מאמר שיטה

ניתוח התקשורת בין ומונוציטים ו תאים סרטניים בשד ראשי במטריצה חוץ-תאית לחלץ (ECME)-מבוסס מערכת תלת מימדי

DOI:

10.3791/56589

⸱

8 בינואר 2018

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה תלת מימדי התרבות לנתח המורפולוגיה של ראשי תאים סרטניים בשד, כמו גם כדי לחקור את יחסי הגומלין ישירים ועקיפים ומונוציטים לבין התוצאות כגון קולגן השפלה, גיוס תאים חיסוניים, תא הפלישה, קידום של דלקת הקשורים לסרטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטבע על מטריצה חוץ-תאית (ECM), תאים אפיתל רגיל ואמצעים בצורה אינטימית לתקשר עם תאים hematopoietic ו- hematopoietic, ובכך מאוד המשפיעים על התוצאה הומאוסטזיס ומחלות הרקמות. סרטן השד, הקשורים מקרופאגים (תאמי) משחק תפקיד קריטי התקדמות המחלה, גרורות, הישנות; לכן, הבנת המנגנונים של מונוציט chemoattraction כדי microenvironment את הגידול ואת האינטראקציות שלהם עם תאים סרטניים חשוב לשלוט במחלה. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של מערכת תלת מימדי (3D) תרבות משותפת של תאים סרטניים (BrC) בשד האנושי ומונוציטים אנושי. BrC התאים המיוצרים הבזליים רמות גבוהות של הפעלת מוסדר, T-cell נורמלי הביע והוא מופרש (RANTES), מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1), ופקטור המושבה-מגרה גרנולוציט-מקרופאג (G-CSF), בעוד תרבות משותפת עם ומונוציטים, בטא אינטרלויקין (IL)-1 ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1β) ו- IL-8 היו מועשר יחד עם מטריקס metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2 ו- MMP-10. Microenvironment משתית את הגידול קידם התנגדות anoikis MCF-10A מבנים דמויי acini 3D, chemoattraction של monocytes ופלישה של תאים BrC אגרסיבי. הפרוטוקולים המובאת כאן חלופה נוספת במחיר נוח ללמוד תקשורת אינטרה-הגידול, הן דוגמה הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור תכונות ספציפיות של הגידול הביולוגיה הקשורים הגידול התוקפנות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגידול ביולוגיה היא הרבה יותר מסובכים ממה שסברו קודם לכן. הרכבה ראיות מראה כי תאים סרטניים הם יותר מאשר גרידא בתפזורת של תאים מתרבים לא מבוקרת; במקום זאת, נראה תאים אמצעים שונים כדי לבצע פונקציות שונות הצגת הארגון גבוהה וההיררכיה בתוך הגידול1. תאים סרטניים נמצאים גם תקשורת אינטימית עם תאים שאינם טרנספורמציה: מקרופאגים, fibroblasts, לימפוציטים, adipocytes, תאי אנדותל, בין שאר התאים כולם שקועים חלבונים לגרדום, פוליסכרידים המהווים את ECM. אינטראקציות ישיר ועקיף רבים נוצרים בין תאים טרנספורמציה והפך הלא ועם ה-ECM, אשר משפיעה על המחלה תסריט2,3. בחוזקה. במקרה הספציפי של BrC, זה חשוב במיוחד לנתח את התקשורת של תאים BrC עם תאמי, בהתחשב בעובדה כי תאמי נמצאו לשחק תפקיד קריטי באבולוציה של הגידול, הגדלת הסיכון של גרורות, של הישנות המחלה4 ,5.

