מאמר שיטה

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

DOI:

10.3791/56484

⸱

27 בספטמבר 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר אימהית קשורה לסיכון מוגבר של תוצאות שליליות הלידה זה סביר בתיווך פרוץ פונקציה היפרדות ניתן לייחס, בין השאר, dysregulation של autophagy. חריגה שינויים בביטוי של הרגולטורים autophagy ב מאחד לשני של הריונות מהשמנת יתר עשוי להיות מפוקח על ידי תהליכים דלקתיים המשויכים השמנת יתר והריון. המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמת villous חלקית ובידוד של cytotrophoblasts villous חלקית של השליה האנושית המונח לתרבות התא הראשי. זה מלווה שיטה כדי לדמות את חצרו דלקתיות ב התוך-רחמית מהשמנת יתר על ידי טיפול trophoblasts העיקרי של הריונות רזה עם הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα), ציטוקינים proinflammatory כי הוא גבוה ב השמנת יתר הריון. תוך יישום הפרוטוקול המתואר כאן, הוא נמצא כי החשיפה ל אקסוגניים TNFα מווסת את הביטוי של רוביקון, מווסת שלילי של autophagy, ב- trophoblasts של הריונות רזה עם העוברים הנשי. בעוד מגוון רחב של גורמים ביולוגיים התוך-רחמית שמנים לשמור על פוטנציאל לווסת נתיבים קריטיים ב- trophoblasts, מערכת זו שמחוץ היא שימושית במיוחד עבור קביעת אם הביטוי תבניות שנצפה ויוו אנושי מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית הם תוצאה ישירה של TNFα איתות. בסופו של דבר, גישה זו מעניקה הזדמנות לנתח את ההשלכות רגולטוריות ומולקולרית של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על autophagy מסלולים אחרים קריטי הסלולר ב trophoblasts שיש להם פוטנציאל לפגיעה פונקציית היפרדות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר היא מדינה דלקתית המאופיינת בדרגה נמוכה דלקת כרונית, הנובעות רקמת שומן עודף וזמינות חומר מזין. ההשמנה, ציטוקינים proinflammatory גבוהות ברקמות מטבולית וכן מערכתית במחזור. גוף חזקים של הראיות הוכיחו כי TNFα הוא משמעותי גבוה בסביבה של השמנת יתר עם השלכות תנגודת לאינסולין ואת תפקוד מטבולי1. הפעלה של TNFα תורם גם מחלת פתוגנזה בתנאים כגון סרטן, מחלת חיסון עצמי, הפיכתה ליעד אטרקטיבי טיפולית של2.

דלקת ההשמנה מורכב ההריון, גם proinflammatory המדינה3,4. בעבר הוכח כי תוכן TNFα היפרדות מגביר עם השמנה אימהי של הריונות עם העוברים הנשי. יתר על כן, הטיפול TNFα מעכב נשימה מיטוכונדריאלי בתאים trophoblast נקבה אך לא זכר, רומז כי TNFα מעורב בוויסות חילוף החומרים היפרדות בצורה מינית dimorphic5. השמנת יתר אימהית קשורה עם שכיחות מוגברת של מגוון רחב של סיבוכים במהלך ההריון, כולל לידות, בעוברים זכרים להיות רגישים ביותר3,6,7,8 . בשל תפקידה מפתח-הממשק אמהי-עוברית, שינויים ביכולת תפקודית של השליה ב התוך-רחמית שמנים בתגובה איתות דלקתיות עשוי לשחק תפקיד חשוב תיווכה התוצאות של הריונות מהשמנת יתר.

Cytotrophoblasts syncytiotrophoblasts בתוך הרקמה villous חלקית של השליה הם קריטיים עבור איתות האנדוקרינית ו- exchange חומרי מזון וחמצן בין האם לעובר המתפתח9. שיבושים ביכולת תפקודית של cytotrophoblasts villous חלקית (ןלהל trophoblasts) עלול לסכן את בריאות העובר והתפתחות. פרוטוקול זה מתאר שיטת דגימה של רקמת villous חלקית של השליה האנושית המונח על ידי לנתח משם את הצלחות שליה, הבסיס יחד עם שגרת ממוטב עבור בידודו של trophoblasts לתרבות התא הראשי. פרוטוקול זה נגזר מתודולוגיות הוקמה מעורבים עיכול אנזימטי של רקמות villous חלקית כדי לשחרר תאים מטריצה חוץ-תאית ואחריו צפיפות דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי לבודד trophoblasts10, 11,12. פרוטוקול זה פרטים גישה שבה trophoblasts העיקרי של מאחד לשני של הריונות רזה מטופלים עם תרבות המדיה בתוספת TNFα כדי לדמות מרכיב אחד של הסביבה שבה התרחשה דלקתיות הקשורות בהשמנת יתר אימהית. לבסוף, מתואר הליך פשוט לשימוש בתא סכום lysates מן trophoblasts שטופלו TNFα ואחריו המערבי סופג כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים.

