הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

6 בפברואר 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

תקציר

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הינם כלים רבי-עוצמה שימושי עבור שניהם מחקר בסיסי ב וההתערבות. ירידה לפרטים גבוהה שלהם היא הכרחית כאשר הנוגדן צריך להבחין בין מבנים הקשורים במידה רבה (למשל, חלבון רגיל, גרסה מוטציה הימנו). הדרך הנוכחית של יצירת mAbs שמסווגת כזה כרוך ההקרנה נרחב של תאים מייצרי Ab B מרובים, וזה גם יקר וגם זמן רב. אנו מציעים כאן שיטה מהירה וחסכונית לדור של שמסווגת, mAbs אנושית לחלוטין, החל מדם אנושי במחזור B לימפוציטים. מקוריות אסטרטגיה זו נובעת בחירת התאים איגוד B אנטיגן ספציפי בשילוב עם מבחר הנגד של כל התאים האחרים, שימוש זמינים היקפיים דם תאי תאים (PBMC). ברגע מסוים B תאים מבודדים, רצפים cDNA (חומצה deoxyribonucleic משלימים) קידוד mAb המתאימים מתקבלים תא בודד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) בטכנולוגיית והביע לאחר מכן-אנוש תאים. בתוך מעט ככל 1 חודש, זה אפשרי לייצר מיליגרם של mAbs אנושי מאוד שמסווגת נגד כמעט כל אנטיגן הרצוי באופן טבעי שזיהה את הרפרטואר תא B.

מבוא

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ייצור מהיר ופסיביות של נוגדנים חד-שבטיים אנושית לחלוטין (mAbs) נגד אנטיגן הרצוי (Ag). mAbs הם כלים חיוניים רבים מחקר בסיסי יישומים בתוך חוץ גופית ו ויוו: flow cytometry, היסטולוגיה, ניסויים סופג המערבי, ואת החסימה לדוגמה. יתר על כן, mAbs נמצאים בשימוש יותר תרופות לטיפול במחלות אוטואימוניות, סרטן, וכדי לשלוט דחייה השתלת1. לדוגמה, mAbs אנטי-CTLA-4 ו- anti-PD-1 (או אנטי-PD-L1) לאחרונה שימשו מעכבי המערכת החיסונית מחסום טיפולי סרטן2.

MAbs הראשונה יוצרו על ידי אימונוגלובולין (Ig)-מפריש hybridomas המתקבל תאי הטחול של חיסון עכברים או חולדות. עם זאת, התגובה החיסונית חזקה נגד mAbs מאתר או עכברוש הסלים שלהם לשימוש טיפולית בבני אדם, בשל הסיווג שלהם מהירה של אינדוקציה סביר של רגישות יתר תגובות3. כדי להתמודד עם בעיה זו, פרוטאין מהחי רצפים של mAbs הוחלפו חלקית על-ידי אלה האדם לייצר נוגדנים העכבר-אנושי או humanized chimeric כביכול. עם זאת, אסטרטגיה זו פוחתת באופן חלקי בלבד immunogenicity, תוך הגדלת באופן משמעותי הן את העלות והן ציר-הזמן של ייצור. פתרון טוב יותר היא לייצר mAbs האנושי ישירות מתאי B האנושית, מספר אסטרטגיות זה הינם זמינים. אחד מהם הוא השימוש של תצוגת phage או שמרים. זה כולל הצגת תחומים משתנים מספרייה קומבינטורית של Ig אדם אקראי כבד, אור שרשראות phages או שמרים, ולא בביצוע שלב הבחירה באמצעות אנטיגן ספציפי של עניין. חיסרון גדול של אסטרטגיה זו היא שרשראות קלות וכבדות מקושרים באקראיות, שמוביל עלייה גדולה מאוד הרב-גוניות של נוגדנים שנוצרו. נוגדנים שהושג סביר להניח תואמים לאלה הנובעים מן תגובה חיסונית טבעית נגד Ag מסוים. יתר על כן, קיפול חלבונים האנושית והשינויים post-translational לא באופן שיטתי משוחזרות אאוקריוטים או אפילו בכל שמרים. שיטת הייצור mAb האדם השני הוא immortalization של תאים B אנושי טבעי, על ידי וירוס אפשטיין בר זיהום או ביטוי של גורמים אנטי-מוות BCL-6 ו- BCL-XL4. אולם, שיטה זו ישימה רק לתאי זיכרון B, הוא יעיל, הדורשים הקרנת רבים mAb immortalized B והתאים המייצרים לזהות שיבוטים mAb כמה (אם בכלל) עם יחודיות antigenic הרצוי. השיטה זו וכך גם יקר וגם זמן רב.