כדי לנתח אינטראקציות אינטרה-tumoral ותוצאות אפשריות שלהם, גישות חדשות 3D במבחנה פותחו בהתבסס על השימוש של תמציות ECM המספקים microenvironment הרבה יותר מורכב, יותר קרוב למציאות של הגידול ביולוגיה, לעומת תרביות תאים חד שכבתי קונבנציונלי שבו התאים גדלים קשור פלסטיק. פיטרסון, Bissell6 מסופקים הדגם הראשון של nonmalignant, ממאירים בתאי אפיתל החלב תרבותי על קרום המרתף laminin עשיר והיו הראשונים לתאר את המבנים 3D organotypic כי להפלות אדם nonmalignant תאים אפיתל בשד מהקבצים המקבילים ממאיר. עשור לאחר מכן, המודל שפותח על ידי Debnath, Muthuswamy, וסיפק Brugge-7,-8,-9 כלי חשוב להבהיר המסלולים ביולוגי נחשף במהלך שינוי ממאיר של הבלוטות acini, כזה כמו היווצרות acini גדולים עקב התפשטות בלתי מבוקרת, delocalization של חלבונים צומת חזק כמו עדות קיטוב תא לקוי וירידה acini לומן בשל התנגדות תא anoikis, סוג של מוות תאים מתוכנת המתרחשת ב anchorage תלוית תאים כאשר הם להתנתק מהתכונה ECM שמסביב. הדגמים של Sameni, Jedeszko, סלואן התמקדו פעילות הפרוטאוליטי הדמיה על ידי תאים, אשר קשורה קשר הדוק invasiveness, עוד תכונה קריטית של גידול ממאיר10,11,12. מודלים אלה מסתמכים על מטריצות חלבון מעורבב עם חלבונים שונים מתרצה-קרינה פלואורסצנטית מצעים (DQ-ג'לטין, DQ-קולגן, DQ-קולגן הרביעי), באותות פלואורסצנט אשר מעידים על השפלה הפרוטאוליטי של קולגן. דגמי תלת-ממד משמשים גם ללמוד מאפייני תא גזע של שניהם טרנספורמציה ו תאים סרטניים, אשר תא אגרגטים, הנקרא גם spheroids, יכול להיות בתרבית ההשעיה או בחלבונים ECM כמו חוקר על מנגנונים תאית התמיינות, א-סימטרי חלוקת התא, הדבקות לתא ו תא תנועתיות13,14. הפלישה מבחני לאפשר בדיקה של התוקפנות מהותי של הגידול וזיהוי של מולקולות זה לשמש chemoattractants במהלך תהליך פולשני ה-15. באופן כללי, תלת-ממד מודלים מייצגים של גיוון סבירים במבחנה תרבית תאים המשקפים באופן הדוק יותר רקמה נורמלית ולא oncogenic מורפוגנזה.

