הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

15.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56453

⸱

6 בפברואר 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

תקציר

התקדמות meiotic של הזכרים הוא תהליך הדורש פעולה מתואמת של מספר אירועים הסלולר בעלות רגולציה. שגיאות שאירעו במהלך המיוזה יכול להוביל פוריות, אובדן הריון או פגמים גנטיים. . מתחיל עם תחילת גיל ההתבגרות וממשיכים לאורך הבגרות, גלים סינכרונית למחצה רציפה של spermatocytes עוברים יצירת זרע, ובסופו של דבר להקים זרע הפלואידי. הגל הראשון של העכבר spermatocytes שעברו חניכה meiotic מופיעים ב יום 10 לכתיבה (10 dpp), משתחררים לתוך לומן של בקוריאנית וכמה כמו זרע בוגרת ב 35 dpp. לכן, זה יתרון כדי לנצל עכברים בתוך חלון הזמן התפתחותית זו כדי להשיג את אוכלוסיות מועשר עניין. ניתוח נדיר תא שלבים קשה יותר בעכברים בוגרים בשל תרומתה של גלים spermatogenic רצופים, אשר מגבירים את המגוון של אוכלוסיות סלולר בתוך בקוריאנית. השיטה המתוארת כאן היא טכניקה מיושמים בקלות על הערכה cytological של התאים המצויים על בקוריאנית וכמה עכברים, כולל spermatogonia, spermatocytes ו- spermatids. הטכניקה סקווש צנורית שומר על השלמות בתאי הנבט זכר מבודדת ומאפשרת בחינת מבנים הסלולר לא דמיינו בקלות עם טכניקות טיפול נוספות. כדי להדגים את היישומים האפשריים של טכניקה זו סקווש צנורית, פלך הרכבה היה בפיקוח spermatocytes להתקדם דרך prophase כדי מפה של שאני מעבר (מעבר G2/MI). בנוסף, שכפול centrosome, כרומוזום מין meiotic איון (MSCI) ואת היווצרות כרומוזום זר היו העריכו דוגמאות של המבנים cytological כי יכול להיות שנצפו בשיטה זו סקווש צנורית. טכניקה זו ניתן לאתר פגמים ספציפיים במהלך יצירת זרע שנגרמות על ידי מוטציה או ההפרעות אקסוגני, וכך, תורם להבנת מולקולרית יצירת זרע.

מבוא

מיוזה הוא אירוע הסלולר מורכב שבו סבב אחד של שכפול ה-DNA ואחריו שני כדורים רצופים של חלוקת התא. מספר אירועים ספציפיים מיוזה חייבת להיות מתואמת במהלך בשלבים הראשונים של מיוזה כדי להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק. אירועים אלו כוללים השלמת רקומבינציה הומולוגית, כיוון משותף של אחותי kinetochores במהלך לליגת העל meiotic, ואובדן stepwise cohesin מתחמי כדי לפתור chiasmata בין homologs. ויסות מדויק של תהליכים אלה הוא הכרחי כדי לשמור על פוריות וכדי למנוע אירועים missegregation כרומוזום זה יכול להוביל גנטי הפרעות התפתחותיות והפלה ספונטנית1.

בזמן האירועים מפתח של מיוזה מתקיימים בזכרים ונקבות, הבדלים משמעותיים הטמפורלי, מכניסטית להתקיים בין יצירת זרע ו oogenesis2. לדוגמה, במהלך המיוזה הנשי, prophase מתרחשת במהלך התפתחות ואני מעצרים בשלב dictyate עד גיל ההתבגרות. לעומת זאת, יצירת זרע מתחילה גיל ההתבגרות ומתקדמת בגלים לאורך כל חיי הבוגרים ללא מעצר. ההבדלים בין זכר ונקבה מיוזה מדגישה את הצורך לפתח שיטות ייענו במיוחד לקראת הערכת תהליכים אלה, הן spermatocytes והן oocytes. כיום, הערכת התקדמות meiotic במידה רבה מסתמך על השימוש של כרומטין כפולות3,4,5. בעוד כרומטין כפולות הם שימושיים ללימוד כרומוזומים meiotic, הם נכשלים לשמר את שלמות הסלולר, מניעת הערכה של מבנים הסלולר כגון ציר microtubules, centrosomes, מעטפת הגרעין, טלומר קבצים מצורפים. חיים הדמיה, טכניקות culturing לטווח ארוך מאוד מתקדמת ההבנה שלנו של מיוזה נקבה; עם זאת, גישות דומות כדי להמחיש את כל התא ללא פגע, בתדירות נמוכה יותר מיושמות לחקר יצירת זרע6,7. על מנת להמחיש את האירועים דינמי במהלך המיוזה זכר, אנחנו הסתגלו צנורית הוקמה טכניקות סקווש להעריך במהירות את התכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes8,9. השיטה המתוארת כאן שומר על שלמות התא, המאפשר לימוד מספר מבנים הסלולר בשלבים שונים של יצירת זרע.

