יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה אנזים המדידה לנקודת מבחן תגובתיות המלווה תרופתי פאברי, מחלת הפומפה
במאמר זה
סיכום
תקציר
השימוש של רפואה אישית לטיפול במחלות monogenic נדירים כמו הפרעות באנזימים (LSDs) קוראים תיגר על ידי מורכבים עיצובים הניסיון הקליני, עלויות גבוהות ומספרים המטופל נמוך מאות אללים mutant הם מעורבים ברוב LSDs. המחלות מסווגים בדרך כלל 2-3 סוגים קליניים שונים בהתאם לחומרת. יתר על כן, אפיון מולקולרי גנוטיפ יכול לעזור לחזות את התוצאות הקליניות ולהודיע בחולה. לכן, פיתחנו assay התרבות של תאים פשוטים המבוסס על תאים HEK293H heterologously ביטוי יתר של מוטציות. שזוהו מחלת פברי, פומפה. לאחרונה כבר הציג assay דומה כמבחן פרה כדי לזהות מוטציות קלה עבור טיפול המלווה תרופתי (PCT) מחלת פברי. כתב יד זה מתאר assay תרבות של התא המתוקן אשר מאפשר הערכה פנוטיפי מהירה של גרסאות allelic מחלת פברי, פומפה לזהות חולים זכאי עבור PCT, עשויים לסייע בפיתוח של pharmacochaperones רומן.
מבוא
ישנם מעל תריסר באנזימים הפרעות (LSDs) הקשורים בתפקוד glycosidase בעקבות מוטציות העיקרי. פברי (OMIM #301500), מחלת הפומפה (OMIM #232300), יותר מ 500 ו 200 מוטציות missense1,2,3 דווחו, בהתאמה, אשר תואמת כ- 60% של הרוזן מוטציה הכולל. אינספור גרסאות חדשות של ג'ין עדיין להיות מזוהים, שרבים מהם יש נודע משמעות. מחקרים מקיפים הביוכימי חשף כי מסוימים אחרים ואינן להוביל להשלים אובדן-של-פונקציה של הגן GLA (OMIM * 300644) במחלת פברי, אבל לגרום האנזים המתאימים להיכשל להגיע למצב מתקפלים למה המועדף4 . התוצאה שמירה ER והשפלה מוקדמת של האנזים תפקודית אחרת. מסקנות דומות נמשכו ב אחרים LSDs כולל מחלת פומפה5. יתר על כן, אפיון מולקולרי של גרסאות יכול להקל על פרשנות קליני של מוטציות בזמנו של אבחון6, רומז התקדמות LSD הוא תהליך אישי המבוסס על טיב המוטציה. לכן, הסיווג המקובלת בדרך כלל 2-3 סוגים שונים קליני צריך להיות מחדש על מנת לייעל קליניים ייעוץ והחלטות טיפוליות.
טיפול בתחליפי האנזים (ERT) זמין עבור שתי המחלות. ERT, עם זאת, מוגבל יעילות המושפעת רקמות איברים כגון המוח ואת שרירי השלד. יתר על כן, ERT יכול להפיק תשובה immunogenic זה מסכנת את היתרונות הטיפוליים. מלווים תרופתי (אישיים) הם חלופה אטרקטיבית הטיפול בחולים עם מוטציות מגיבים כביכול. מחשבים משמשים לפיגום מולקולרית עבור קיפול חלבונים נכונה וייצוב המונע בתורו (ER) רשתית תוך-פלזמית השמירה והשפלה הקשורים במיון של האנזים. יתר על כן, מחשבים שניתן אוראלית, שעשוי להיות מסוגלים לחצות את מחסום הדם מוח. לכן, ייתכן PCT אפשרות מעשית יותר לטיפול בחולים עם מסוימים אחרים. עבור סקירה מקיפה על יישום מחשב ב- LSDs, להפנות הסקירה מצוינת על-ידי Parenti7.
הגילוי של מחלה הגורמת אללים mutant מאות אתגרים בדיקות סמים ניסויים פרה-קליניים, מחייבת הערכה פשוטה, מהירה, מתוקננת מאוד מהחולים קלה לגישה רפואה אישית. כדי להעריך את השפעות מזיקות של LSD מוטציות גנטיות, לבחון את המועמד מוטציות לחזות חולים קלה עבור PCT, הייתה מערכת סטנדרטית מאוד ביטוי יתר בתאים HEK293H המאפשרת למדידה פעילות האנזים מהירה ואמינה פיתח. ביטוי יתר מערכות דומות שתוארו קודם לכן עבור מחלת פברי, פומפה באמצעות COS-78,9,10,11, הלה תאים12, או HEK29313 ,14,15,16 תאים עבור הגן glycosidase.