עיצבנו מערכת תרבות משותפת תא 3D המבוססת על מודלים הנ ל7,10,11, באמצעות שני האדם מסחרי BrC שורות תאים של פוטנציאל תוקפני ידוע (סוגי luminal, טריפל-שלילי), ראשי תאים explanted מחולים BrC. לראשונה פיתחנו מודל איפה כוחניות (MCF-7) או תאים (מד א-MB-231) BrC אגרסיבי היו בתרבית במשותף עם U937 ומונוציטים ב תמצית מטריצה חוץ-תאית (ECME)-מערכת תלת-ממד שמותר באינטראקציה ישירה תאים תאים מבוססת. תרבויות שיתוף אלה שימשו כדי לקבוע כיצד התקשורת בין שושלות תא שני אלה השפיעו על שעתוק של קבוצת גנים הקשורים לסרטן התנהגות תוקפנית. עלייה משמעותית של cyclooxygenase-2 (COX-2) תעתיק נצפתה כי בד בבד עם ייצור מוגבר של אחד המוצרים שלה, פרוסטגלנדין E2 (PGE2), ממצא זה הדגיש את תפקידה של דלקת התקדמות סרטן. שעתוק מוגברת של MMP נצפתה גם זה בקורלציה עם proteolysis קולגן רבתי כאשר תאים מד א-MB-231 אגרסיבי היו תרבותי משותף עם U937 ומונוציטים בתרבויות המכילות קולגן DQ הרביעי. ראוי לציין, תרבויות המשנה שלנו לא תמכו ההנחה כי מנגנוני אינטראקציה עם תא-תא יש צורך קולגן השפלה. זה די הציע כי התקשורת בין שושלות תא שני היה מתווך על ידי מולקולות המופרש. יתר על כן, supernatants שנקטפו מבחני תרבות שיתוף אלה הכילו גורמים מסיסים מאורגן acini הבלוטות הנוצרת על-ידי שאינם הפך MCF-10A תאים13. נמצא כי אגרסיבי, תאים BrC הראשי מופרש רמות גבוהות של מונוציט chemotactic מולקולות MCP-1, GM-CSF ולאחר RANTES. לפיכך, אנו המתוארים תרבות 3D שבו תאים הופרדו תא מוסיף תרבות כדי למנוע תא-תא אינטראקציות. תרבויות אלה שימשו כדי לטפל התקשורת עקיף בין תאים BrC ומונוציטים. אלה מבחני, כוחניות ותוקפנית מסחרי BrC שורות תאים, התאים BrC הראשי של שלושה סוגים שונים של האדם ומונוציטים: U937 מסחרי ותאי THP-1, ומונוציטים הראשי (PMs) מבודד מהדם ההיקפי של תורמים בריא (כל ומונוציטים שימשו במצב שלא הופעל) שימשו. ריכוז מוגבר של ציטוקינים דלקתיים IL-1β ו- IL-8 נצפו כדי להעשיר בתרבות משותף. בדומה לכך, נמצא כי MMP-1, MMP-2 ו- MMP-10 היו גם גדל ב BrC תאים-מונוציט תרבויות המשנה, ובכך חיזוק הממצאים הקודמים14. כתב יד זה, זרימת עבודה-מדוקדק של ראשי בידוד תאים BrC ובדיקה בתרבויות 3D מוצגת יחד עם נציג תוצאות. עבודה זו מהווה דוגמה טובה של הפוטנציאל הגדול המספקים במבחנה תא 3D מערכות לחקור היבטים ספציפיים של הגידול הביולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות מחולים BrC התקבלו מהבנק רקמות של Unidad de Investigación en Virología y גרועה, החולים הקניות de México פדריקו גומז. מחקר זה אושרה על ידי מדעי, אתיות, biosecurity לסקור לוחות של גומז פדריקו החולים הקניות de México: Comité דה Investigación, Comité de Ética en Investigación, Comité דה Bioseguridad. כל המטופלים פרוספקטיבי נרשמו, הודיעו על מהות המחקר: אלו המוכנים להשתתף חתמה על הסכמה בכתב לפני דוגמה אוסף וטופלו על פי הנחיות אתית הטוב הקלינית של המוסד. הזהות של המשתתפים היה תשוחררנה לתקופת המחקר. הממתינים הנכללים אובחנו עם קרצינומה ductal פולשני, היסטולוגית כיתה 2, קליני שלב II, עם אין טיפול neoadjuvant הקודם לפני כריתה של רקמה. המטופלים היו בגילאי כולן נקבות בממוצע 56.8 בת (טווח 42 75)14.

1. תרביות תאים תלת-ממד

  1. זרע 0.1 x 106 MCF-10A תאים או תאים BrC הראשי ב 25 ס מ2 מבחנות תרבות DMEM/F12 תרבות בינונית בתוספת 5% סוס סרום, פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין, טוקסין הכולרה 100 ננוגרם למ"ל, 0.5 µg/mL הידרוקורטיזון, 10 µg/mL אינסולין, 20 ng/mL של גורם גדילה עוריות (EGF). זרע 0.1 x 106 תאים BrC מסחרי, MCF-7 תאים ותאים מד א-MB-231 75 ס מ2 תרבות מבחנות עם DMEM/F12 תרבות בינוני בתוספת 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  2. לאחר 48 שעות, יש לשטוף את טפט תא עם 10 מ"ל של עקר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). Trypsinize את טפט תא עם 3 מ ל תמיסת 0.05% טריפסין ו 0.48 מ"מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) למשך 5-10 דקות ב 37 º C. להוסיף 200 µL של הסרום המתאים כדי לעצור את trypsinization ו- mL 7 בינוני בלי תוספי מזון. Resuspend התאים על ידי pipetting והסרה של aliquot של µL 10 לספור תאים בתוך תא נויבאואר.
  3. כל היטב במערכת שקופית הקאמרית 8-ובכן, להפיץ את בסיס 40 µL של ECME טהור, ואחריו דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. כל טוב, במקום התאים 800 resuspended ב 400 µL של DMEM/F12 (ללא פנול אדום) בתוספת כמו שלב 1.1 אבל עם השינויים הבאים: עבור ראשי BrC תאים ותאים MCF-10A, להוסיף 4 ננוגרם למ"ל של EGF ו- 2% ECME; MCF-7, מד א-MB-231, להוסיף רק 2% ECME.
  5. דגירה תרבויות-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. להחליף את תרבות המדיה כל 48 שעות.
  6. רשומה מורפולוגי משתנה של תאים בכל 24 שעות ביממה במשך 15 ימים עם מיקרוסקופ אופטי. כדי לנתח את המורפולוגיה של ראשי BrC תאים, MCF-10A ותאים מד א-MB-231 הן עזר שורות תאים עבור דוגמאות של היווצרות acinar מסודרות המתוסבכים מבנים דמויי סרטן אגרסיבי, בהתאמה.
  7. להשיג כמה תמונות של תאים מיקרוסקופיית שדה בהיר-100 X ו- 200 X הגדלה והשווה מורפולוגיה תאים עם הפניה MCF-10A, מד א-MB-231 שורות תאים (איור 1).