טכניקה זו סקווש צנורית היא גישה כל התא, המאפשר להערכת מבנים הסלולר באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. גישות נפוצות היסטולוגית להמחיש התקדמות meiotic בעכברים זכרים כגון haematoxylin ואאוזין מכתים של פרפין מוטבע האשכים, תיוג immunofluorescent של cryosections לאפשר סקירה רחבה של התקדמות meiotic. עם זאת, שיטות אלה להיכשל לפתור תאים בודדים במידה הנדרשת עבור ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך המיוזה10,11. טכניקות חלופיות כדי לחזות תהליכים meiotic להסתמך על הפרעה chemiosmotic משמעותית spermatocyte כדי לבודד ולפתור חומרים גרעיניים3,4,5. טיפולים כימיים אלה לעכב את ההתבוננות סוגי תאים חוץ spermatocytes הראשי. שיטה תיאר לאחרונה על ידי Namekawa אפשרה את קהילת המחקר לשמר את הארכיטקטורה הגרעין של spermatocytes מבודדים, אך מחייב שימוש cytospin ואביזרים עשויים להיות לא זמינים כמה מעבדות4. לעומת זאת, הטכניקה סקווש צנורית רק דורש ציוד זה מקובל בדרך כלל במעבדות בביולוגיה ברוב של התא.

סקווש צנורית השיטה המתוארת כאן ניתן להמחיש את סוגי תאים מגוונים נמצא בתוך צנורית וכמה, כולל תאי סרטולי, spermatogonia, spermatocytes הראשיים והמשניים של spermatids. על ידי צימוד טכניקה זו עם הגל הראשון ליד סינכרוני של יצירת זרע בעכברים לנוער, זה ניתן לקבל מועשר אוכלוסיות של תאי spermatogenic כפי שהם התקדמות דרך מיוזה12. תהליך זה מאפשר ניתוח מפורט של תהליכי במהלך יצירת זרע, כגון אירועים prophase מוקדם, G2/MI מפה של מעברים "אנאפאזה", spermiogenesis. יתר על כן, ההכנות סקווש צנורית ניתן להמחיש התכונות cytological של כרומוזומים (למשל interchromatid תחומים (ICDs) ו- kinetochores), centrosomes (centrioles ו- pericentriolar חומר/מטריצות). השיטה סקווש ניתן לבצע בקלות במקביל עם גישות אחרות, כגון כפולות כרומטין והפקת חלבונים. בנוסף, טכניקה זו שונתה בהצלחה להפקיד מתאים spermatogenic חיים בשקופיות עבור פריט חזותי ישיר13.

השיטה המתוארת כאן כרוכה טכניקה סקווש צנורית וכמה התא כולו כדי לנתח את המעבר G2/MI בעכברים C57BL/6J פראי-סוג. התכונות cytological של ראשי spermatocytes הזנת לליגת העל meiotic היו דמיינו מיקרוסקופ immunofluorescence להתבונן על ציר meiotic. טכניקה זו תכליתי ניתן לשנות בקלות לדמיין אחרים בשלבים meiotic, סוגי תאים שונים. הטכניקה היא גם נוטה אסטרטגיות ויזואליזציה חלופיים, כגון גישות DNA ו RNA דגים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש של עכברים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו להשתמש הוועדה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. נערכו ניסויים לנוער (20-26 ימים לכתיבה, dpp) C57BL/6J עכברים, ניצול של הגל הראשון סינכרונית למחצה של יצירת זרע. עם זאת, טכניקה זו ניתן גם לבצע שימוש בעכברים בוגרים.

1. ניתוח ובידוד של העכבר וכמה בקוריאנית

  1. להכין תקן/פירוק פתרון ונוגדן דילול המאגר (ADB) שמתואר בטבלה 1 ו- 2 בטבלה.
  2. להכין צלחת פטרי אחת של 35 מ מ עם 3 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (1 x PBS, pH 7.4), תבשיל אחר 35 מ מ עם 2 מ של תיקון/פירוק פתרון לכל העכבר.
  3. להקריב את העכבר דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO, לרסס את הבטן הגחון עם 70% אתנול. פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור בצורת V. ואז להסיר את האשכים על ידי משיכת על כרית השומן epididymal באמצעות מלקחיים, ולהימנע מטריד את tunica albuginea. מקם את האשכים בצלוחית 35 מ מ המכיל 1 x PBS.
    הערה: לנצל את הגל הראשון של יצירת זרע על מנת לצפות אוכלוסיה תא מועשר של עניין14. בשלבים מסוימים של יצירת זרע מועשרים בגילאים שונים בעכבר (טבלה 3).
  4. הסר את האשכים tunica albuginea על-ידי ניקב את הרקמה עם מלקחיים משופעת חדה ולאסוף את בקוריאנית וכמה רופף. להעביר את בקוריאנית המכיל 2 מ"ל של פתרון תיקון/פירוק פטרי 35 מ מ חדש.
  5. דגירה של בקוריאנית בפתרון fix/פירוק למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

2. הכנת וכמה בקוריאנית

  1. הכן שקופית פולי-L-ליזין מצופה זכוכית על ידי חלוקה לרמות את הקצוות של השקופית עם עט חוסם נוזלי.
  2. החל µL 100 של פתרון תיקון/פירוק למרכז השקופית זכוכית.
  3. בעזרת מלקחיים סטרילי, מספריים להקניט בעדינות לגזרים את בקוריאנית וכמה. חיתוך צנורית זמן בודדים מגזרים כ 20 מ מ אורך.
    הערה: לדמיין מבנים רגישים חשיפה ממושכת מקבע, כגון centrosomes, להפריד את בקוריאנית לראשונה ב-, טוב, מגניב 1 x, ואז ישירות מינצ בקוריאנית על פני השטח של השקופיות פולי-ליזין מצופה µL 100 בפתרון fix-פירוק.
  4. להעביר חמישה קטעים צנורית וכמה זמן 20 מ מ השקופית מוכן פולי-L-ליזין מצופה זכוכית המכיל תיקון/פירוק פתרון.
  5. באמצעות מספריים סטרילי האוהב בקוריאנית וכמה למקטעים 1.5 ל 3.0 מ מ.
  6. בעזרת מלקחיים סטרילי לסדר את מקטעי צנורית בשקופית זכוכית כך אין רקמות חופף, ולא בקוריאנית מפוזרים באופן אחיד.
    הערה: מספר אופטימלי מקטעי צנורית על משטח זכוכית הוא בין 20 ל- 40.

3. מועך של בקוריאנית וכמה

  1. להעביר את השקופית זכוכית המכיל מקטעים צנורית וכמה מפוזרת על גבי benchtop. להסיר את עודף נוזל באמצעות מגבון מעבדה כדי להימנע מאובדן רקמת במהלך השלב סקווש.
  2. להחיל על coverslip (22 x 60-1.5 מ"מ) על גבי השקופית זכוכית והפעילו לחץ על העקב של כף היד למשך 10-20 שניות. חשוב להפעיל מספיק כוח כדי לפזר את spermatocytes מן בקוריאנית וכמה.
    הערה: לבחון את בקוריאנית באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה על מנת לייעל את הצעד squashing כך כל מקטעי צנורית הם שיבשו.
  3. בעזרת מלקחיים שקופיות, מיד פלאש להקפיא השקופית זכוכית דיואר קטנה של נוזל N2 למשך 15 שניות, או עד שהנוזל חודל בועה. אם immunolabeling להסיר לאלתר, את coverslip עם סכין גילוח שוליים ישרים, בסדר עצה מלקחיים או מחט בקוטר 21.
    הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, immunolabel השקופיות באופן מיידי (ראה שלב 4). עם זאת, בשלב זה שקופיות יכולים להישמר ב-80 מעלות צלזיוס עד שבועיים. כדי להגדיל את אורך החיים של חלבונים ו מבנים הסלולר, מיד מאחסנות את השקופיות קרח יבש או העברת מקפיא-80 ° C, ולשמור את coverslip בשקופית. כאשר immunolabeling לאחסן שקופיות, להסיר את coverslip במועט השקופיות N נוזלי2 למשך 15 שניות, כפי שמתואר בשלב 3.3.