שיטה דומה מאוד אפילו פטנט כשיטה"לחזות את התגובה לטיפול תרופתי מלווה במחלות"17 המציין את הרלוונטיות של תא תרבות בעלת יכולת להיות משולב לתוך הקלינית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מבנים pcDNA3.1/GLA ו- pcDNA3.1/גה מוטציה
הערה: אסטרטגיות שיבוט GLA ו גה קידוד רצפים (תקליטורים) כבר דווח על15,מוקדמת יותר18.
- מוטגנזה באמצעות מוטגנזה
- שימוש ההפניה רצף NM_000169.2 ו- NM_000152.4 כתבניות עבור מוטגנזה מכוונת של גנים gla בה , גה , בהתאמה. יש קבוצה של טוהר גבוהה מלח חינם תחל (25-37-מרס) מסונתז על ידי ספק מסחרי, עם תחל antisense והיגיון זה של השינויים רצף בהתאמה המרכזי שלהם אורך להציג בנפרד את המוטציה. השתמש בכלי העיצוב תחל חינם לתמיכה של עיצוב פריימר19.
- תערובת התגובה, לשימוש של תנאים סטנדרטיים של הפתרון התגובה ותנאים PCR המסופקים על ידי היצרן.
- מיקס 5 µL של 10 x תגובת מאגר, 10 ng של פלסמיד תבנית זוגית גדילי ה-DNA (pcDNA3.1/GLA או pcDNA3.1/גה), 125 ng של כל פריימר, µL 1 של תערובת dNTP שסופקו, 3 µL של דימתיל סולפוקסיד ריאגנט של אמצעי אחסון המתאים של מים יונים (התגובה האחרונה נפח : 50 ΜL). לבסוף, מוסיפים 2.5 U של DNA פולימראז ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כמו פקד שלילי, נושא לאורך מדגם לא-פריימר.
- להתחיל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: שלב 1: 95 ° C עבור 1 דקות, שלב 2: 95 ° C 50 s, שלב 3: 60 ° C 50 s, צעד 4: 68 ° C למשך 8 דקות, חזור על שלב 2-4 פעמים 18 ו צעד 5: 68 ° C למשך 10 דקות.
- בעקבות PCR, להוסיף 1 µL של Dpnאני אנזים הגבלה (10 U µL) נוסף דגירה המבחנה התגובה ב 37 ° C עבור 1 h.
- שינוי, הקרנה של השיבוט הרצוי
- שינוי צורה של aliquot של תאים ultracompetent בהתאם להמלצות היצרן. שימוש SOC בינוני (טריפטון 2% (w/v), שמרים לחלץ 0.5% (w/v), NaCl 10 מ מ, אשלגן כלורי 2.5 ממ, לעקר ב 121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף סטרילי-מסוננים פתרונות של MgCl2 ו גלוקוז עד ריכוזים הסופי של 10 עד 20 מ מ, בהתאמה) במקום של היצרן בינוני. לאחר הניתוח, צלחת 250 µL של מוטגנזה מכוונת הדגימה על ליברות צלחת המכיל אמפיצילין µg/mL 100, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 h.
- להבטיח שהמספר של transformants הוא > 10 והתגובה התשואות לפחות שלושה מושבות כמו התגובה לא-פריימר שליטה, למשל, באמצעות צלחת זוהר כדי להקל על המושבה לספור. לאחר מכן לבחור 3 מושבות, להכין 3 מ"ל תרבויות לילה LB ציר בינוני.
- למחרת, לבצע הכנה פלסמיד עם ערכת סטנדרטי ולנתח כל רצף באמצעות T7 (5ʹ-TAA טק GAC TCA CTA תג GG-3ʹ) ו BGHr (5ʹ-תג AAG GCA חטיבתי TCG AGG-3ʹ) תחל באמצעות תקן סנגר רצף.
- להשתמש בכלי מתאים ביולוגיה מולקולרית כדי לנתח את הרצף. כאשר מזוהה המוטציה הרצוי ולא עוד רצף חריג בהשוואה NM_000169.2 (α-galactosidase א) או NM_000152.4 (חומצה α-glucosidase) נתפסת, בחר השיבוט לטיהור פלסמיד תרביות תאים-כיתה.