פרוטוקול חדש לאחרונה תואר לייצור mAbs אנושית מבודדת אחת B תאים5. זה מסתמך על אופטימיזציה בתא יחיד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) עבור הגברה של שני כבדים - ו אור-שרשרת קידוד מקטעי מתא B ממוינת יחידה. זה מלווה את שיבוט וביטוי של מקטעים אלה במערכת הביטוי האיקריוטים, ובכך לאפשר שחזור של mAb אנושית לחלוטין. פרוטוקול זה שימש בהצלחה מתחיל מתאי B מתורמים שחוסנו. תאים נבצרו מספר שבועות לאחר החיסון כדי להשיג תדרים גבוהים יותר של תאי B נגד היועץ המשפטי לממשלה הרצוי, ואת ובכך להגביל את משך הזמן הדרוש לסינון6. אחרים mAbs אנושית לחלוטין גם הופקו נשאי איידס+ (וירוס הכשל החיסוני האנושי) חולים7 ו מלנומה מטופלים8. למרות ההתפתחויות הללו, יש עדיין אין הליך זמין המאפשר את הבידוד של תאים ספציפיים Ag B עצמאית של פנוטיפ זיכרון או התדירות שלהם.

ההליך שמתואר כאן מוביל בידוד יעיל ex-vivo של תאי B במחזור אדם המבוסס על ירידה לפרטים BCR שלהם, ואחריו את הייצור של mAbs אנטיגן ספציפי אנושית לחלוטין תשואה גבוהה ועם זמן הקרנה נמוכה. השיטה אינה מוגבלת זיכרון B תאים או מפריש נוגדן תאי B המושרה לאחר תגובה חיסונית, אך ניתן להחיל גם על הרפרטואר תא B נאיבי האדם. זה עובד אפילו מתחיל מתאי B הספציפיים Ag, נוכח תדרים נמוכים מאוד היא אינדיקציה טובה של היעילות שלה. העקרון של השיטה הוא כדלקמן: היקפי דם תאי תאים (PBMC) מוכתמים tetramers שני מציג אנטיגן של עניין, כל אחת המסומנת fluorochrome שונים (למשל, Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC)), tetramer השלישי מציג אנטיגן הקשורים קשר הדוק מצומדת עם fluorochrome השלישי (למשל, 421 ויולט Brillant (BV421)). להעשיר עבור תאים אנטיגן מחייב, תאים מודגרת ואז עם חרוזים מצופים אנטי-PE ו- Abs אנטי-APC, וממוינות תא ההפרדה עמודות. השבר תא APC PE+ + נבחר, ויטראז'ים עם מגוון רחב של mAbs ספציפיות עבור סוגים שונים של תאים PBMC לאפשר זיהוי של תאי B, ומתן וכפופים לזרום cytometry מיון תא. בתאי B שהן PE+ , APC+, אבל-, ויולט מבריק מבודדים. שלב זה נגד בוחר תאים אשר אינם תאים B או אפשרות לאגד אנטיגן tetramerized, אך לאגד PE או APC (תאים אלו יהיו PE+ APC– או PE– APC+) או לחלק הלא-אנטיגן של tetramers בשימוש (אלה התאים יהיה BV421+). בתאי B לא ספציפי מאוד עבור epitope עניין גם נבחרו נגד בשלב זה (תאים אלה יהיה גם BV421+). לכן, בשיטה זו ניתן לטהר ספציפי מאוד B תאים המבטאים קולטנים B-cell (BCRs) יכול להפלות בין שני אנטיגנים מאוד קרובים. תאים B ספציפיים בודדים נאספים צינורות, שלהם cDNAs Ig מוגבר-PCR (חומצות deoxyribonucleic משלימים) שיכפל והביע על-ידי קו תאים אנושיים כמו המופרש mAbs IgG.

מהווה הוכחה של המושג, מחקר זה מתאר הדור יעיל של mAbs האנושי, אשר מזהה פפטיד שהוצגו על-ידי מחלקה מורכבים histocompatibility הגדולות (MHC-אני) מולקולה, יכול להפלות בין פפטיד זה אחרים פפטידים טעון על אותו MHC-אני אלל. רמת המורכבות של Ag זה אמנם חשוב, שיטה זו מאפשרת (i) תשואה גבוהה שחזור של mAbs Ag ספציפיים; (ii) ייצור mAbs מסוגל להפלות בין שתי Ags קרובים מבחינה מבנית. גישה זו ניתן להרחיב את חוסנו או נגועים המטופלים ללא כל שינוי פרוטוקול, גם כבר בהצלחה הוכרז ב מערכת humanized החולדה9. לפיכך, מחקר זה מתאר בגישה רב תכליתי ויעיל להפקת mAbs אנושית לחלוטין שניתן להשתמש בהם מחקר בסיסי, חיסוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל דגימות דם היקפיים אדם התקבלו מתורמים אנונימיים למבוגרים לאחר הסכמה מדעת, על פי ועדת האתיקה המקומית (Etablissement פרנקאיס du שרו, EFS, נאנט, הליך PLER NTS-2016-08).

1. בידוד תאי תאי דם היקפיים אנושי

הערה: החל חומר ניתן הכולל דם היקפיים אנושי או דגימות cytapheresis. לא צריך להיות מבוגר יותר 8 שעות ודוגמאות בתוספת תרופות נגד קרישת דם (למשל, הפארין).