בעוד מודל זה לא מסכם את הדברים obesogenic בתוך הרחם הסביבה בשלמותו, הוא מספק מערכת מבוקרת המאפשר אחד כדי לנתח את תרומתו של הפרט של דלקת בתיווך TNFα בתגובה של trophoblasts השמנת יתר אימהית. מודל זה מעניק את ההזדמנות לגלות או לאשר את מטרות מולקולריות ישירות מוסדר על ידי TNFα איתות ב trophoblasts, כמו גם מאפשר לבדוק אם שינויים בדפוסי ביטוי גנים נצפתה ויוו ב מאחד לשני עם אימהית השמנת יתר עשוי להיות תוצאה של דלקת בתיווך TNFα.

הגישה המתוארת כאן בוצע כדי לבחון את ההשפעה של דלקת בתיווך TNFα על ויסות autophagy ב trophoblasts האנושית. Trophoblasts של הריונות שמנים עם נספח בעוברים זכרים משובשות מחזור autophagic, או autophagosome ההבשלה13. חלבון הנקרא רוביקון (בניהול תחום חלבון אינטראקציה-Beclin1 וציסטאין-עשיר המכיל), אשר הוא מקומי אל lysosomes ואל endosomes המאוחרות, לאחרונה מתוארת כ "בלימה" בתהליך מחזור autophagic כי הוא פועל כמו שלילי הרגולטור של autophagosome-התבגרות-14,-15. למעשה, רוביקון הוא דוגמה נדירה של חלבון זה מרסן autophagy, מה שהופך אותה מטרה טיפולית יקרי ערך. מעט מאוד מידע זמין למשמעות pathophysiological רוביקון, למעט תפקידים שלה בתגובה חיסונית מולדת microbials16,17 ו cardiomyocyte הגנה18. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן הוא נמצא כי רוביקון היא upregulated ב trophoblasts הראשי הנשי בתגובה לטיפול עם הגדלת ריכוזי TNFα עד 250 pg/mL. ברגולציה של רוביקון עשוי לשחק תפקיד איך נשים שהעוברים הנסיעה יותר גברים הריונות עם השמנת יתר אימהית. Recapitulating דלקת הקשורים עם השמנת יתר אימהית ex-vivo על ידי חשיפת האדם trophoblasts ל אקסוגניים TNFα מספק פלטפורמה לחקור את ההשפעה של התוך-רחמית מהשמנת יתר על התקנון של נתיבים קריטיים ב trophoblasts על ידי הרחבת, הפונקציה היפרדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

placentae נאספו מן העבודה היחידה המסירה בבית החולים האוניברסיטאי תחת פרוטוקול אושרה על ידי המוסדיים סקירה של אורגון הבריאות אוניברסיטת המדע בפורטלנד, אורגון, עם הסכמה מדעת של חולים.

