמתילבנזידין (TMB), טמפרטורת החדרThermo Fisher50-76-00
1 M חומצה זרחתיתN/AN/A
קורא מיקרופלייט מסוגל לקרוא 450 ננומטרTecanInfinite m200 Pro
NameCompany>Catalog Number>Comments
>ניתוח תוצאות בדיקה מבוססות צלחת
Microsoft Excel או תוכנית דומהN/A N/A
nameCompanyCatalog NumberComment
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, או מכשיר דומה לניתוח גודל חלקיקיםMalvern InstrumentsN/A
VortexFisher Scientifc02-215-365
קובטה קוורץHellma104-002-10-40
קובטה חד פעמית בנפח קטן (להפחתת השימוש ב- VLP)Malvern InstrumentsZEN0040
שםCompanyCatalog NumberComments
<חזק>שידור אלקטרונים מיקרוסקופיה הכנת מדגם
ניקל רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונים עם סרט תמיכה בפחמןLadd Research10880-100
פינצטה מיקרוסקופ אלקטרונים הפוכה סגירה עצמיתטד פלה5372-NM
נייר סינון איכותיסיגמא-אולדריץ' (ווטמן)WHA1002055
צלחות פטריSigma-AldrichBR455743
100 מ"מ תמיסת HEPES (pH 7.2)N/AN/A
2% אורניל אצטטN/AN/A
1861096 זכוכית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Related Articles