  1. לדלל דם עם 2 כרכים (דם היקפיים אנושי) או 5 כרכים (לדוגמה cytapheresis) של RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בינוני.
  2. בזהירות שכבה 35 מ של השעיה תא מדולל על 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור חרוטי 50-mL. להפוך צינורות רבים לפי הצורך כדי להפיץ את כל הדם מדולל. צנטריפוגה-1,290 g x עבור 25 דקות בטמפרטורת החדר רוטור דלי מתנדנד עם בלם את.
  3. בזהירות וארוקן את שכבת תאים תאי-הממשק בין המדיום הדרגתיות צפיפות השכבה פלזמה, ולהעביר את התאים צינור חרוטי 50 מ.
  4. ממלאים את הצינור עם RPMI בינוני, לערבב, צנטריפוגה-1,290 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר תא ב- 20 מ של RPMI בינונית, צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות להסיר את טסיות הדם. הסר בזהירות את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.
  6. Resuspend בגדר תא RPMI בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS).
    הערה: להמשיך ישירות אל tetramer תיוג או לשמור תאים ב 4 ° C בלילה-ריכוז של 107 תאים למ"ל.

2. tetramer-הקשורים העשרה מגנטי של תאים ספציפיים Ag B

  1. להכין Ag-tetramers על-ידי הוספת או PE או התווית על-ידי APC פרימיום כיתה streptavidin או התווית על-ידי BV421 streptavidin ב שן טוחנת יחס של 1:4 על biotinylated אנטיגן מונומרים. להוסיף את הכמות המתאימה של streptavidin-המספר המשלים בשלושה חלקים נפרדים, הוספת אחד aliquot בכל 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. להפיץ תאים (עד 3 x 108 למחזור) צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    הערה: פרוטוקול הבאות היא שפופרת אחת.
  3. Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS (פוספט Buffered מלוחים) עם 2% FBS. הוסף PE - APC-, BV421 מצומדת tetramers, אחד כדי ריכוז סופי של 10 µg/mL. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הכנת מאגר ההפרדה תא קר כקרח (SB) באמצעות PBS עם 0.5% BSA (שור אלבומין) EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) 2 מ מ.
  5. להוסיף 10 מ של תאים SB. צנפה באמצעות צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
  6. Resuspend התאים ב- 500 µL של µL SB. להוסיף 50 קר כקרח של אנטי-PE ו- 50 µL של גרגרי מגנטיים אנטי-APC.
  7. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
  8. חזור על שלב 2.5 פעמיים.
  9. לחסל את תגובת שיקוע בקפידה andresuspend בגדר תא-ריכוז של 2 x 108 תאים/מ ל SB קר קרח.
  10. Equilibrate עמודה מגנטי גדול ממוקם על מגנט עם 3 מ"ל של SB.
  11. להעביר תא השעיה מ- 2.9 על החלק העליון של העמודה equilibrated ולאפשר לרוקן לגמרי. שלב קריטי: כדי להימנע הצליעה של העמודה, התאים עוברים דרך רשת ניילון מיקרומטר 70.
  12. לשטוף את הצינור שהכיל תאי עם 3 מ"ל של SB קר קרח ולהעביר את המאגר ישירות על העמודה (במקרה של סינון, יש לשטוף 70 רשת ניילון מיקרומטר).
  13. כאשר המאגר יש מרוקנת לגמרי לתוך העמודה, להוסיף עוד 3 מ"ל של SB קר קרח לעמודה.
  14. חזור על צעד 2.13 עוד 3 מ"ל לשטוף.
  15. הסר את העמודה מגנט ומקום על צינור איסוף חרוט 15-mL.
  16. הוסף 5 מ של SB קר קרח על החלק העליון של העמודה ' לשטוף מיד את התאים מחוץ העמודה באמצעות הבוכנה. חזור על שלב זה פעם אחת.
  17. Centrifuge התאים שנאספו (מועשר tetramer רלוונטי תא חיובי שבר) ב- g 460 x עבור 5 דקות והמשך נוגדן נוסף מכתים.
    הערה: בריכת שנאסף תאים לכל הצינורות, במידת הצורך.