1. אוסף של רקמות היפרדות

  1. הכנת
    הערה: כל הציוד נתקל רקמות חייבת להיות סטרילי.
    1. לחטא את הציוד ויבתר מאת autoclaving עבור 60 דקות בשעה 121 מעלות צלזיוס
    2. להשתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי): מעבדה מעילים/שמלות/scrubs, כפפות, מסיכה עם מגן הפנים או משקפי.
    3. הפעל את המים הרותחים, מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס.
    4. חם 50 מ ל שני חרוט, צינורות-כל 25 מיליליטר מדיה מלאה המכילה (Iscove ' s שונה Dulbecco ' s בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, טבלה 3) בתוך אמבט מים 37 ° C.
    5. בהסכמת החולה מושכלת, להשיג את השליה מיד אחרי הלידה בניתוח קיסרי.
    6. להכיר השליה. חבל הטבור מוכנס בצד העוברי (צלחת שליה), כלי הדם ניתן לראות מקרין החוצה מן האתר ההכנסה הטבור. הנגדי הוא הצד האימהי, או צלחת הבסיס. היא כוללת את רותמי והמבנים המכילים כלי עצים, שנקרא פסיגי הזרע.
  2. דגימה של רקמת villous חלקית
    הערה: רקמת villous חלקית צריך ניתן לטעום מן השליה בהקדם האפשרי לאחר הלידה, רצוי תוך 30 דקות או פחות.
    1. עם לוחית שליה כלפי מעלה, בלו מקטעים מלא-עובי 2-3 (כ 2.5 ס מ x 2.5 ס מ בגודל) 2-3 ס מ מן הפריפריה של השליה-אקראי, באמצעות מלקחיים ומספריים ( איור 1 א').
      הערה: להימנע חלקים של השליה המופיעים נורמלי (קרי לבן calcifications).
    2. לקיטום הלוחות שליה ו הבזליים וכלי הדם גדולה לכל.
    3. מקום הרקמה villous חלקית וכתוצאה מכך ( איור 1B, סה כ- 80-120 g) בתקשורת מלאה חמה ולהתחיל trophoblast בידוד בתוך 30 דקות של דגימה.
      הערה: כמה מבחני במורד הזרם, יישומים מושפעים אורך תקופת השהיה בין משלוח הדגימה, בידוד trophoblast. מומלץ לשמור על אלה תקופות כמו קצר ככל האפשר ועקבית בין ומשום.
    4. תוך שימוש בטכניקות המתוארות בצעדים 1.2.1 - 1.2.2, מדגם אקראי 1 ס"מ על 1 ס"מ 5, מקטעי רקמת villous חלקית מעבר השליה (כולל המרכז).
    5. לחתוך כל דגימה רקמה villous חלקית 1 ס"מ על 1 ס"מ לחתיכות קטנות יותר 4-5 (כ 30 מ ג כל אחד), הכנס 2 מ ל microcentrifuge צינורות, פלאש להקפיא נוזלי N 2. חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש בהמשך מנתח.