- לקבוע את הטוהר של ה-DNA על ידי מדידה של ספיגת בספקטרופוטומטר.
הערה: לאפשר רק ההכנות המניבים טוהר פלסמיד עם 260/280 ספיגת יחס של > 1.8 עבור תא תרבות ניסויים.
2. טיפוח של תאים HEK293H
- לשמור על תאים HEK293H של גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) Dulbecco´s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להשאיר את התאים water-jacket החממה ב 37 ° C תחת אווירה2 CO 5%.
- לטפח את התאים כדי צפיפות של 80-90%.
- האחות המדיום ולשטוף לאחר שימוש פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 + ו- Mg2 +.
- המעבר על-ידי הוספת 0.05% טריפסין-EDTA דגירה למשך 5 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
- פצל של תאים 1:15 בינוני טריים, זרע בקבוקון T75 חדש כדי לשמור על תרבות קבוע. אל תשתמש תאים עם מעברים יותר מ 25.
3. pcDNA3.1/GLA, pcDNA3.1/גה פלסמיד תרביות תאים, טיפול של HEK293H
- 24 שעןת לפני תרביות תאים, לשטוף את התאים HEK293H בבקבוקון תרבות תא T75 פעם אחת עם PBS עם Ca2 +, Mg2 +. לקצור את התאים עם 0.05% טריפסין-EDTA כפי שנקבע לעיל, בתאי זרע 1.5 x 10-5 החללים של צלחת 24 תרבות היטב באמצעות 500 בינוני DMEM של µL, בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה.
- לבצע את פרוטוקול תרביות תאים על פי הוראות היצרן. בדרך כלל, להשתמש תערובת של 1 µg של ה-DNA פלסמיד µL 2.5 של תרביות תאים ריאגנט µL 100 של DMEM ללא סרום. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ומוסיפים התאים בצורה drop-wise לאחר מכן.
- להסיר את המדיום המכיל הכימית תרביות תאים לאחר פרק זמן של 4 שעות-37 °C/5% CO2 ולהוסיף 500 µL של DMEM טריים עם 10% FBS / 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
הערה: במהלך שלב זה, 1-Deoxygalactonojirimycin הידרוכלוריד (DGJ) או 1-Deoxynojirimycin הידרוכלוריד (DNJ) עשוי להתווסף המדיום תרבות במקום המיועד (משתמשים בפתרון מניות מימית 10 מ מ על מנת לקבל ריכוז סופי של 20 מיקרומטר DGJ ו- DNJ ). טרי DGJ או DNJ נוסף 42 h לאחר פלסמיד תקנים.
4. תא קציר וα-galactosidase A או α חומצה-glucosidase פעילות מדידה
- תא קציר
- ביום תחילת הקציר, להסיר התאים החממה, תשאף המדיום. לשטוף היטב התאים פי 2 עם PBS עם Ca2 + ו- Mg2 +.
הערה: השלב זה קריטי מכיוון DGJ ו- DNJ הן מעכבי חזק של α-galactosidase וα-glucosidase, בהתאמה לכל שארית יכול לפסול את המבחן. - להוסיף 200 µL של מים יונים ישירות על גבי התאים. לשטוף את התאים מהצלחת ומעבירים אותם אל צינור התגובה 1.5 mL.
- ביום תחילת הקציר, להסיר התאים החממה, תשאף המדיום. לשטוף היטב התאים פי 2 עם PBS עם Ca2 + ו- Mg2 +.
- המגון על ידי הקפאה והפשרה
- לשים את הדגימות קצף המתאימה לארון תקשורת מערבולת עבור 5 s כדי לייעל את פירוק. לשים את הדגימות לסירוגין בחנקן נוזלי 10 s ו בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר עד הפשרתו היה מלא (5 דקות).
- חזור על הליך זה 5 פעמים, ואז לסובב את הדגימות למשך 5 דקות ב 10,000 x g.
- להתכונן צינור טריים כל מדגם המכיל 40 µL של יונים H2O ולהוסיף 10 µL מדגם. לערבב פתרון על ידי vortexing בקצרה ולהעביר 10 µL לתוך החור של צלחת טוב 96 (כל מדגם דולר). למהול 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) פתרון מניות יונים H2O כדלקמן כדי לקבל עיקול רגיל: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- להתחיל את התגובה על-ידי הוספת µL 200 של BCA ריאגנט (ריאגנט A ו- B ריאגנט מעורב ביחס 50:1) ואת תקופת דגירה של h 1 בחושך ב 37 ° C תחת עצבנות קלה על שייקר מסלולית (300 סל ד). למדוד את ספיגת-560 nm, קורא את הצלחת.