3. צביעת תאים B אנושי ספציפי Ag, מיון תא

  1. Resuspend בגדר תא עם קוקטייל של נוגדנים נגד CD3 (דילול הסופי: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), ו- 7AAD (1:1000) באמצעי אחסון הסופי של µL 100 ל- PBS עם 2% FBS. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
  2. להוסיף 10 מ של PBS לתאים, צנטריפוגה ב 460 x g במשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת. Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS, מסנן על גבי רשת ניילון מיקרומטר 70.
  3. להמשיך למיין תאים ספציפיים B ברמת תא בודד על cytometer סדרן התא עם זרבובית 100 מיקרומטר, בלחץ של 20 psi מבלי לחרוג אירועים/s 10009.
    הערה: האסטרטגיה המגביל המשמש מוצג באיור 1. התאים היו קודם מגודרת על CD14–CD16 7AAD–– תאים כדי לא לכלול ומונוציטים NK, תאים מתים (לא מוצג באיור1). ואז CD19+ B תאים שנבחרו לפני gating בתאי מוכתם כפול על ידי PE ו- APC הרלוונטיים Ag-tetramers. בתאי B שאינם ספציפיים היו לא נכלל בשל gating בתאי שלילי BV421 (מוכתם על ידי לא רלוונטי Ag-tetramer).
  4. איסוף תאים B בודדים לתוך חשפנות-8 המבחנות בעבר מלאים µL 10 ל- 1 x PBS ו 10 יחידות של מעכב RNAse והניח על מתלה עבור 96 microtubes. מיד להקפיא את המבחנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: המסכות המיון שבחרת על הכלי cytometer הם המסיכה התשואה: 0, טוהר המסכה: 32, ומסכה שלב: 0. הפיקדון בתא יחיד יכולה להיות מכוונת אל צלחת PCR 96 - או 384-ובכן אם יש צורך. בתאי B בודדת בוודאי קופא מהר ככל האפשר, ניתן יהיה להשאיר ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות, במידת הצורך.

4. תא ותא RT-PCR

  1. Lyse תאים על ידי חימום ישירות את הדגימות קפוא ברצועות ה-PCR-70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט יבש.
  2. להעביר רצועות קרח ולהמשיך להיפוך שעתוק (RT) על-ידי הוספת µL 10 למחזור של 2 x מיקס מאסטר מאגר המכיל 1 מ מ dNTP 25 תחל oligod(T) µg/mL, 5 מיקרומטר hexamers אקראיים, 20 יחידות של RNAse מעכב, 400 יחידות של רוורס טרנסקריפטאז.
    הערה: לאחר תא מפשיר, RT חייב להתבצע במהירות כדי למנוע השפלה RNA.
  3. דגירה 25 ° c עבור 5 דקות כדי לאפשר hexamers אקראיים hybridize, ואז תקופת דגירה של h 1 ב 50 מעלות צלזיוס, ולסיים עם דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לעצור את התגובה.
  4. להמשיך עם שני סיבובים של הגברה מקוננים PCR לכל אחד האזורים קידוד עבור המשתנה כבד (vH) ואת קאפה (vLκ) או שרשראות אור למבדה (vLλ).
    הערה: לחלופין, RT יכול להיות קפוא ב-20 ° C ודוגמאות שמרה במשך שבוע אחד.
    1. בסיבוב הראשון של ה-PCR, להוסיף 3 µL של cDNA עבור אמצעי אחסון 40 µL הסופי המכיל 1.5 mM MgCl2, dNTPs 0.25 mM, 2.5 יחידות של ה-DNA פולימראז ו 200 ננומטר של תחל החיצוני (ראה איור 2 ו לטבלה של חומרים עבור רצפי פריימר).
      הערה: ההרכב של מיקס תחל החיצוני. עבור הגברה שרשרת כבדה: 4 קדימה תחל (5' LVH mix) ולהפוך 2 תחל (3' CµCγ mix). עבור הגברה שרשרת בהיר kappa, 3 להעביר תחל (5' LV | לערבב) 1 הפוכה פריימר (3' Cκ543-566). עבור הגברה שרשרת אור למדא, 7 קדימה תחל (5' מיקס LVl), 1 להפוך פריימר (3' Cl).
      הערה: תחל עוצבו על ידי ההגה ואח . עבור הגברה של כל שרשרת כבד וקל גנים משפחה5.
    2. חלים התנאים אופניים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 94 ° C, 30 s-58 ° C עבור VH VLκ (60 ° C עבור VLλ), ואת 55 s ב 72 ° C, עם התארכות הסופי צעד ב-72 מעלות למשך 7 דקות.
    3. PCR בסיבוב השני, להשתמש µL 3 של המוצר הראשון הגברה עבור אמצעי אחסון הסופי של 40 µL המכיל 1.5 mM MgCl2, dNTPs 0.25 mM, 2.5 יחידות של ה-DNA פולימראז ו 200 ננומטר של תחל פנימי המכיל אנזים הגבלה אתרים עבור שכפול לידי ביטוי וקטורים (ראה איור 2 ו לטבלה של חומרים עבור רצפי פריימר).
      הערה: ההרכב של מיקס תחל פנימי. עבור הגברה שרשרת כבדה: 9 קדימה תחל (5' AgeIVH מיקס) ולהפוך 3 תחל (3' SalIJH מיקס). עבור הגברה שרשרת בהיר kappa, 9 קדימה תחל (5' AgeIV | לערבב) 3 הפוכה תחל (3' BsiWIJκ מיקס). עבור הגברה שרשרת אור למדא, 6 קדימה תחל (5' מיקס AgeIVl), 1 להפוך פריימר (3' XhoICl).
      הערה: תחל עוצבו על ידי ההגה. et al., עבור הגברה של כל שרשרת כבד וקל גנים משפחה5.
    4. חלים התנאים אופניים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 94° C, 30 s-58 ° C עבור VH LCκ (60 ° C עבור LCλ), ואת 45 s ב-72 מעלות עם התארכות הסופי צעד ב-72 מעלות למשך 7 דקות.
  5. לזהות בארות חיובי על-ידי העברת 5 μL של מוצרי ה-PCR של vH, vLκ, vLλ-ג'ל agarose 1.5% (500 מוצרים bp עבור פלחי קידוד שרשרת כבדה משתנה) ומוצר bp 350 עבור שרשרת אור משתנה קידוד מקטעי.
  6. לטהר הנותרים 35 µL PCR המוצרים שנותרו מבארות חיובי באמצעות ממברנות אולטראפילטרציה מתקני טיהור של מוצרי ה-PCR.
  7. Elute מוצרים PCR עם 60 µL של H2O.

