מאמר שיטה

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

DOI:

10.3791/56493

⸱

25 בספטמבר 2017

 , 
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג'ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.

לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.

NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של הקלטה אלקטרודות

  1. מושך האלקטרודות זכוכית
    1. השתמש בהבא פרוטוקול פולר microelectrode (ראה טבלה של חומרים):
      1. קו 1: חום 510 משוך - מהירות 30 פעם 250; קו 2: מחממים למשוך 490 - מהירות 30 פעם 250.
        הערה: יחידות זמן שיתאימו ms 0.5 ליחידה; היחידות האחרות הן יחסיות. הערך של החום צריך להיות מותאם עבור כל נימה לאחר הבדיקה הרמפה מתבצע.
    2. להשתמש במיקרוסקופ (35 x הגדלה) על מנת להבטיח כי הקוטר הפנימי של האלקטרודה משך בטווח של 7-10 מיקרומטר ( איור 1 א'). לאחסן הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק.
  2. אש ליטוש
    1. אש פולנית נימים (80-90% של ערך חום מרבי עבור s 1-2) באמצעות מיקרו-פורג (ראה טבלה של חומרים). ודא הקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה מלוטש 5 מיקרומטר ( איור 1 א') 27-
  3. Bending
    הערה: שני עיקולים נעשות לצורך מקם את האלקטרודות על השריר תחת מטרה בהגדלה.
    1. שימוש המנגנון באיור איור 1B. לתקן את האלקטרודה manipulator ומקם את הטיפ מעל חוט הלהט, לא נוגע את זה
    2. סט חום ערך ל- 60-70% מהמקסימום והקש על דוושת של המיקרו-פורג עבור s 1-2 (ראה טבלה של חומרים) כדי לחמם את הסיב. השתמש של המחט בצורת L כדי להוריד בעדינות את קצה האלקטרודה ( איור 1B מוגדלת). להפוך את העיקול על 90 o ( איור 1C).
    3. החזק האלקטרודה מעל להבת המבער ביד באמצעות מלקחיים ולעשות העיקול השני ממרחק של 7-10 מ מ העיקול הראשון, בזווית של-120 o ( איור 1C).

figure-protocol-1
איור 1. הצעד האחרון של ייצור micropipette. (א) אלקטרודה טיפים לאחר משיכת וליטוש אש. (B.1) ההתקנה עצה כיפוף. (B.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. האלקטרודה ואת הלהט קבועים כך הקצה אלקטרודה הוא ממוקם מעט מעל הגדר ונוגע לא. (C.1) האלקטרודה הקלטה. (C.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. העיקול הראשון יש זווית של-90°, המרחק בין קצה האלקטרודה העיקול הראשון הוא בערך 1 מ מ. גודל בר = 3 מ מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. צעדים הכנה נוסף

  1. הכן, כמו heamolymph (HL3) פתרון (במ מ): 70 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, טרהלוז 5, סוכרוז 115, 5 HEPES ו- 1 מ מ CaCl 2; להתאים את ה-pH ל 7.3 - 7.4. לשמור את הפתרון במקרר ולהפוך אותו טרי כל שבוע.
  2. לגרום גירוי pipets באותה דרך כמו הקלטה זכוכית pipets, חוץ מזה שאין שום צורך לכופף אותם.
    הערה: הכנת גירוי אלקטרודות מתואר בפירוט 28 ו -27. הקוטר סופי לאחר ליטוש אש צריך להיות בטווח של 5-7 מיקרומטר.
  3. הוספה פיפטה גירוי של בעל microelectrode מחובר מזרק.
  4. ייצור לנתיחה צלחות קטנות צלחות פטרי (35 x 10 מ מ) מצופה אפוקסי גומי סיליקון (ראה טבלה של חומרים) כמתואר ב- 28-
    הערה: גומי סיליקון צריך להיות לגמרי מוקשח לפני השימוש.
  5. לבחור הזחלים השלישי-לחלל נודד, לנתח את זה. כפי שמתואר 27 , 28 , 29 , 30-
    הערה: כדי להמחיש עם העיתון ons, השתמש המתח לטוס CD8-GFP (ראה טבלה של חומרים)
    1. באמצעות מלקחיים (ראה טבלה של חומרים), לבחור את הזחלים לחלל רואד 3 מתוך בקבוקון.
    2. להצמיד את הזחלים, הצבת את הסיכה הראשונה האחורי ולהדק אחר הקדמי (סגור את הפה ווים).
    3. HL3 להוסיף פתרון.
    4. לעשות חתך באמצעות מעיין מספריים (ראה טבלה של חומרים) כל הדרך מן הסיכה העליונה לתחתית אחת בצד הגבי של הזחלים.
    5. להצמיד את פילה הזחלים, הנחת 2 סיכות נוספים על השמאלי והימני של הזחלים.
    6. להסיר את האומץ ואת tracheas באמצעות מלקחיים.
    7. לחתוך את העצבים מחוץ חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב.

