Method Article

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

DOI:

10.3791/56470

⸱

November 8th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק צעדים ניסיוני ומידע אודות ריאגנטים, ציוד וכלים לניתוח לחוקרים המעוניינים בביצוע ניתוח הגנום כולו מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה (CGH) של עותק מספר וריאציות צמחים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטציות הן כרב משאבים גנטי ללימודי תפקוד הגן. כדי ליצור אוספים מוטציה, שלושה סוגי מוטגנים יכול להיות מנוצל, כולל ביולוגית כגון T-DNA או transposon, כימיקלים כגון אתיל methanesulfonate (EMS), או גופני כגון קרינה יינון. הסוג של מוטציה נצפתה משתנה בהתאם מוטגן בשימוש. למוטנטים הקרינה הנוצרות על ידי יינון, מוטציות כוללות מחיקה, שכפול או סידורם מחדש. בזמן T-DNA או מבוססי transposon מוטגנזה מכוונת מוגבלת מינים רגישים טרנספורמציה, ניתן ליישם מוטגנזה מכוונת כימיים או פיזיים מגוון רחב של מינים. עם זאת, אפיון מוטציות נגזר כימיים או פיזיים מוטגנזה מכוונת באופן מסורתי מסתמך על מבוסס מפה שיבוט בגישה, אשר עבודה אינטנסיבית וצורכת זמן. . הנה, אנחנו מראים כי פלטפורמה מבוססת על מערך השוואתי גנומית הכלאה (aCGH) הגנום בצפיפות גבוהה ניתן ליישם ביעילות לזהות ולאפיין עותק מספר וריאציות (CNVs) של מוטציות נגזר מוטגנזה מכוונת הפגזה (FNB) נייטרון מהיר ב אספסת truncatula, זן קטניות. ניתוח רצף הגנום כולו מראה כי ישנם יותר מ- 50,000 גנים או דגמים ג'ין truncatula מ'. בבית הנוכחי, הנוצרות על-ידי FNB מוטציות במ truncatula נגזרים מתוך יותר מ-150,000 שורות M1, המייצג משאבים גנטי לא בפז עבור מחקרים פונקציונלי של גנים בגנום. פלטפורמת aCGH המתוארים כאן הוא כלי יעיל עבור אפיון FNB-induced מוטציות ב- truncatula מ'.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטניות (קטניות) הם משפחת השלישית בגודלה של צמחים בעלי פרחים, עם מינים רבים כלכלית כגון סויה (מקס גליצין), אספסת (סאטיבה אספסת). קטניות צמחים יכולים לקיים אינטראקציה עם חנקן-תיקון בחיידקים בקרקעות, בדרך כלל בשם Rhizobia לפתח פקעיות בו dinitrogen עם אווירה תקטן אמוניה לשימוש על ידי המפעל המארח. ככזה, טיפוח של גידולי קטניות דורש קלט הקטן של דשנים חנקן, ובכך תורמת חקלאות בת-קיימא. גידולי קטניות לייצר עלים וזרעים עם תוכן חלבון גבוהה, הגשה מצויינת מספוא וגרעינים. עם זאת, מינים קטניות מעובדים בדרך כלל יש מבנים מורכבים הגנום, ביצוע מחקרים פונקציונלי של גנים לשחק בתפקידי מפתח בתהליכים ספציפיים קטניות, מסורבלת. אספסת truncatula אומצה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 1 מציג את השלבים חמש עבור המערך CGH פרוטוקול. הם: 1) הכנה של חומרים הצמח; 2) בידוד של דגימות די אן איי באיכות גבוהה; Labeling 3) ולטיהור דגימות די אן איי; 4) הכלאה, שטיפה, וסריקה של מערכים הגנום כולו; ו- 5) ניתוח נתונים CGH. מערכים ריצוף הגנום כולו מ truncatula מכילים סך של הגששים oligo ייחודי 971,041 פילוח יותר מ 50,000 גנים או מודלים הגן הגנום (ראו טבלה של חומרים). הגששים ייחודי ירווחו כ כל 150 בסיסי זוגות (bp) אזורים exonic, 261 bp באזורים intronic של הגנום truncatula מ.

1. הכנה של חומרים צמח

  1. Scarify פראי סוג (WT; מ truncatula קורות חיים Jem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מציג את ההתפלגות של יומן מנורמל2 יחסי של מוטציה לעומת WT אותות ברחבי הגנום כולו. ניתוח של נתונים CGH גילה משוער 22 kb מחיקה על כרומוזום 4 שמקיף את הגן כולו טרופ 33 ועוד כמה מבואר גנים מוטציה FN6191 (איור 2, איור 3). האזור שנמחקו המועמד היה מכוסה 73 הגששים עוקבים במערך עם יומן מנורמל אכזרי2 יחס פחות מ- 2.5 (משלימה טבלה 1). .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פלטפורמה CGH מבוסס על מערך זיהוי, אפיון נייטרון מהיר הפגזה (FNB)-induced מוטציות ב truncatula מ cv. Jemalong A17. כדי להדגים את השימוש במערך CGH שיטת באיתור מוטציות, ביצענו ניתוח aCGH של המוטציה FN6191, אשר הציג הפנוטיפ היפר-nodulation בניגוד פראי סוג צמחים, כאשר מחוסן עם meliloti ס Sm1021. לניתוח פילוח, קטע הייתה השפעה משמעותית אם היחס2 יומן של הגששים בתוך המקטע היה מעל הסף העליון או מתחת לסף התחתון להשוואה את מערך נתון. הסף העליון עבור כל השוואה היה נחוש בדעתו להיות הערך יחס2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון של עבודה זו מסופק בחלקו על ידי מענק של מחקר הגנום של הצמח NSF (IOS-1127155).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula מערך גנום, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (מוטציה)בביתFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (התייחסות)בביתA17
חומצה גופרתיתסיגמא-אולדריץ'320501
DNeasy Plant מיני קיטQiagen69104
Nanodrop ספקטרופוטומטרThermo Scientific1000D
SureTag ערכת תיוג DNAAgilent5190-3400
פריימר אקראיAgilent5190-3399
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'271004-1L
ThermocyclerMJ מחקרPTC-200
צנטריפוגהLabnet international IncSpectrafuge 24D
פתרון ייצוב וייבושAgilent5185-5979
ערכת הכלאה של Oligo aCGH/ChIP-on-chipAgilent5188-5380
שקופיות אטם תא היברידיזציהAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip מאגר כביסה 1 ו-2Agilent5188-5221
תא הכלאה, נירוסטהAgilentG2534A
תנור היברידיזציהAgilentG2545A
עמודי טיהורAgilent5190-3391
סורק לייזרRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche מפת5225035001
1.9מפת איתותרוש נימבלגן1.9
איתות נימבלגן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312(2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Comparative Genomic HybridizationCopy Number VariationsFast Neutron BombardmentMedicago truncatulaArray based CGHDNA IsolationMicroarray HybridizationWashing BufferSpectrophotometer AnalysisSignal Mapping Software

Related Articles