5. ביטוי שיבוט

  1. להכין מוסיף
    הערה: לעכל 60 µL של כל ה-PCR מטוהרים המוצר באמצעי אחסון הסופי של 100 µL המכיל מאגר אנזים הגבלה המתאים.
    1. למוצרי PCR vH, להוסיף 50 יחידות של AgeI ו- 50 יחידות של סאלי, ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    2. למוצרי PCR vLλ, להוסיף 50 יחידות של AgeI ו- 50 יחידות של XhoI, ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    3. למוצרי PCR vLκ, להוסיף 50 יחידות של AgeI ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. לטהר מעכל באמצעות ממברנות PCR 96 ו elute עם µL 60 H2O. לעכל את eluate µL 60 באמצעי אחסון הסופי של µL 100 BsiWI אנזים הגבלה המאגר, להוסיף 50 יחידות של BsiWI ולאחר תקופת דגירה של h 1-55 מעלות צלזיוס.
    4. בטל האנזימים על ידי חימום ב 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. הכנת לבטא וקטורים
    הערה: מוצרי ה-PCR vH משוכפלות ב וקטור ביטוי (HCγ1) המכילה את שרשרת כבדה קבועה Cγ1 של IgG1. מוצרי ה-PCR vLκ משוכפלות ב וקטור ביטוי (LCκ) המכילה את שרשרת אור קבוע Cκ. מוצרי ה-PCR vLλ משוכפלות ב וקטור ביטוי (LCλ) המכילה את שרשרת אור קבוע Cλ.
    1. לבצע את digestions הבאות:
      1. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור HCγ1 עם 10 יחידות של AgeI ו 10 יחידות של סאלי endonucleases ב הנפח הכולל של 20 µL מאגר ההגבלה המומלצת על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
      2. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור LCκ עם 10 יחידות אנזים הגבלה AgeI ב הנפח הכולל של µL 20 הגבלת מאגר מומלצים על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. להוסיף 10 יחידות אנזים הגבלה BsiWI, ולאחר תקופת דגירה של h 1-55 מעלות צלזיוס.
      3. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור LCλ עם 10 יחידות של AgeI, של XhoI endonucleases ב הנפח הכולל של µL 20 הגבלת מאגר 10 יחידות המומלץ על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C
    2. מחממים את כל התערובת עיכול-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להשבית את אנזימי הגבלה.
    3. לבצע מצדו של 5 µL של מוצר ה-PCR מתעכל עם 2 µL (100 ng) של וקטור ביטוי ליניארית המתאימה בהנפח הכולל של 20 µL 1 x DNA ליגאז מאגר עם 1 יחידה של T4 DNA ליגאז על ידי דגירה בין לילה ב 4 º C.
      הערה: לחלופין, מצדו שבוצעו עבור h 3-4 מעלות צלזיוס.
  3. שיבוט
    1. Electroporate 1 µL של תערובת מצדו 20 µL לתוך µL 45 של תוצרת בית electrocompetent TOP10 e. coli (הנוכחי פרוטוקולים בביולוגיה מולקולרית, סעיף 1.8.4-1.8.8). מיד להוסיף 500 µL 2 X יט בינוני, דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות התפשטות טרנספורמציה חיידקים על 2 x יט אמפיצילין צלחות. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    2. עבור כל שינוי, מסך שמונה מושבות על ידי ה-PCR.
      1. להגדיר premix התגובה כמפורט על הקרח: 45 µL של 5 x PCR מאגר µL 12 MgCl2 (25 מ מ), 4 µL של dNTPs (מ מניות המכילה 10 מ מ של כל אחד), µL 10 של פריימר לפנים (המניות 10 מיקרומטר) hybridizing רצף וקטור (פריימר Ab-vec-סנס) , ו- µL 10 של פריימר הפוכה (המניות 10 מיקרומטר) פילוח האזור שרשרת כבד או קל מתמיד (ראו טבלה של חומרים פריימר רצפים). לפצות נפח סופי של 200 µL עם H2O. לאחר מכן להוסיף 4 µL של האנזים DNA פולימראז (U 5/µL).
      2. להפיץ 25 µL של התגובה premix למחזור PCR חשפנות-8 על קרח.
      3. השתמש קיסם סטרילי כדי להרים את מושבות בודדות. צובעות את קיסם השיניים על גבי צלחת אמפיצילין x TY 2 כדי להוות צלחת שכפל וטובל ואז לתוך צינור תגובת ה-PCR.
      4. לבצע ההקרנה PCR אופניים בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 25 מחזורים של 30 s ב 94 ° C, 30 s-55 ° C, ו-50 s ב- 72 מעלות צלזיוס.
      5. לזהות חיידקים חיוביים על-ידי העברת µL 5 המוצרים PCR ג'ל 1.5% agarose.
        הערה: תוצאות חיוביות המושבות לתת מוצר ה-PCR בסביבות 850 bp הווקטור שרשרת כבדה, 600 bp הווקטור שרשרת אור.
    3. לחסן ארבע המושבות חיובי מהצלחת שכפל לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
    4. תמצית פלסמידים מתרבויות נוזלי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד, כמצוין על-ידי היצרן.
    5. ודא הכניסה הנכון של תחומים משתנה על ידי סנגר רצף של פלסמידים עם מן המפתח Ab-vec-סנס.
      הערה: פלסמידים עם תותב הנכון (קידוד ל- HC ו- LC התואם את) הן להיות cotransfected לתוך תאים 293A על הפרשה. ייחודה של mAbs המיוצר בקנה מידה קטן לבדיקה על ידי אליסה. לאחר מכן, ייצור בקנה מידה גדול מתבצע אם ישים.

6. ייצור של mAbs

  1. ייצור בקנה מידה קטן לבדיקת ירידה לפרטים
    1. שלשום תרביות תאים, זרע 15,000 כליות עובריים אנושיים 293A (HEK 293A) תאי 200 µL של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לכל טוב ב 96-ובכן צלחות. דגירה בין לילה בחממה2 CO (5% CO2) ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. Cotransfect 293A תאים DMEM בינוני המכיל 10% FBS באמצעות נגזרת polyethylenimine ליניארית כמו ריאגנט תרביות תאים.
      הערה: לבצע תרביות של תאים triplicates. להלן כללי התנהגות הוא אחד טוב של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח.
      1. לדלל 0.5 µL של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 10 מ מ 150 NaCl. לדלל 0.125 µg של vH ו 0.125 µg של וקטורים לביטוי vL לתוך µL 10 מ מ 150 NaCl. מערבולת כל דילול 10 s.
      2. להוסיף 10 µL מדולל DNA תרביות תאים ריאגנט הפתרון DNA µL 10. מערבולת 15 s דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף את תערובת 20 µL drop-wise על תאים 293A ומערבבים על ידי מתערבל בעדינות את הצלחת.
    3. החלף את ה 16 בינוני לאחר תרביות תאים ותאים תרבות במשך 5 ימים ללא סרום בינוני.
      הערה: השתמש בינונית ללא סרום כדי להימנע סרום Igs שמזהם את הנוגדנים המיוצרים.
    4. לחסל תאים ופסולת על ידי צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    5. קציר supernatants על ידי השאיפה עם ערוץ מרובה פיפטה, להעביר אותם לתוך צלחת V-התחתון 96-ובכן.
    6. המעיל Ag רלוונטיים בין לילה ב 4 ° C ב- µL 100 לכל טוב של ציפוי אליסה/ELISPOT משוקם מאגר 1 x-ריכוז הסופי של µg/mL 2 ב 96-ובכן חומרי ניקוי. ראה דוגמאות ב 9.
    7. וולס בלוק 10% FBS DMEM בינונית עבור 2 h ב 37 ° C
    8. להוסיף 50 µL של supernatants של תאים transfected 293A מהשלב 6.1.5 ולאחר תקופת דגירה של 2 h-RT.
    9. להוסיף 100 µL של אנטי-אדם Ab אג מצומדת חזרת אנזים peroxidase (HRP) ב 1 µg/mL, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. הוסף µL 50 הדפסות כסף המצע (שוייץ) ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות.
    10. לקרוא את צפיפות אופטית-450 nm ב ספקטרופוטומטרים.
      הערה: mAbs ספציפית על ידי אליסה assay יכול להיות מיוצר עוד ב בקנה מידה גדול, מטוהרת על חלבונים עמודה בהצגת חיבה אנושית IgG.
  2. ייצור בקנה מידה גדול, טיהור של mAbs ספציפיים
    1. שלשום תרביות תאים, זרע 6 x 106 האדם מתחלקים כליות 293A (HEK 293A) תאים לתוך 175 ס' ' מ2 בקבוקונים המכילים 25 מ ל DMEM בתוספת 10% FBS. דגירה בין לילה בחממה2 CO (5% CO2) ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תאים צריך להיות 70% confluent כאשר transfected.
    2. Cotransfect 293A תאים DMEM בינוני המכיל 10% FBS באמצעות נגזרת polyethylenimine ליניארית כמו ריאגנט תרביות תאים.
      1. לדלל 50 µL של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 450 של 150 מ מ NaCl. לדלל 10 µg של vH ו 10 µg של וקטורים לביטוי vL לתוך µL 500 של 150 מ מ NaCl. מערבולת 10 s לכל דילול.
      2. להוסיף ריאגנט מדוללת של תרביות תאים DNA פתרון ה-DNA. מערבולת 15 s דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף את תערובת 1 מ"ל drop-wise לתאים ומערבבים על ידי מתערבל בעדינות את הבקבוק.
    3. החלף את ה 16 בינוני לאחר תרביות תאים ותאים תרבות במשך 5 ימים ללא סרום בינוני.
    4. קציר בינוני על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה 25-mL.
    5. לחסל תאים ופסולת על ידי צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    6. לטהר את הנוגדנים משתמש בעמודה 1 מ"ל מצופה עם חלבון א' במערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) חלבון מהיר ב 4 º C.
      1. Equilibrate החלבון עמודה sepharose עם 20 מ מ פוספט מאגר (pH 7).
      2. לסנן התרבות התא האמצעי 6.2.5 באמצעות מיקרומטר 1.22 מסנן ולאחר מכן מסנן 0.45 מיקרומטר.
      3. לטעון את המדיום המסונן אל העמודה.
      4. לשטוף עם מאגר פוספט 20 מ מ (pH 7), elute עם מאגר ציטראט 0.1 M (pH 3.5).
      5. לקרוא את צפיפות אופטית-280 ננומטר על ספקטרופוטומטרים הקליטה ומיד לנטרל המכילים חלבון שברים עם טריס מ' 1 מאגר (pH 9).
    7. Dialyze אלב מטוהרים בין לילה ב 4 ° C בקסטה עם משקל מולקולרי 3.5K הקיצוץ נגד המאגר PBS (pH 7.4).
    8. לחטא על ידי 0.2 µm סינון ובקרה טוהר על ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה, כפי שצוין על ידי היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החל מ- PBMC מתורמים מאוד בריאים, זה פרויקט המתנות הדור של האדם mAbs, אשר מזהה את פפטיד Pp65495 (Pp65, מן האדם cytomegalovirus) שהוצגו על-ידי המחלקה מורכבת histocompatibility הגדולות אני (MHC-אני) מולקולה (הלע - A * 0201 HLA-A2). MAbs אלה יכול להפלות בין מתחם, מתחמי המייצג אחרים פפטידים מועמסים על MHC אותו זה-אני מולקולה.