3. חשמל הקלטות של שלטון

figure-protocol-2
באיור 2. הגדרת הקלטה. המדגם NMJ מוצמדת סיליקון מצופים צלחת פטרי (חץ) ממוקם על השלב מטלטלין של המיקרוסקופ מתחם זקוף מצוידים עם יכולות epifluorescence, מטרה בהגדלה, micromanipulators שני. המיקרוסקופ מוצב על טבלת אנטי רטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הקלטה
    1. מקום צלחת פטרי עם ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ( איור 2). הכנס האלקטרודה הפניה באמבטיה.
    2. למלא האלקטרודה הקלטה עם HL3 פתרון. תחת המטרה 10 x (ראה טבלה של חומרים), לטבול את האלקטרודה לתוך האמבט ומניחים אותו מעל השרירים 6 ו-7 המקטעים בטן 2, 3 או 4 שימוש את micromanipulator ((ראה טבלה של חומרים) איור 3 A.1, A.2).
    3. לעבור המטרה 60 x (ראה טבלה של חומרים). להתמקד באזור עניין באמצעות epi-זריחה או אופטיקה DIC. המקום קצה האלקטרודה מעל סינפטית בוטון ( איור 3 B.1-3).
    4. הקש האלקטרודה בעדינות לתוך השריר. לחץ מופרז עלול נזק NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית ספונטנית. ודא קצה האלקטרודה אינה סתומות - אם זה, להחליף את זה
    5. לעבור על המגבר, לוח A/D המחשב.
    6. לבחור את מצב קלאמפ מתח על המגבר.
    7. להתחיל רכישת התוכנה ולבחור ' ללא פער ' מצב.
    8. להתבונן במראה של mEJCs על מסך המחשב.
    9. לוודא משרעת של mEJCs זה בטווח של 0.2 - 0.7 הערך לא ישים
      הערה: שלטון קטנים יותר לציין כי האלקטרודה ההקלטה יש פגמים או כי זה אינו ממוקם כראוי.

figure-protocol-3
איור 3. ויזואליזציה של סינפטית עם העיתון ons- (א) א brightfield תמונה של המי-קטע מתחת לגיל 10 x הגדלה (A.1) ואזור מסגרת מוגדלת מראה שרירי 6 ו-7 (A.2, החץ מסמן האלקטרודה הקלטה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) סינפטית עם העיתון ons הם דמיינו קו דרוזופילה סמן עצביים מקודדים גנטית (CD8-GFP) באמצעות הדמיה epi-קרינה פלואורסצנטית (B.1) או DIC אופטיקה (B.2). תמונות נלקחים עם ה 60 x אובייקטיבית, הקוביה מסנן עבור GFP הדמיה (ראה טבלה של חומרים). Synaptic עם העיתון ons מסומנים עם החצים, כיסוי של פלורסנט ותמונות DIC מוצג B.3. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. גירוי
    1. באמצעות micromanipulator, תחת פקד חזותי, מקום האלקטרודה גירוי ליד האקסון innervating מקטעים בטן 2-4-
    2. החל לחץ שלילי על ידי משיכת את הבוכנה של המזרק מחובר למחזיק אלקטרודה, כך האקסון עשה בתוך האלקטרודה ( איור 2).
    3. הפעל ממריץ. סובב את כפתור על יחידת בידוד (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את זרם אפס ולאחר מכן בעדינות להגדיל אותו, עד שלטון יופיעו (או עד לסף).
    4. לבצע הגירוי במשטר suprathreshold, עם גירוי הנוכחי עלה כ פעמיים, לעומת הסף עבור הצפיה שלטון.
      הערה: מניסיוננו, עוצמת גירוי כזה הוא אופטימלי כדי למנוע כשלים פוטנציאל הפעולה, פוטנציאל הפעולה ירי. לדוגמה, אם שלטון יופיע הזרם גירוי של 0.2 אמא, להשתמש זרם של 0.4 mA לאורך כל הניסוי.
  2. חותם ההתנגדות
    1. למדוד את ההתנגדות החותם של האלקטרודה macropatch הקלטה על-ידי הפעלת המתג התנגדות האלקטרודה של המגבר כדי " חותם מבחן " עמדה. לצפות כי הערך של עמידות חותם GΩ יוצג " הנוכחי " החלון.
    2. לוודא ההתנגדות החותם הוא בטווח של 0.5 - 2 מ' Ω. ערכים מחוץ לטווח זה מציינים כי האלקטרודה מלוטשים כראוי או לא תקינה מוצבים.
    3. לנטר את ההתנגדות חותם לאורך ההקלטה, מוודא שזה נותרת קבועה לאורך כל הניסוי.