הערה: הדגימות מכילים בדרך כלל בין 1 ל- 1.5 µg חלבון ליום µL.
- לדלל סכום מחושב של כל מדגם pipet לתוך צינורות התגובה mL 1.5 טריים להשיג 0.05 (עבור α-galactosidase א) או 0.5 (עבור α-glucosidase חומצה) פתרונות חלבון/µL µg. מערבולת הדגימות עבור s שוב 5 ו pipet 10 µL של דילול זה לתוך 96-ובכן צלחת (כל דגימה של כפילויות).
- להתחיל את התגובה על-ידי הוספת 20 µL של הפתרון המצע המתאים:
עבור α-galactosidase ת 2 מ מ 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-גל) במאגר מ' 0.06 פוספט ציטראט, pH 4.7.
עבור α חומצה-glucosidase: 2 מ מ 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) ב 0.025 M סודיום אצטט, pH 4.0. - דגירה התגובות אנזים עבור h 1 בחושך ב 37 ° C תחת עצבנות קלה על שייקר מסלולית (300 סל ד). לסיים את התגובה על ידי התוספת של 200 µL של 1.0 M, pH 10.5 מנוכי עונתיות גליצין-NaOH מאגר.
- הכן עיקול רגיל של 4-methylumbelliferone (4-MU) מ- 0.01 מ"ג/מ"ל מניה כדלקמן:
100 µL H2O / לא 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; H2O / 4 100 µL-MU, pipet 10 µL של כל דילול לתוך הבאר 96 צלחת (שבו כפילויות) ולהוסיף 200 µL של המאגר גליצין-NaOH 1.0 M בכל טוב כדי לכוונן את עוצמת הקול ו- pH. - מדד הפעילות אנזים קורא פלורסצנטיות מצויד במסנן המתאים להגדיר ולנתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה עבור ההתקן הקורא זריחה.
הערה: שני מצעים 4-ספל מופחתים על 4-MU במהלך חשיפה α-galactosidase A או α-glucosidase חומצה. 4 המשוחררים-MU הוא fluorochrome, אשר ניתן למדוד-360 ו 465 nm כמו עירור, פליטה אורכי הגל, בהתאמה, שימוש בקורא זריחה microplate.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההליך מוטגנזה מכוונת
כדי להעריך את היעילות של GLA ג'ין מוטגנזה מכוונת, מוטציות סווגו לאחת הקטגוריות הבאות. גישה זו ליצירת מוטציות חשף את זה כ- 66.5% מוטציות GLA התקבלו בניסיון הראשון. 25% נוספים יכולה להיות מושגת לאחר ה-PCR השני שונה במקצת.
קטגוריה 1: מוטגנזה מכוונת ה-PCR היה יעיל בהניסיון הראשון.
קטגוריה 2: הראשון מוטגנזה מכוונת P...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק תוצאות חזקים להערכת הנזק האנזים במחלות lysosomal תורשתי של חילוף החומרים. כתב יד זה הוא שתיקון בפרוטוקול שפורסם מוקדם יותר15. השינויים המכריעים לערב לכתחילה (קרי, בתהליך הכנת הבונה וקטור מוטציה), סטנדרטיזציה של פרוטוקול התרבות התא (קרי, תחזוקה תא HEK293H ותנאי תרביות תאים), הגבוה מספר חזרות ניסיוני (לפחות 5), שתרמו מאוד הפארמצבטית של התוצאות. בסך הכל שני גנים יעד נגיש עבור מוטגנזה מכוונת, ריבוי של מוטציות באפשרותך להרכיב במקביל. יחס אות/רעש גבוה יחס...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
המחברים רוצה להכיר Loebert מנדי, טינה Czajka לתמיכה טכנית מצוינת. אנו מודים פלורה לואו (הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה ב) על שפת עריכה עזרה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| QuikChange II XL ערכת מוטגנזה מכוונת אתר | סטרטגן, לה ג'ולה, קליפורניה, ארה"ב | #200522 | |
| פריימר GLA [R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GLA [A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Opron, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Opéron, אברסברג, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Opron, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, אברסברג, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Opéron, אברסברג, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Opron, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Opéron, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Opron, Ebersberg, גרמניה | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon , Ebersberg, גרמניה | n.a.Tryptone | |
| Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | 8952.1 | ||
| Yeast Extract | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,083,422,500 | |
| נתרן הידרוקסיד | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | 3908.2 | |
| חומצת לימון | Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | X863.3 | |
| דיסודיום מימן פוספט | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,065,860,500 | |
| נתרן אצטט | Merck , דרמשטאדט, גרמניה | 1,062,640,050 | |
| חומצה אצטית קרחונית | Sigma Aldrich , מינכן, גרמניה | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | X969.2 | |
| LB בינוני | Carl Roth , קרלסרוה, גרמניה | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, פרייבורג, גרמניה | D4020 | |
| QIAfilter פלסמיד Midi Kit | Qiagen, הילדן, גרמניה | 12245 | |
| HEK293H קו תאים | Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה | 11631-017 | |
| דולבקו וחריף; s Modified Eagle Medium | Invitrogen, קרלסרוה, גרמניה | 31966-047 | |
| סרום בקר עוברי HyClone | GE Healthcare, דרום לוגן, יוטה, ארה"ב | SV30160.03 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Invitrogen, קרלסרוהה, גרמניה | 15140-122 | |
| צלוחיות תרבית תאים סטנדרטיות של CELLSTAR, Greiner Bio One | VWR International GmbH, הנובר, גרמניה | 82050-854 | |
| צלחות תרבית תאים (24 באר) | Sarstedt, Nü mbrecht, גרמניה | 831,836 | |
| Cellstar 96 באר צלחת | Greiner bio one, Frickenhausen, גרמניה | 655185 | |
| צינורות תגובה SafeSeal, 1,5 מ"ל | Sarstedt, Nü mbrecht , גרמניה | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen , קרלסרוה, גרמניה | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, מינכן, גרמניה | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, טורונטו, קנדה | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, מינכן, גרמניה | D9305 | |
| PBS Dulbecco ללא סידן, ללא מגנזיום | ביוכרום, ברלין, גרמניה | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום | Thermo Scientific, בראונשווייג, גרמניה | 25300054 | |
| ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA | Thermo Scientific, בראונשווייג, גרמניה | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, מינכן, גרמניה | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, מינכן, גרמניה | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, מינכן, גרמניה | M9766 | |
| שם | חברה | מספר קטלוגי | Comments |
| >Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, גרמניה | n.a.Luminous | |
| Plate Gr. 2 E | Carl Roth, קרלסרוהה, גרמניה | P265.1 | |
| 3130 xl מנתח גנטי | אפלייד ביוסיסטמס, דרמשטדט, גרמניה | n.a.GFL-3032 | |
| שייקר חיידקים | GFL, בורגוודל, גרמניה | n.a.Avanti | |
| J-25 צנטריפוגה | בקמן/קולטר, קרפלד, גרמניה | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro ספקטרופוטומטר | אמרשם ביוסיינסס, בקינגהאמשייר, בריטניה | n.a.חממת | |
| מעיל מים | קלסר, טוטלינגן, גרמניה | n.a.Vortex | |
| Genie 1 מגע מערבל | תעשיות מדעיות, בוהמיה, ניו יורק, ארה"ב | n.a.Z | |
| 233 MK-2 צנטריפוגה מיקרו-צינורית מקוררת | הרמל, טוטלינגן, גרמניה | n.a.LaboStar | |
| מכשיר מים אולטרה-טהורים | סימנס, ברלין, גרמניה | n.a.Thermo | |
| Shaker PST-60HL-4 שייקר אורביטלי | Biosan, ריגה, לטביה | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, שוויץ | n.a.HI | |
| 223 מד pH מיקרו-מעבד | HANNA Instruments, Arvore, פורטוגל | n.a.CASY | |
| br/> מונה תאים + מערכת אנלייזר דגם TT | Innovatis AG, Cham/Zug, שוויץ | ||
| חברה | מספר קטלוגי | תגובות | |
| Software | |||
| Magellan תוכנת ניתוח נתונים v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, שוויץ | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; ארה"ב | n.a.Microsoft | |
| Office 2010 | Microsoft Corporation, רדמונד, וושינגטון, ארה"ב | n.a.BioEdit | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| קיצורים | |||
| frw = קדימה; rev = הפוך | |||
| n.a. = לא ישים |
מקורות
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331(2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092(2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632(2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