PBMC היו מוכתמים הלע-A2/Pp65-PE הלע-A2/Pp65-APC, הלע-A2/MelA2-BV421 tetramers כמפורט בפרוטוקול לעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצע היא שיטה חזקה לדור של mAbs האנושי ישירות מתאי B הספציפיים Ag במחזור הדם. היא משלבת שלושה היבטים חשובים: (i) שימוש tetramer-הקשורים מגנטי העשרה, המאפשרת בידוד שמחוץ תאי B Ag מחייב אפילו נדיר; (ii) אסטרטגיה המגביל המשתמשת שלושה Ag tetramers (שני רלבנטיות, אחד לא רלוונטי) מתויג עם שלושה fluorochromes שונים כדי לבודד, מאת cytometry זרימה, רק בתאי B ביטוי מסוים BCR עבור התובע הכללי הרצוי; (iii) מחדש של רקומביננטי התואם mAb cDNAs מאת RT-PCR-הסינגל התא רמת ביטוי cDNAs בתאים אנושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים המתקן Cytometry "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים גם כל הצוות של ייצור חלבון רקומביננטי (P2R) ושל ההשפעה פלטפורמות (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לתמיכה טכנית שלהם. אנו מודים עמנואל Scotet, ריצ'רד Breathnach להערות בונה על כתב היד. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הפרויקט IHU-צ'סטי במימון התכנית ממשלת צרפת «Investissements d'Avenir», מנוהל על ידי הצרפתי הלאומי מחקר סוכנות (ANR) (ANR-10-IBHU-005). פרויקט IHU-צ'סטי נתמך גם על ידי נאנט Métropole Région פיי דה לה לואר. עבודה זו מומש בהקשר של התוכנית LabEX IGO הנתמך על-ידי הסוכנות מחקר לאומי באמצעות ההשקעה של התוכנית בעתיד ANR-11-LABX-0016-01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאים HEK 293AThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life Technologies21969-035(+) 4,5 גרם/ליטר D-גלוקוז
0,11 גרם/ליטר נתרן פירובט
(-) L-גלוטמין
RPMI מדיום1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
אלבומין סרום בקר (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphate מי מלח חוצץ (10X) pH 7,4אמביוןAM9624
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית) 0,5M pH = 8Invitrogen by Life Technologies15575-020
סרום בקר עוברי (FBS)דומיניק דוטשרS1810-500
פיקול - הפרדת לימפוציטים בינוני EuroBioCMSMSL01-01צפיפות 1,0777+/-0,001
סטרפטווידין R-פיקואריתרין מצומדInvitrogen by Life TechnologiesS21388premiun כיתה 1 מ"ג/מ"ל מכיל 5 מ"מ נתרן אזיד
סטרפטווידין, אלופיקוציאנין מצומדInvitrogen על ידי thermoFisher scientificS323621mg/ml
2mM אזיד בדרגה פרימיום
סגול מבריק 421 סטרפטווידיןBiolegend405225conc: 0,5mg/ml
אנטי-PE מצומד מיקרו-חרוזים מגנטייםMiltenyi Biotec130-048-801
אנטי-APC מצומד מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs או QuadroMACS separotorMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD אופקBD Pharmingen / BD Biosciences563109דילול משומש 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788דילול משומש 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116דילול משומש 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440דילול משומש 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)דילול משומש 1:1000
FACS ARIA III סדרן תאים ציטומטרBD Biosciences
צינורות PCR 8 רצועותAxygen321-10-061
מתלים ל-96 מיקרו-צינורותDominique Dutscher45476
RNAseOUT מעכב ריבונוקלאז (רקומביננטי)Invitrogen על ידי thermoFisher מדעי10777-019כמות: 5000U (40U/ul)
מים מזוקקים Dnase/Rnase FreeGibco10977-035
Oligod (T) 18 mRNA פריימרNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
הקסמרים אקראייםInvitrogen by thermoFisher ScientificN8080127 כמות: 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen by thermoFisher scientific18080-044כמות: 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA פולימראזPromegaM7805
dNTP סט, כיתה ביולוגיה מולקולריתThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		סבב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - Prmers