4. ניתוח

  1. ניתוח הקלטות העסקת אישית תוכנה לניתוח (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: המעבדה שלנו משתמשת בתוכנה שבאתר Quantan 31, אשר הוא מותאם אישית עבור הגילוי של שלטון, mEJCs הקליט focally ( איור 4). תוכנה זו מאפשרת הגילוי של פסגות ההרים quantal חופפים quantal מרובת אירועים ( איור 4A) וכולל דיגיטלית מסנן לפי עקומת גאוס. גישות אחרות מתוארים 17.

figure-protocol-4
באיור 4. ניתוח quantal. זיהוי של mEJCs (א) ושלטון (B) על-ידי תוכנת Quantan. אזור האירוע מסומן בירוק, פסגות שסומנו על-ידי ראשי חץ אדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטות macropatch מוקד מאפשרים ניטור פעילות סינפטית של הנבחרת עם העיתון ons סינפטית (איור 5). כאשר האלקטרודה ממוקמת בחלק העליון בוטון סינפטית (איור 5A, אתר 1), mEJCs המוקלט (איור 5C, אתר 1) יש את amplitudes באופן משמעותי העולה על רמת הרעש וחדד בעליה שלבים (מטווח תת אלפיות השנייה). כאשר האלקטרודה הקלטה הזזת את בוטון סינפטית על ידי מספר מיקרונים (איור 5A, אתר 2), amplitude...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות מדויק של ההעברה הסינאפסית-עם העיתון ons מטמיעים.

ההצלחה של הפרוטוקול המתואר אנושות תלוי היכולת להמחיש בבירור את תחומי עניין, כדי להתאים אישית את הכנת הקלטה אלקטרודות. לפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Sutter P-97Sutter instrumentP-97חולץ מיקרואלקטרודות
Narishige MF-830NarishigeMF-830Microforge
WPI MF200WPIMF200Microforge
זכוכית קפילריםWPIB150-86-10קמפי זכוכית
Microtorch 1WG61גרגר1WG61Microtorch
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקוןDow CorningSYLGARD 184סיליקון להכנת צלחות חיתוך
סיכות חיתוך סיכותB00J5PMPJA של אמזוןלמיקום זחלים
פינצטהWPIINC500342פינצטה להנחת סיכות, הסרת המעיים וקנה הנשימה.
מספרייםWPIINC501778מספריים לחיתוך הקוטיקולה של הזחלים והעצבים.
אולימפוס BX61WIאולימפוסBX61WIמיקרוסקופ זקוף
אולימפוס Lumplan FL N 60xאולימפוסUPLFLN 60Xמיקרוסקופ אובייקטיבי 60X
אולימפוס UPlan FL 10xאולימפוסUplanfl N 10Xמיקרוסקופ אובייקטיבי 10X
Narishige מיקרומניפולטורNarishigeMHW-3צירים מים הידראולי מיקרומניפולטור
npi אלקטרוני GmbH ELC-03XSnpi אלקטרוני GmbHELC-03XSמגבר אלקטרופיזיולוגי
A.M.P.I מאסטר 8A.M.P.I.מאסטר 8סטימולטור חשמלי
A.M.P.I איזו-פלקסA.M.P.I.מבודד גירויIso-Flex
TMC שולחן נגד רטטTMC63-9090שולחן נגד רעידות
TMC כלוב פאראדייTMC81-333-90כלוב פאראדיי
Digidata 1322AAxon InstrumentsDigidata 1322Aמחשב Digidata
DellDimension 5150מחשב עם
מחזיק אלקטרודותWPIMEH3SWמחזיק אלקטרודה
מסנן אופטיאומגה אופטיXF 115-2קוביית סינון לזיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)
pCLAMP 8Axon Instruments8.0.0.81תוכנה להקלטת אותות
פנימיתQuantanלעיבוד אותות
Canton-S (Wildtype)מרכז המניות בלומינגטון64349קו זבוב בקרה
cpx SH1מתנה נדיבה של J.T.Littleton-Complexin קו זבוב נוק-אאוט עם אקסוציטוזיס ספונטני מוגבר
CD8-GFPBloomington Stock Center5137קו זבוב עם תג פלואורסצנטי עצבי (GFP)
שלושה Win XP OS תוכנה של תוכנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
  2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
  3. Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
  4. Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
  5. Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
  6. Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
  7. Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
  8. Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
  9. Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
  10. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
  11. Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
  12. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
  13. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
  14. Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
  15. Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
  16. Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
  17. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
  18. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  19. Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
  20. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
  21. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
  22. Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
  23. Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
  24. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
  25. Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
  26. Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
  27. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
  28. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  29. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  30. Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
  31. Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
  32. Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
  33. Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
  34. Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
  35. Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים