מאמר שיטה

וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים

DOI:

10.3791/56507

⸱

12 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות ניווניות קשורות לעתים קרובות אובדן הדרגתי של יכולת תנועה מופחתת תוחלת החיים, תלויי-גיל הקשורים ניוון מוחיים. כדי להבין את המנגנון של אלה הסלולר אירועים, ואת יחסיהם סיבתי אחד עם השני, דרוזופילה melanogaster, עם כלים גנטיים מתוחכמים שלה מגוון תכונות התנהגותיות, משמשים כמודלים מחלות להערכת פנוטיפים ניווניות. כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה כדי לנתח את התנהגות דרוזופילה geotaxis שלילי למבוגרים, כאינדיקציה אפשרי פגמים מוטוריים הקשורים הקשורים ניוון מוחיים. מכונה אוטומטית של נועד ופיתח לסינכרון לטוס כונן באמצעות דחף חשמלי הראשונית, מאוחר יותר ומאפשר את ההקלטה של התנהגות שלילית geotaxis במהלך מספר שניות עד דקות. תמונות מתוך הווידאו המוקלט דיגיטלית מעובדים אז עם התוכנה RflyDetection בעיצוב עצמי עבור נתונים סטטיסטיים מניפולציה. שונה וזמינותו geotaxis שלילי מבוקר באופן ידני בהתבסס על זבוב אחד, פרוטוקול זה מדויק, מהיר, תפוקה גבוהה מאפשר רכישת נתונים יותר מאשר מאות זבובים בו זמנית, מספקים גישה יעילה לקידום שלנו להבנת המנגנון הבסיסי של גינקולוגיות הגירעונות הקשורים הקשורים ניוון מוחיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחו מגוון של פרוטוקולים, שיטות לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים דרוזופילה . די מייגעת, הניתוח המסורתי בעיקר כרוך לשים זבוב אחד לתוך המבחנה בודדים ומשתמש כוח ידני כדי הקש על זבובים למטה עבור סינכרון1,2,3,4. זה מייגע, זמן רב, מתאימים ללימודי תפוקה גבוהה גדולים, יש פוטנציאל וריאציות של הכוח ידנית פעם לנצל את הזבובים, כמו גם מגבלות אחרות. לשיפור וזמינותו, פותחה assay מהירה איטרטיבי שלילי Geotaxis (טבעת) אשר מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה זבובים רבים בבית באותו זמן5. עם זאת, וזמינותו מחייבת עדיין כוח ל"שבירת באופן ידני כדי לסנכרן פעולה לעוף. הגרסה שלנו של הטבעת וזמינותו, מתוקן על וזמינותו הקודם, כולל בסיס מתכת אירוח מרובים בקבוקונים המכילים לטוס באופן אוטומטי נשלט על ידי מנוע חשמלי לנהוג סינכרון לטוס6. על הקלטה, הזבוב טיפוס מיד לאחר סינכרון נרשם אז נותחה באמצעות תוכנת בעיצוב עצמי. Assay טבעת האוטומטי שלנו יש חיסלה את תהליך מייגע מהגידולים באיסוף מידע של זבוב אחד, אחד בכל פעם, והוא מופעל תהליך רכישת נתונים כדי להיות יעיל יותר. בנוסף, וזמינותו טבעת אוטומטיות ננקטה מספר מחקרים כדי להבהיר את המנגנון הבסיסי, אלצהיימר, פרקינסון, אימות הגישה עם יעילות גבוהה7,8,9 .