קדימה 5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		סבב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - פריימרים הפוכים ל-Ig אנושי - הקרנת PCR של חיידקים
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		סבב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים חיצוניים - פריימרים הפוכים ל-Ig אנושי
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		סבב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAGAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGAGCGGTGACCAG		סבב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים הפוכים
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGGACCATTG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים הפוכים
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGAGACGGTGACCGTG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות כבדות - פריימרים פנימיים - פריימרים הפוכים
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTCTG		סבב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים חיצוניים - פריימרים הפוכים- הקרנת PCR של חיידקים
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות אור k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGGACCAGTCT		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGATGACCCAGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות k - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - קדימה פריימרים
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות λ - פריימרים חיצוניים - פריימרים קדימה
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		סיבוב ראשון של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים חיצוניים - קדימה פריימרים
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		סיבוב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים - פריימרים קדימה
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		סבב שני של PCR - הגברה של שרשראות קלות ולמבדה; - פריימרים פנימיים -פריימרים הפוכים - בדיקת PCR חיידקים
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		חיידקים בדיקת PCR
QA Agarose-TM, ביולוגיה מולקולרית כיתהMP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
אנזים גיל I HFניו אינגלנד BiolabsR3552L20000U/ml
אנזים SalI HFניו אינגלנד BiolabsR3138L20000U / ml
אנזים Xho Iניו אינגלנד BiolabsR0146L20000U / ml
אנזים BSIWIניו אינגלנד BiolabsR0553L10000U / ml
HCg1 (מספר כניסה של Genbank FJ475055)
LCk (מספר כניסה של Genbank FJ475056 )
LCl (הצטרפות Genbank מספר FJ517647)
T4 DNA ligaseInvitrogen by thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT בינוניסיגמא אולדריץ'Y1003-500ML
אמפיציליןסיגמא אולדריץ'10835242001
LB (Luria Bertani) מרק (לנוקס)סיגמא אולדריץ'L3022-250G
נוקלאוספין פלסמיד DNA, RNA ו טיהור חלבוןMacherey Nagel740588.250
מגיב טרנספקציה DNA של Jet PEIPolyPlus101-40
צלחת תחתית שטוחה 96 בארותFalcon353072
צלחת V-bottom 96 בארותNunc/Thermofisher055142
Nunc קל 175 ס"מ צלוחיותNunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT מאגר ציפויeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp תחתית שטוחה 96 באר צלחות ELISANunc/Thermofisher44-2404-21קשירת חלבון גבוהה
IgG Ab אנטי אנושי מצומד לחזרת פרוקסידאז (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
מצע TMBBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 מ"ל-חלבון HiTrap A עמודת HPGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
Superdex 200 10/300 GL עמודהGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus מערכת כרומטוגרפיהBioRad7880003

מקורות

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

תגיות

תאי מונונוקלאריים מדם פריפריRT-PCR של תא בודדמיון באמצעות ציטומטריה של זרימהטטראמרים של HLA-A2/Pp65הפרדה באמצעות מיקרו-חרוזיים מגנטייםמבחן ELISAתהודה של פלזמון פניהגברה של גן אימונוגלובולין
דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.