4. Immunolabeling של בקוריאנית וכמה הנטען

  1. לטבול את השקופית 1 x PBS ולאחר שטיפת שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50-mL המכיל 1 x PBS.
    הערה: לעולם לא. תרשה שהשקופיות יבש לחלוטין במהלך immunolabeling.
  2. החל מ ל 1 נוגדן מאגר דילול אותן לשקופית זכוכית לחסום במשך 1-2 h בתוך תא humidified.
  3. להסיר את המאגר דילול נוגדן ולהחיל µL 100 של נוגדן ראשוני מדולל במאגר דילול נוגדן בתוך תא humidified.
    הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, דגירה נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 º C. השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים. לאמת ולמטב נוגדנים ראשי15.
  4. לשטוף שקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל המכיל 1 x PBS.
    הערה: כדי לשפר את מנקי, להתסיס צנצנות Coplin באמצעות בר קטן מערבבים מגנטי, מניחים על צלחת מגנטית מערבבים במהירות נמוכה, או למקם את הצנצנת Coplin על שולחן מערבל במהירות נמוכה.
  5. החל µL 100 של נוגדנים משניים מדולל במאגר דילול נוגדנים עבור h 1 1.5 בתוך תא humidified בטמפרטורת החדר. דגירה השקופיות בקופסה כהה כדי למנוע צילום הלבנה של נוגדנים fluorophore מצומדת.
    הערה: השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים.
  6. שטיפה שקופיות פעמיים במשך 5 דקות בתוך צנצנת Coplin 50-mL המכיל 1 x PBS.
  7. הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, µg 1.5/mL) ולהחיל coverslips (22 x 60-1.5 מ"מ).
  8. חותם על coverslips על השקופיות עם לק ברורה כדי לשמר את השקופיות ולמנוע את coverslips לנוע.

5. ניתוח וההכנות הדמיה צנורית סקווש

  1. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence עם שלב אוטומטי המאפשר תנועה ציר z מדויק של מצלמה ברזולוציה גבוהה עבור לכידת תמונה. לחלופין, השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר.
    הערה: להשתמש בכל תוכנה וחומרה זמין בשלב זה. לדוגמה, התמונות המוצגות באיור 1 ו- 2 איור נלכדו באמצעות Zeiss תא הצופה Z1 מקושר מצלמת CMOS 4.0 אורקה-פלאש וניתח עם התוכנה תמונות מהדורה 2012 זן Zeiss כחול.
  2. להעריך את השקופיות בעזרת מטרה X 20 כדי לקבוע את איכות התכשיר סקווש. שקופיות באיכות טובה יש של טפט של גרעינים המופצים באופן שווה.
    הערה: כמה קטעים של השקופית יכול להיות יותר טוב מאחרים, זה שימושי כדי לציין את הקואורדינטות של שם ניתן למצוא את האזורים הטובים ביותר של השקופית לצורך ניתוח נוסף באמצעות הגדלה גבוהה יותר.
  3. שימוש גבוה יותר אובייקטיבי ההגדלה (למשל 63 X או 100 X), לכידת אזורים של השקופית שיש של טפט עקבית של גרעין האטום. ברגע אזור נבחר, קבע העליון ולהוריד Z-במחסן כדי להבטיח כי כל האור בפוקוס נלכד.
    הערה: המספר האופטימלי של Z-במחסן נתפס בין הגבול העליון והתחתון מיועד בדרך כלל על ידי תוכנת רכישת התמונה, והוא שונה עבור כל מטרה.
  4. להשתמש בתמונה בתוכנת עיבוד כדי לקמפל תמונה המוקד עומק מורחב. התוכנה משלבת האור בפוקוס כל Z-מחסנית, חיוני עבור הדמיה אופטימלית של צנורית סקווש ההכנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן השתמשנו בשיטת סקווש צנורית להמחיש תא חלוף אוכלוסיות שעברו את prophase כדי מפה של אני (G2/MI) המעבר, אשר היו מועשר בבציר האשכים של עכברים פראי-סוג לנוער העוברים את הגל הראשון של יצירת זרע (24 dpp). איור 1 מציג תמונות נציג של השלבים השונים תא זה ניתן לאבחן באמצעות השיטה סקווש צנורית. מועשר אוכלוסיות של מפה של אני spermatocytes היו visualized באמצעות נוגדנים נגד אלפא-טובולין (איור 1 א'). אנחנו מנוצל סמנים עבור מיוזה מוקדם ומאוחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עכברים הוכיחו להיות אורגניזם מודל שימושי ללמוד את האירועים הסלולר המפקחים על התקדמות meiotic במהלך יצירת זרע. עוד יותר, הוא צורך לפתח כלים ששירתה המחקר של יצירת זרע כי אירועים רבים, כגון יציאה מן meiotic prophase אני, הם dimorphic מינית. פרוטוקול זה מתאר שיטה סקווש צנורית וכמה עבור ויזואליזציה ולימוד בשלבים שונים של יצירת זרע העכבר. שיטה זו משמרת שלמות הסלולר של ובכך מאפשר ניתוח מפורט של מבנים cytoplasmic גרעינית. התוצאות נציג המתוארים במחקר זה להפגין את התועלת של פרוטוקול זה בהערכת spermatocytes העיקרי בתהליך התקדמות me...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J. על ידי מלגת גראנט ההדרכה מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) S.R.W., ג'יי-אייץ
 