2. בידוד של Trophoblasts מרקמות villous חלקית

  1. הכנת
    הערה: לבצע הליכים מעורבים בתאי תא למינארי ולהשתמש הציוד סטרילי.
    1. הפשרה צפיפות קפוא ארבעה מעברי צבע (טבלה 1, ראה טבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) ב 4 ° C בלילה לפני השליה מגיע.
      הערה: לחלופין, צפיפות מעברי צבע יכול להתבצע ביום של הבידוד.
    2. התור צנטריפוגה, מוגדר כ- 20 מעלות צלזיוס
      הערה: כל השלבים צנטריפוגה נמצאים מרבית האצה והאטה אלא אם צוין אחרת.
    3. הכן 1 x באגירה HEPES תמיסת מלח (HBSS) בתוספת Ca +2 ו- Mg +2 (טבלה 3).
    4. טריפסין חמים ל- 37 מעלות צלזיוס.
    5. לדלל DNase כ 2720 kilounits/מ בסטרילית בתוספת HBSS.
    6. חם 50 מ של העגל היילוד לנסיוב (רכיבי NC) 37 מעלות צלזיוס.
    7. חם מדיה מלאה 37 מעלות צלזיוס.
    8. חם מדיה קפוא (90% FBS, דימתיל סולפוקסיד 10%, טבלה 3) כדי 37 מעלות צלזיוס.
      התראה: דימתיל סולפוקסיד רעיל ולא חייבים להיות מטופלים עם כפפות.
      9. מאגר
    9. הכן עיכול (טבלה 2 ו- 3) על ידי ערבוב 308 מ ל בתוספת HBSS, 50 מ של טריפסין (3751.7 BAEE יחידות/mL), ו- 0.5 מ ל DNase (379.4 kilounits/mL) בבקבוק סטרילי.
      הערה: הזמן המשוער הנדרש כדי לבודד תאים מרקמות villous חלקית הוא ה 7
  2. עיבוד הרקמה villous חלקית
    1. שטיפה כל פיסת רקמה villous חלקית צינור חרוטי 50 מ ל מלא עם פוספט בטמפרטורת החדר buffered תמיסת מלח (PBS). לחזור על ולהחליף את PBS לפי הצורך עד להסרת עודפי הדם (PBS שטיפה יהיה אור אדום או ורוד כאשר הרקמה ביסודיות שוטפים).
    2. למקם את הרקמה villous חלקית בצלחת פטרי סטריליות, להסיר כלי דם רבים ככל האפשר על ידי גירוד בעדינות הנחה את הרקמות villous חלקית מכלי הדם באמצעות מיקרוסקופ שקופית.
    3. דק מינצ הרקמה villous חלקית הנוצרת באמצעות מספריים.
  3. לעיכול רקמות villous חלקית, בידוד גולמי של Trophoblasts
    1. להעביר את הרקמה villous חלקית טחון לבקבוק סטרילי עם מערכת העיכול פתרון על-פי אמצעי האחסון מחושב על בסיס הפעילות הספציפי של טריפסין ו DNase (165 mL, בטבלה 2).
    2. לאחר 35 דקות של דגירה באמבט מים 37 ° C ברעידות-70 סיבובים לדקה (סל ד), להטות את הבקבוק עיכול על צידה ולאפשר את פיסות רקמה להתיישב בתחתית הבקבוק מעוכל. להכין היטב את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, הימנעות הרקמה שיוחסו.
    3. לוותר על תגובת שיקוע דרך מסננת תא 100 מיקרומטר באופן שווה בין צינורות חרוט 50 מ ל.
      הערה: כדי לחסוך זמן, מומלץ להתחיל השני לעיכול על ידי הוספת פתרון מערכת העיכול (מל ' 110, בטבלה 2) הנותרים התיישבו רקמות, חידוש הדגירה כפי שמתואר בשלב 2.3.2.
    4. בעדינות שכבה 3-5 מ של רכיבי NC מתחת תגובת שיקוע מאומצות מאת לאט מחלק מן פיפטה סרולוגית בתחתית הצינורית. מניסקוס בין רכיבי NC מאומצות תגובת שיקוע (trophoblasts מכיל) צריך להיות גלוי ( איור 2 א).
    5. Centrifuge את supernatants מעל רכיבי NC ב g x 1,250 למשך 15 דקות ב 20 º C. בגדר שייווצר יכלול כדוריות דם אדומות בשכבה התחתונה ביותר ואחריו שכבה לבנה הכוללת תאי trophoblast ( איור 2B).
    6. חזור על שלבים 2.3.2 - 2.3.5 עבור כל אחד השני והשלישי digestions (הוספת 110 מ ל ו- 83.5 מ', בהתאמה, של מערכת העיכול פתרון של הבקבוק של רקמות, בטבלה 2).
    7. ברגע יש כבר centrifuged כל supernatants, resuspend כל גלולה ב 5 מ של מדיה מלאה חמה ולאחר מכן בריכה יחד את המתלים.
    8. לפצל התליה תא באופן שווה בין שני צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 1,250 x g למשך 15 דקות ב- 20 ° C.
    9. בעדינות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend אחד של כדורי תא ב 6 מ של חם להשאז תוציא את המדיה-
  4. צפיפות צנטריפוגה
    1. לחלק התליה תא באופן שווה בין ארבע צפיפות מעברי צבע (3 מ ל כל אחד) על ידי לאט ובזהירות שכבות התליה תא בראש צפיפות מעברי הצבע עם pipet העברה.