במאמר זה נדגים וזמינותו טבעת אוטומטית באמצעות DDC-Gal4 מונחה זבובים RNAi. DDC-Gal4 הוא קו Gal4 לבטא במפורש דופאמין (DA), הנוירונים תכולה, ובכך מייצג כלי נהדר עבור ניתוח ההשפעות ג'ין היעד המשויך גירעונות גינקולוגיות הנלווים הקשורים ניוון מוחיים10. בנוסף, אנו משלבים את UAS-Dicer2, קו לטוס משפר את יעילות RNAi, כדי ליצור את UAS-Dicer2; DDC-Gal4 כלי הקו. הזבובים RNAi אנו בוחרים להשתמש הוא auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), גן כי בעבר זיהינו שהפגינו אפקט על טוס גינקולוגיות פעילות8. auxGFP זבובים מוכנים גם ניתוח השפעות רבות על ביטוי aux . אנחנו נראה כיצד להשתמש וזמינותו טבעת אוטומטית כדי למדוד לטוס geotaxis שלילי, להציג את התוצאות ולדון כל השלכות רכשה את התוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-אוסף לטוס

  1. לשמור על הזבובים על תקן מזון לעוף-25 ° C, 70% לחות ו- h 12 h 12/כהה מחזור.
  2. לאסוף UAS-Dicer2; DDC-GAL4 virginsunder לעוף פחמן דו-חמצני (CO 2) הרדמה.
  3. לחצות את בתולות אלה 2 בן יום זבובים זכרים בוגרים נושאת את אחרים הבאים: UAS-mCD8GFP (בקרה), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux ביטוי), ו auxR 16182; auxGFP (חילוץ), זכר: נקבה יחס של 1:2.
  4. בנפרד לאסוף לאחרונה eclosed זכרים ונקבות ב 3 vials כל קבוצה לכל ניסוי, הצבת 10 זבובים כל בקבוקון לטוס רגיל עם אוכל סטנדרטי-25 מעלות צלזיוס
  5. בהתאם הניסוי, שמור שנאספו טס עד 35 ימים, ולהשתמש בהם לניתוח טבעת אוטומטיות ביום 5, 15, 25, ו- 35-

2. אוטומטית Assay טבעת

  1. להעביר 10 זבובים שנאספו (יוניסקס) לכל גנוטיפ לתוך כל בקבוקון ולאחר מכן לאבטח את המבחנה עם בורג. לנתח שליטה זבובים וזבובים נושאים אחרים שונים ביחד עבור כל ערכה של ניסויים (עד 10 שבקבוקי בו זמנית, 10 זבובים בכל מבחנה).
  2. להפעיל את המצלמה הדיגיטלית הניח לפני המנגנון, התחל הקלטה פעם זבובים הם כל טעון ומוכן.
  3. לאחר מתן אפשרות 1 דקות לזבובים להתיישב בקבוקונים, להפעיל את הבקר שלב השולט הנהג צעד; זה מניע מנוע חשמלי קטן כדי לשלוט את הידית המצורפת כך זה ברצף עולה, ברזי המנגנון 4 פעמים ב 2 s. ראה איור 1.
    1. לאחר הקשה, שימו לב כי הזבובים מתחילים לעלות על הקיר. להבטיח כי הקלטת ממשיכה.
  4. חוזר הסינכרון כפי שמתואר בשלב 2.3-ב 60-s מרווח עבור ניסויים ברציפות 3 עד 5.
  5. חזור על הניסוי עבור 5, 15, 25, ו זבובים בן 35 יום. לערוך ניסויים עצמאית לפחות 3 עבור כל קבוצה, כל ניסוי לפחות 30 שנאספו זבובים (3 מבחנות).