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% Paraformaldehyde AmilitaryElectron Microscopy Sciences (EMS)15710
10x PBSאיכות ביולוגית119-069-161
Triton X-100SigmaT8787
BSASigmaA1470
סרום סוסSigmaH-1270
צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ, סטרילי, לא מטופלCellTreatP886-229638
שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזיןSigmaP0425-72EA
עט חוסם נוזליםמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)71310
קופסה לחהירוק עד240-9020-Z10
צלחת מכתים מזכוכית Wheaton Coplin ל -5 או 10 שקופיותפישר08-813E
VECTASHIELD Antifade הרכבה בינוני עם DAPIVector LabsH-1200
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ (22 מ"מx60 מ"מ)פישר12-544-G
לק שקוףאמזוןN/A
<חזק>מיקרוסופים
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי תגובות
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000 
Observer Z1Zeiss4109431007994000
Zeiss ZEN 2012 מהדורה כחולה תוכנת תמונהZeiss
ORCA-Flash 4.0 CMOS מצלמהHamamatsu
Primary Antibodies
NameCompanyמספר קטלוגי<חזק>הערות
עכבר נגד SYCP3סנטה קרוזsc-745691 ב 50
ארנב נגד SYCP3פישר (נובוס)NB300-2311 ב 1000
עז נגד SCP3סנטה קרוזsc-208451 ב 50
נוגדנים לחלבון אנטי צנטרומר אנושימשולבים15-2351 ב 100
עכבר אנטי אלפא טובוליןSigmaT90261 ב 1000
עכבר anti-AIM1BD Biosciences6110821 ב 200
עכבר אנטי &גמא; H2AXThermo FisherMA1-20221 ב-500
עכבר אנטי-CENT3AbnovaH00001070-M011 ב-200
ארנב אנטי-פריסנטריןAbcamab44481 ב-200
ארנב אנטי-REC8באדיבות  ד"ר קארן שינדלרN/A1 ב-1000

מקורות

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  2. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  3. Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
  4. Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819(2014).
  5. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
  6. Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
  7. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
  8. Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
  9. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  10. Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
  11. Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
  12. Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
  13. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
  14. Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
  17. Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
  18. Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
  19. Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
  20. Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
  21. Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
  22. Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
  23. Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
  24. Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676(2016).
  25. Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
  26. Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
  27. Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858(2013).
  28. Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
  29. Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
  30. Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
  31. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  32. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  33. Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
  34. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40(2013).
  35. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
  36. Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
  37. Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
  38. Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
  39. Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
  40. Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ספרמטוגנזה בעכבריםבידוד תאי נבטהכנת שכוךתמיסת ליזיס למקבעשקופית Poly-L-Lysineצביעה אימונופלואורסצנטיתמיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטיתהיווצרות שיירת כרומוזומים (Chromosome Bouquet)
טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.