    2. Centrifuge מעברי הצבע צפיפות-1,250 g x עבור 20 דקות ב- 20 ° C עם מינימום האצה והאטה. זה צריך לייצר להקות ניתן להבחנה של תאים sedimented (טבלה 4).
    3. לאט ובזהירות להסיר את השכבות העליון של צפיפות הדרגתיות מדיה (DGM) עד שירטס אטום המכיל תאים trophoblast (בין 35-50% DGM) (טבלה 4).
    4. להעביר הלהקות trophoblast 50 מ ל שני צינורות חרוט ולמלא מדיה מלאה חמה.
    5. בעדינות היפוך צינורות 3 - 6 פעמים כדי לערבב צנטריפוגה ב g x 1,250 למשך 15 דקות ב- 20 ° C.
    6. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה תא ב 5 מ של מדיה מלאה חמה. לשלב את המתלים תא ולספור התאים קיימא באמצעות hemocytometer Trypan blue (או מועדף תא ספירת בשיטה).
  5. ספירת תאים עם Hemocytometer
    1. לערבב התליה תא pipetting למעלה ולמטה עם pipet סרולוגית או על ידי היפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים.
    2. לשלב חלקים שווים של הבולם תא, Trypan blue (כלומר 20 µL כל) בצינור נפרד ומערבבים בעדינות.
    3. Incubate 1-2 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. בעדינות לוותר על 15-20 µL של התא-Trypan כחול תערובת של coverslip ועד hemocytometer את ולאפשר לתאים מפוזר ברחבי הרשת על-ידי נימיות.
    5. נחשב התאים קיימא (תאים מתים להיות מוכתם כחול עמוק) בכל אחד הרביעים 4 4 x 4 עם מונה צמיגים בוערים. מעסיקים מערכת ספירת כדי להבטיח התאים אינם נספרים יותר מפעם אחת (כלומר לא לספור תאים לגעת למטה או שמאלה גבולות).
      הערה: כל רביע 4 x 4 צריך להכיל בין 50-150 תאים. מעט מדי או יותר מדי תאים יכול להוביל נגמר או underestimation של מספר הטלפון הנייד של.
    6. ממוצע בתא סכום שנחשב מכל אחד הרביעים 4 x 4, להכפיל ב 10 4, ואז תכפיל על ידי הגורם דילול (השעיה תא כדי Trypan blue) לחישוב מספר תאים לכל mL-
    7. להכפיל את מספר התאים לכל mL הנפח הכולל של השעיה תא כדי לחשב את התשואה הכוללת תא.
      הערה: כ-100 מיליון תאים צפויים מ ומשום החל מ 80-120 גרם של רקמת villous חלקית.
  6. תאי ציפוי
    1. צלחת 3 מיליון תאים/טוב (3.3 x 10 5 תאים לכל ס מ 2) לתוך צלחת 6-טוב (2 מ"ל של השעיה לכל טוב), בעדינות רוק אחורה וקדימה, צד לצד לפיזור אחיד של התאים.
      הערה: Trophoblasts לדרוש תרביות רקמה מטופלים צלחות לדבוק כראוי. טפט של תאים נדרשת כדי לקדם את syncytialization.
    2. להשאיר מצופים בתאים למינארי כ 30 דקות לאפשר לתאים באופן שווה להפיץ, להתפשר, ולהתחיל לדבוק בתחתית הבארות לפני הצבת בחממה.
    3. התרבות תאים עבור עד 72 שעות (עם המדיה משתנה מדי יום) בחממה 37 ° C עם 5% CO 2 ו- 95% לחות.
      הערה: לבחון את trophoblasts תחת מיקרוסקופ ב 10-20 x בכל 24 שעות של תרבות. Trophoblasts לא להתרבות, לא יכול להיות passaged. במהלך 72 h של התרבות, trophoblasts בודדים עגול הפתיל כדי ליצור את syncytium ( איור 3 א ו- B).
  7. הקפאת תאים
    1. גלולה תאים שאינם בשימוש על ידי צנטריפוגה-1,250 g x 10 דקות ב- 20 ° C.
    2. תשאף כמה שיותר מדיה ככל האפשר מתוך בגדר.
    3. Resuspend בגדר קפואים מדיה (טבלה 3).
    4. להקפיא את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס בתוך מיכל הקפאה מלאים 100% אלכוהול איזופרופיל. להעביר את aliquots קפוא נוזלי N 2 למחרת לאחסון לטווח ארוך-
      הערה: תאים יכולים להיות תרבותי לאחר הקפאה.
  8. מפשיר תאים
    1. והפשרה באמבט מים 37 ° C תוך מתערבל של הסרה של aliquot של תאים קפוא. להסיר aliquot את האמבט במים לפני זה יש מלא הקרת לנוזל.
    2. להעביר מיד את התאים המופשרים צינור חרוטי 15-ml. מתחיל להאט בתחילה, להוסיף 10 מ של התקשורת מלאה עם ערבוב לסירוגין.
    3. להפוך את התחתית מספר פעמים כדי לערבב.
    4. צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות ב 20 º C.
    5. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 2-5 מ של מדיה מלאה חמה.
    6. לספור את התאים ואת צלחת כאמור תיאר.