3. ניתוח נתונים

  1. ייבוא הווידאו המוקלט לתוך המחשב.
  2. לקחת תמונה של הוידאו-6 s לאחר הקשה, למשפט לכל.
  3. לייבא את תמונת בזק התוכנה RflyDetection (ראה איור 2), באמצעות ' קובץ ' תפריט.
  4. להגדיר את תוכניות בסיסיות העליון והתחתון של הבקבוקון בדיוק על ידי שימוש בסמל בסיסית בסרגל הכלים ולאחר מכן באמצעות הסמן כדי לסמן את התוכניות הבסיסיות העליון והתחתון על התמונה.
  5. קלט את המספר של זבובים לכל מבחנה (למשל, כאן 10) לתוך ' Flys ב מלבני ' שדה וכל המבחנה אורך (למשל, 14 ס מ כאן) ' גובה הצינור ' שדה בתוך הבר הגדרות.
    1. הערה כי העמדות לטוס בודדים הם זוהה ולא עם נקודות על המסך עבור כל בקבוקון תוויות.
      הערה: איור 2 מציינת את העמדות של כל לחיצות כפתור תפריט.
  6. הערה כי התוכנה באופן אוטומטי קובעת את המרחק טיפוס עבור כל זבוב, מציג את הערכים בממוצע של 10 זבובים בכל מבחנה בטבלה שבלוח הימני. (ראה איור 2)
  7. לעבד את המספר טיפוס עם תוכנה סטטיסטית (למשל, פריזמה) לצורך ניתוח סטטיסטי נוסף.
  8. המתנה הנתונים כטקסט מתכוון ± ב- SEM.
  9. לחשב p-ערכים של מובהקות (מסומן בכוכביות, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001) באמצעות חד-כיווני אנובה עם Bonferroni מרובים השוואה ילדי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגים את השימוש assay טבעת אוטומטיות בהערכת התנהגות לטוס geotaxis שלילי. בניגוד וזמינותו הטבעת הקודמת, וזמינותו שלנו כולל מכשירים אוטומטיים מספק כוח חשמלי כדי לסנכרן פעולה לטוס ומנתח עד מאות זבובים בו זמנית (איור 1). ניתוח של Dicer2; DDC > auxR16182 זבובים הראה על ירידה תלויי-גיל המרחק טיפוס במסגרת זמן 6-s לזבובים גם זכר וגם נקבה, רומז aux ביטוי בנוירונים דא הוא חיוני לפעילות גינקולוגיות לעוף. טיפוס היכולת לא נראה משפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזמינותו טבעת אוטומטיות המתוארים כאן מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות לטוס geotaxis שליליות עבור מאות זבובים בו זמנית. בעבר קיימות אסטרטגיות לניתוח טיפוס למבוגרים לערב תצפיות של זבוב אחד ב המבחנה בודדים, עמדה לטוס מזוהה באופן ידני לפי העין. תהליך מייגע למדי זה עלול לעתים לגרום מהבנה שגויה או פירוש מוטעה של הנתונים, כמו גם עבודה שדורשת. Assay טבעת האוטומטי שלנו מתחיל בלחיצה פשוטה, המנגנון מסנכרנת באופן אוטומטי ומודד ביכולת טיפוס של זבובים עד 100. הסינכרון חשמלי מספק אמצעים מדויקים יותר כדי לשלוט זמן ופרמטרים אחרים, אז ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז מניות בלומינגטון ומרכז וינה דרוזופילה RNAi מניות לעוף. המצאתם המנגנון הטבעת שייך מכון מחקר מתקדם של שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים. בקשות בגין התוכנה RflyDetection צריך להיעשות כדי חואנג פו-דה (ראה מחבר הרשימה). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (973 תוכנית 2013CB945602) נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31270825 ו- 31171043). אנו מודים הו חברי המעבדה דיונים והערות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תא סביבתי פורמהתרמו3949
גלילי פחמן דו-חמצניFuLian GAS TechnologyGB/T6052
מכשיר וידאו HDRSONYHDR-CX220E
מיקרוסקופ סטריאו דו-עינייםXin ZhenSMZ-168BL
מאזניים אלקטרונייםMinQiaoSL1002N
מקררחארSC-350
אגר-אגר אבקהסינופארם10000561
גלוקוזסינופארם10010518
קמח תירססינופארם5464654
סוכר חוםLiuCaiYuan45467936
שמרים יבשים מיידייםAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4מתנה מאת Fude Huang
AuxGFPמתנה מאת Henry Chang

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RINGRflyDetection

מאמרים קשורים