מאמר שיטה

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56451

⸱

5 בדצמבר 2017

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

תקציר

אף אורגניזם מורכב מופיעות סטטי, הרקמות שלהם נמצאים תחת מחזור רציף. כמו תאים גיל, למות, והם יוחלפו על ידי תאים חדשים, תאים להעביר בתוך רקמות באופן הדוק מתוזמר. במהלך התפתחות גידולים, את האיזון מופר, ולהשאיר תאים סרטניים האפיתל ממוצא לפלוש את microenvironment המקומי, כדי לנסוע לאתרים מרוחקים, ובסופו של דבר להקים גידולים גרורות באתרים מרוחקים. וזמינותו נקודה היא assay פשוטה, מימדי ההעברה ללא הגבלה, כדי להעריך את התנועה נטו של גיליונות תא לתוך אזור ללא תא, וכדי לנתח את הפרמטרים של נדידת תאים באמצעות הדמיה בצילום מואץ. . הנה, וזמינותו נקודה הוכח שימוש של האדם פולשני, ריאות המושבה ויוצרים השד סרטן תאים בטור, MCF10CA1a, כדי לנתח בתגובה הנדידה התאים גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר ידוע כדי להגדיל את פוטנציאל ממאיר של תאים סרטניים בשד, כדי לשנות את פנוטיפ הנדידה של תאים.

מבוא

העברת מבחני נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את הפוטנציאל פולשני ולא גרורתי של גידול תאים במבחנה. הנפוץ ביותר הפצע או גירוד assay משמש כדי להעריך את ההעברה של אפיתל גיליונות2,31,אזור תא מסומנת. כדי לבצע את הבדיקה מאפס, התאים הם מצופים לתוך טפט, "שריטה" או מאזור תא נוצר עם טיפ פיפטה. וזמינותו גירוד קל להגדיר עם תרביות רקמה זמין נפוץ אספקה, ניתן לבצע גם צלחות רב טוב, ומאפשרת עיבוד של דגימות מרובים. עם זאת, כפי השריטה נעשית, התאים יוסרו פיזית טפט, לעיתים קרובות עוברים מוות של תאים. יתר על כן, מטריצה חוץ-תאית מחובר לצלחת פגום לעיתים קרובות במהלך התהליך של גירוד. בדומה לכך, השימוש של סיליקון מוסיף (כגון Ibidi צ'יימברס4) או של סטנסילים5,6,7 יכול להוביל להפרעה מכנית של התאים הסרת חלקי של מטריקס חלבון ציפוי צלחות. חיסרון נוסף של מבחני פיקוח על סגירתו של פצעים או שריטות הוא קורס שלהם לזמן מוגבל, רק יכול להיות מנותח נדידת תאים עד השריטה סגורה.

ביצוע וזמינותו נקודה, התאים הם מצופה כמושבה מעגלית על גבי צלחת עם או בלי ציפוי8. הרציונל שאסטרטגיה זו ציפוי הוא לקבל תא סדינים עם קצוות מוגדרים, שניתן להעביר או לפלוש לתוך האזורים הסמוכים נטול תאים מבלי להפריע את התרבות על ידי הסרה של תאים או מוסיף. המטרה הכוללת של וזמינותו נקודה היא לבחון את ההעברה של גיליונות תא כפי שנמדד על-ידי קצה העקירה או מושבת קוטר, כמו גם כדי לבצע הדמיה בצילום מואץ כדי לנתח את פנוטיפ הנדידה של תאים בעתיים רזולוציה גבוהה יותר.

נדידת תאים יכולים להיות מושפעים מגוון של רמזים microenvironmental כמו נוגדנים, ציטוקינים גורמי גדילה כגון EGF. EGF הוא פקטור גדילה זה מפעיל את השפעותיו ביולוגי באמצעות קשירה לקולטן שלו, EGF קולטן9, ומגביר את התנהגות פולשנית ולא גרורתי של גידול תאים4,9,10. כאן, וזמינותו נקודה משמש ללמוד EGF מגורה נדידת תאים במושבה האנושי פולשני, ריאות ויוצרים השד סרטן תא קו (MCF10CA1a)8,11,12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ציפוי של מנות (יום 1)

הערה: הקפד לא להשאיר טביעות אצבעות או לכלוך בתחתית הצלחת בעת טיפול זה.

  1. הפשרת העכבר קולגן הרביעי על קרח, לדלל את זה עם 50 מ"מ HCl (pH 1.3) להכין 3 מ"ל של פתרון הרביעי 10 µg/mL קולגן.
    הערה: קולגן לזרז ב 37 º C. לכן חשוב לשמור את הפתרון קולגן בטמפרטורה נמוכה בעת מפשיר ובעבודה עם זה. להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה על-ידי הכנת aliquots בגודל מתאים ואחסונם ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. להוסיף 250 פתרון קולגן הרביעי µL כל טוב של לוחות זכוכית 12-ובכן, למקם אותם לתוך קופסת פלסטיק בגודל מתאים, סגירה הדוקה. מניחים מגבת נייר רטובה מעל ומסביב הלוחות מייצרים תא לח ולסגור את תיבת. דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: כפי רק את אזור הגידול צריך להיות מצופה, זה מספיק לכסות רק על הרכב כיסוי, אשר מצורף בתחתית הלוח, עם פתרון קולגן (ראה איור 1A, B עבור סכימטי של צלחת).
  3. למחרת בבוקר לשטוף צלחות עם יונים H2O פעמיים כדי להסיר קולגן שאינו נספג ומאגר. לכוון את המים עד לקצה הלוח לא עד הקצה שהוקמה על ידי בתחתית צלחת של coverslip (אם מים זה pipetted לתוך האיזור שזה ישחה). מילה נהדרת הלוחות בשכונה זרימה שכבתית. השתמש צלחות מיד או לאחסן ב 4 ° C עד 5 ימים.
    הערה: שורות תאים שונים עשויים לדרוש שונים ציפוי, כגון fibronectin או קולגן אני.

2. ציפוי וזמינותו נקודה (יום 2)

  1. הכנת התליה תא
    1. כדי להכין תא ההשעיה, להשתמש בתאים כך כבר גדלו בקערה תרביות רקמה 60 מ מ בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% סרום סוס כדי 80% הנהרות
    2. לשטוף את התאים בתמיסת פוספט באגירה של סידן, מגנזיום-ללא Dulbecco (DPBS) פעם אחת, להוסיף µL 500 טריפסין-EDTA (בטמפרטורת החדר), דגירה התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור 37 ° C, 5% CO2, אווירה humidified.
    3. להשעות את התאים מנותקת במדיום תרבות 4.5 מ ל להפסיק פעילות טריפסין, נחשב 20 µL aliquot של התליה תא ב hemocytometer.
    4. גלולה התאים הנותרים צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב g x 200 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים תרבות בינוני 3 x 106 תאים/מ ל....
      הערה: עבור אחרים ציפוי דיאלקטריים ו/או שורות תאים, צפיפות תא אופטימלי יש ליצור בסדרה דילול. 3 x 106 תאים למ"ל מומלצת כנקודת התחלה.
  2. תאי ציפוי
    1. המקום טיפת 10 µL תא ההשעיה במרכזו של כל תלוש הכיסוי של הקולגן הרביעי מצופה צלחת זכוכית 12-ובכן התחתון בלי לגעת או לשרוט את הציפוי (איור 1א', ב'). דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, האווירה humidified, כדי לאפשר את התאים לצרף. צ'ק במיקרוסקופ הפוך התאים מחוברים.
      הערה: ניתן בצורה הטובה ביותר לראות בקצה הירידה, איפה היווצרות טפט יכול להיות שנצפו (איור 1C). במידת הצורך, דגירה את הצלחת עד ה 3 להיות בטוח כי הלחות בחממה הוא מספיק גבוה כפי הטיפות יכול להתייבש במהירות. אם נצפית ירידה של אמצעי האחסון טיפה במהלך שלב זה, להוסיף החללים בין הבארות כדי להגדיל את הלחות PBS.
    2. יש לשטוף בעדינות הבארות עם 1 מ"ל של תרבות בינוני פעמיים כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. להוסיף 1 מ"ל תרבות בינוני כל טוב. צ'ק במיקרוסקופ הפוך כי לא התאים צפים נשארים, אחרת לשטוף שוב את הבארות. דגירה תאים בין לילה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, האווירה humidified, כדי לקבל גיליונות תא מוגדרים היטב.
      הערה: תאים צף סביר כדי לצרף מחדש הצלחת ואת להקים מושבות תאים לא רצויים.

3. גירוי תאים (יום 3)

  1. בדוק כל הבארות באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שתא מושבות גדלו כראוי. במידת הצורך, מארק בארות ומבניות, אל תשתמש בהם.
  2. תווית מכל קידוח של צלחת הולם עבור כל תנאי חקר. הפעל כל תנאי כפול או משולש.
  3. לשנות את המדיום לרעוב התאים DMEM/F12 המכיל סרום הסוס 0.1% (רעב בינוני) h 3 לפני התאים הם גירוי.
  4. לגרות את התאים על ידי תוספת של EGF (ריכוז סופי 5 ng/mL) או עוד מגשרים הרצוי ומערבבים בעדינות את המדיום באמצעות micropipettor 1 מ"ל או על-ידי מתערבל לצלחת.
  5. דגירה שלוחית 1-4 ימים לבחון את קצה הזחה וירידה קצה מתאר כמתואר בסעיף 4.1 או לבצע הדמיה בצילום מואץ כמתואר בסעיף 4.2.

4. ויזואליזציה של מושבות תאים, נדידת תאים

  1. Hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת למדידת צמיחה המושבה (היום 4-7)
    1. לתקן תאים ב- 70% אתנול (1 מ"ל/טוב) ~ 2 דקות.
    2. כתם גרעינים עם hematoxylin (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
    3. תאים תשטוף עם מים מהברז (1 מ"ל/טוב) עד הגרעינים הם כחול, 5-10 דקות.
    4. הציטופלסמה הכתם עם אאוזין (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
    5. לשטוף עם מים יונים (1 מ"ל/טוב).
      הערה: Hematoxylin ופתרונות אאוזין יכול להיות ונשתמש בהם מספר פעמים עד ההכתמה הופך להיות חלש.
    6. מילה נהדרת צלחת.
    7. הפוך את הצלחת ולמדוד את הקוטר נקודה עם סרגל. לחלופין, לצלם תמונות של הצלחת עם מצלמה, ולנתח נקודה בקוטר של ImageJ.
  2. זמן לשגות מיקרוסקופ (3 ביום)
    1. . הפעילי את המיקרוסקופ חממה ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס. למלא מעשיר dH2O. התאם CO2 ל 5%. ודא כי תא חממה הוא humidified כי השלב ממונע יכול לנוע בחופשיות. לסגור את תא חממה ולאפשר המיקרוסקופ להסתגל 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: המיקרוסקופ (ראה טבלה של החומרים) להשתמש כאן צריך להיות מחומם עד 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני התאים הם צילמו כדי למנוע היסחפות של המוקד.
    2. למקם את הצלחת על השלב של המיקרוסקופ חממה והגדר את הרשימה הבמה. תמונת שני קצוות מנוגדים, המרכז של כל נקודה תא (איור 1א').
    3. קח תמונות כל 3 דקות, עבור h 15-24 באמצעות המטרה X 10. להוריד את הנתונים ולהמשיך עם ניתוח תמונות בתוכנית של בחירה, למשל, ImageJ או Matlab.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

וזמינותו נקודה המובאת כאן (איור 1) בוצעה באמצעות פולשני, ריאות המושבה ויוצרים תאים סרטניים בשד (MCF10CA1a) כמערכת מודל. וזמינותו נקודה התשואות תא מאוד לשחזור נקודות אפילו בידו של מתחילים נוחה וקלה לביצוע assay (איור 1D). וזמינותו נקודה בשילוב עם הוא מכתים, או הדמיה בצילום מואץ ומאפשר velocimetry תמונת החלקיקים הבאים (PIV) המחקר של פרמטרים שונים של העברה כולל עקירה של קצוות אפיתל, מהירות תא תא כיוון כמו תאים בקצוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במהלך הגידול התקדמות התאים נודדים מן הרקמה ממוצא לפלוש הרקמה שמסביב, גרורות באתרים מרוחקים15. נדידה של תאים מן מושבה התא יכול להיות שנצפו ב- dot וזמינותו. . הנה, וזמינותו נקודה מודגם על ידי ניתוח של פנוטיפ הנדידה של תאי סרטן השד אנושי בתגובה EGF.

כדי להשיג תוצאות מדויקות ו לטבלה הניתנת לשכפול מספר שלבים בקביעת בנקודה מבחני הם קריטיים. ראשית, הציפוי של הצלחת קובע אם, כמה תאים חזקים יכולים לדבוק הצלחת ואם להעביר תאים. להקפיד כי הציפוי של הצלחת עם קולגן IV או אחרים מטריצה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר אין לחשוף.

תודות

המחבר מבקש להודות Bhagawat סבראמאניאן, צ'נג יי (ג'ייסון), פול Randazzo, קרול האב לקרוא ולהעיר על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לסרטן, מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי MCF10CA1aמכון המחקר KarmanosN/Aהמשמשים לבדיקת
קולגן עכבר IVBD Biosciences354233משמשים לציפוי צלחות
טריפסין / EDTAThermo Fisher25300054המשמש להסרת תאים מלוחות תרבית רקמות
DPBS Mediatech21-031-CVהמשמש לשטיפת תאים
DMEM / F12Thermo Fisher11320082משמש כסרום סוס בינוני תרמו
26050088משמש להשלמת תרבית בינונית
צלחת תחתונה מזכוכית 12 בארותMatTekP12G-1.5-14-Fהמשמשת לגידול תאים להדמיית
EGF (גורם גדילה אפידרמיס, רקומביננטי אנושי)PeprotechAF-100-15המשמש לגירוי תאים
ללא חומצות שומן BSASigmaA8806-1Gהמשמש לייצור חיץ
להמטוקסיליןSigmaHHS32המשמש לצביעה של מושבות
אאוזיןמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית26051-10המשמש לצביעה של מושבות
37 & #176; C, 5% CO2 חממתSanyoדגם MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver עם תא חממה ושלב ממונעZeissדגם Axio Observer.Z1משמש להדמיית זמן-lapse מצלמת
ORCA Flash LT sCMOS מצלמתBioVisionC11440-42U-KITהמשמשת להדמיית זמן-lapse בשילוב עם Zeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMICתוכנה המשמשת להדמיית זמן-lapse
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסדגם IX70המשמש לספירת תאים ולבדיקת מושבות בקופסת פלסטיק בתרבית רקמות
Lock& מנעולN/Aמשמש כתא לח (ניתן להשתמש בכל קופסת פלסטיק סגורה הדוקה המתאימה לצלחות)
תאי EGF

מקורות

  1. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  2. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  3. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  4. Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).
  5. Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
  6. Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
  8. Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).
  9. Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
  10. Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501(2013).
  11. Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
  12. Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
  13. Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).
  14. Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
  15. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  16. Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
  17. Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EGFTime LapseH and E4MCF10CA1a

מאמרים קשורים