3. הטיפול העיקרי Trophoblasts עם TNFα, אוסף של תאים Lysates המערבי סופג

  1. הכנת
    1. לחמם מדיה מלאה 37 מעלות צלזיוס.
    2. עושים מלאי µg/מ"ל של TNFα מדיה מלאה, חנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש.
    3. להפוך 1 µg/mL מלאי עבודה של TNFα בתקשורת מלאה כאשר מוכנה לטפל התאים. סידורי לדלל את מלאי עבודה TNFα 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL של 125 pg/mL בתקשורת מלאה.
      הערה: ריכוז TNFα 10 4 pg/mL היא ציטוטוקסיות במתינות. ההתאמה של ריכוז TNFα נבדק תלויות בפרטים של היישומים הרצויים במורד הזרם.
  2. לטיפול תאים עם TNFα
    1. לאחר 24 שעות של תרבות, תשאף התקשורת התרבות את התאים ואת החלף ב 2 מיליליטר TNFα שיושלם מדיות לכל טוב על. ובכן 6 צלחות (לפחות שתי בארות לכל טיפול, רכב פקד).
    2. לאחר 24 h TNFα-חשיפה (48 שעות של תרבות), להחליף את מדיות TNFα בתוספת מדיה מלאה.
  3. קציר תאים וחלבונים הכולל
    1. לאחר 72 h של תרבות (24 h בעבר הסרת TNFα), תשאף מדיה, לשטוף בעדינות תאים עם טמפרטורת החדר PBS ולהוסיף 80 µL של קרים כקרח Radioimmunoprecipitation Assay מאגר (ריפה) המכיל טרי להוסיף מעכבי פרוטאז, פוספטאז (טבלה 3) ישירות מכל קידוח.
    2. להסיר התאים הצלחת עם המגרד התא. להעביר את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL, איגוד בארות בתוך קבוצות הטיפול.
    3. Lyse בתאים על-ידי vortexing הצינורות גבוה לפחות שלושה במרווחים של 15 ס'
    4. דגירה התאים ב 4 ° C עם נדנדה במשך 15 דקות
      הערה: לחלופין, לאחר שלב 3.3.3., התאים יכולים להיות מודגרות על קרח למשך 15 דקות עם עצבנות לסירוגין על ידי מצליף את הצינור, vortexing, או pipetting למעלה ולעשותמהסכנה.
    5. חזור על שלב 3.3.3.
    6. Centrifuge הצינורות ב g x 10,000 למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה פסולת הסלולר.
    7. העברת תגובת שיקוע (המכילה חלבון תאית) צינור microcentrifuge 1.5 mL החדש, חנות ב-80 מעלות צלזיוס
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות עצר כאן, חודשה במועד מאוחר יותר. מומלץ להכין מספר aliquots של דגימות חלבון הסלולר כדי למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.
    8. לקבוע ריכוז החלבון הכולל בשיטה המועדפת, כגון וזמינותו חומצה bicinchoninic (BCA, עיין בטבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים).
  4. מרחביות-דף, ווסטרן סופג רוביקון או חלבון של עניין
    הערה: בצע המערבי סופג פרוטוקולים על פי יצרן ' s הוראות שימוש במערכת המעבדה המועדפת.
    1. עומס בין 20-40 µg של חלבון הכולל במאגר מדגם (טבלה 3) לכל טוב על אקרילאמיד 12% ג'ל. להפריד חלבונים על ידי עמודים מרחביות בניהול מאגר (טבלה 3).
    2. רטוב-העברת החלבונים של הג'ל על קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על פי יצרן ' s הוראות במאגר העברה (טבלה 3).
    3. דגירה קרום אבקת חלב 5% ב- Tris-Buffered Saline עם 0.1%-20 Tween (TBST, טבלה 3) לפחות שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
    4. דגירה הקרום ב נוגדן ראשוני רוביקון (ראה טבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים)-שבערך באבקת חלב 1% ב- TBST בין לילה ב 4 ° C עם נדנדה.
    5. בעדינות לשטוף את הקרום 3 x 5 דקות ב- TBST ו- 1 x 5 min ב- TBS בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
    6. דגירה הקרום ב 1:2000 - נוגדן משני 1:5000 (מועדף או מקושרים-HRP גלוי המספר המשלים, עיין בטבלה של אספקה חיונית, ריאגנטים, ואת ציוד, חומר משלים) אבקת חלב 5% ב- TBST לפחות שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
    7. חזור על הפעולות כביסה המתוארים שלב ' ר 3.4.5 והמחש את האבן החשופה עם סובסטרט (קרי chemiluminescent) ויזואליזציה המתאים במערכת ההדמיה.
    8. חזור על הפעולות כביסה המתוארים שלב ' ר 3.4.5 ואני בדיקה הקרום עבור β-אקטין או פקד הטעינה מועדף על פי יצרן ' הוראות s.
    9. על תוכנת ניתוח התמונות המועדף, לנתח את הביטוי של רוביקון מאת כימות ידנית של ספיגת (עוצמות הלהקה), חיסור של רקע ספיגת ונורמליזציה הטעינה המתאימים לשלוט בעוצמות הלהקה. לבצע ניתוחים סטטיסטיים בהתאם לבדיקת שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית רמות החלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונח אנושי מאחד לשני מ רזה (מדד מסת הגוף שלפני ההריון (BMI) < 25) אמהות עם הריונות מסובכת נושאת צאצאים נקבות היו נאספים, שנדגמו תוך 15 דקות מרגע הלידה בניתוח קיסרי (ללא עבודה). מאחד לשני נבחנו בהעדר calcifications ופיתוח טיפוסי: שקילה בין 300-600 גרם עם חבל הטבור ממברנות הוסר, עגול בצורת, בין 15-25 ס מ קוטר, מוכנס לתוך האמצע חבל הטבור השליה. רקמות villous חלקית היה גזור מן הבזליים, שליה הלוחות ב- 2-3 דגימות על פני השליה (איור 1), מניב כ 100 גרם של רקמת vil...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השליה, אחראית להסדרת הצמיחה של העובר, תערוכות פונקציה פרוץ ב סביבה שמנים6. למרות דרישות המטבולית גבוהה של trophoblasts, מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית התערוכה מתפקדת נשימה מיטוכונדריאלי6,19. שינויים בחילוף החומרים היפרדות עשוי לתרום שכיחות מוגברת של סיבוכים ותוצאות עוברית לוואי נצפו הריונות שמנים3,6,7. Autophagy בסכנה גם ב מאחד לשני עם השמנת יתר אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה נשים שתרמה שלהם מאחד לשני במחקר זה. אנו מודים גם את העבודה ואת משלוח במחלקת OHSU ואת Maternal צוות המחקר העוברי לתיאום איסוף מאחד לשני. אנו אסירי תודה אריק וונג, Ph.d., ו קלי קואו, MD לתמיכה, לעזור עם שיטות נסיוניות ואופטימיזציה.

עבודה זו מומן על ידי NIH HD076259A (AM) ו AHA GRNT29960007 (AM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (אנהיד.)סיגמא-אולדריץ'C1016-100G
MgSO4 (אנהיד.)סיגמא-אולדריץ'M7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TrypsinGibco15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.
מעכבי פרוטאז/פוספטאזThermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
נתרן דאוקסיכולאט.פישר סיינטיפיקAAJ6228822
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'X100-500 מ"ל
איסקוב s Modified Dulbecco' s בינוני (IMDM)Gibco12440-046
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג35-010-CV
סרום עגל יילודים (NCS)Gibco26010-074
פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפטוקוקוק)Gibco15140-122
10% פורמליןפישר סיינטיפיק23-427-098
DMSOסיגמא-אולדריץ'D2650-100 מ"ל
TNF ואלפא;Sigma-AldrichSRP3177-50UG
תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS)Gibco70013-032
K2EDTA צינורות איסוף דם ואקוטיינרBD366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)GE Healthcare17-0891-01
6 צלחות בארקורנינג
Fisher Scientific22363549
Eppendorf צינורות נעילה בטוחה 2.0 מ"ל, טבעיFisher Scientific22363352
Trypan BlueCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot CellBio-Rad1658033
TGX FastCast ערכת אקרילאמיד, 12% Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting ChamberBio-Rad1654112
4X Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-100ML
GlycineBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
אינסטנט ללא שומןציפורן
יבש רוביקון (D9F7) ארנב mAbטכנולוגיית איתות תאי8465S
נוגדן חד שבטי נגד ובטא;-אקטין המיוצר בעכברסיגמא-אולדריץ'A2228-100UL
נגד ארנב IgG, נוגדן מקושר HRPטכנולוגיית איתות תאים7074S
נגד עכבר IgG, נוגדןמקושר HRPטכנולוגיית איתות תאים7076S
SuperSignal West Pico PLUS מצע כימילומינסנטThermo Scientific34578
LS002139 מסננות תאים 353046 חלב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975(2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TNF AlphaWestern BlottingRubicon

מאמרים קשורים