2. לקבל את תאי סרטן ראשוני של רקמת הגידול

הערה: כדי להשיג גידול בתאי אפיתל להשתמש ברקמה מן resected הראשית גידולים מחולים BrC עם אין טיפול neoadjuvant הקודם; להימנע אזורי נמק ולעבוד עם מינימום של 0.5 ס מ3 של רקמת הגידול.

  1. לשטוף את רקמת הגידול עם PBS x 1 סטרילי, מכנית disaggregate זה עם איזמל לחלקים 1-2 מ מ.
  2. לעכל את רקמות בקבוקון זכוכית סטריליים mL 20 עם מכסה עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT) עם 2 מ"ל של הפתרון בצע: לערבב 1 מ"ג/מ"ל collagenase סוג אני, hyaluronidase U/mL 100 DMEM/F12 בינוני המכיל 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 , עם ערבוב מתמיד.
  3. לסנן ההשעיה הנוצרת באמצעות סטיריליים פיסות בד טול לחסל את חתיכות גדולות של רקמות מעוכל. לאחר מכן לסנן התליה תא דרך קרום מיקרומטר-נקבובית 100 מעוקר.
  4. גלולה התאים ב- g 430 x עבור 5 דקות ב RT ולשטוף אותם פעמיים עם PBS x 1 סטרילי. התרבות התאים הראשי בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100, 100 ננוגרם למ"ל כולרה הרעלן, 0.5 µg/mL הידרוקורטיזון, אינסולין µg/mL 10 ו 20 ng/mL של EGF. להחליף את המדיום כל ה 48 שמור על תרבויות-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  5. ודא מבודד התאים לתאי האפיתל עם פרוטוקול תקני immunocytochemistry14. בדיקת סמני אפיתל שלושה: פאנל של cytokeratins (PanCK), mucin-1 (Muc-1), ותא אפיתל אדהזיה מולקולה (EpCAM).

3. בידוד PM תאים מדם היקפי

  1. תמצית כ 40 מ"ל של דם היקפיים בריאה מתנדבים, לדלל את הדם ביחס 1:3 עם PBS סטרילי ללא אנדוטוקסין 1 x ונושא זה פרידה הדרגתי צפיפות.
  2. במקום צינור חרוטי, 2 מ של מדיום diatrizoate polysucrose ו נתרן עם צפיפות של 1.077 g/mL. לאט ובזהירות כיסוי 8 מ של דם מדולל. צנטריפוגה למשך 30 דקות, 765 g x RT. בשימוש מהירות האצה-ההאטה האיטית לצנטריפוגה.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, ארבע שכבות ייווצר מלמטה למעלה: בגדר כדוריות דם אדומות, השכבה הדרגתיות צפיפות בינונית, את שכבת תאי תאי (זה מופיע כעיגול לבן בסדר), השכבה פלזמה.
  3. בזהירות לאחזר את שכבת תאים תאי מעבר הצבע עם פיפטה פסטר סטרילי ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 1 x PBS, בכל פעם ואחריו צנטריפוגה איטי (430, 275 ו- 191 x g) למשך 10 דקות ב- RT.
  4. להשתמש בפרוטוקולים שלילית הבחירה כדי למנוע הפעלה של תאים. דוגמה פרוטוקול כזה הוא הדברים הבאים:
    1. לשטוף את התאים תאי פעם אחת עם פתרון כביסה buffered (0.5% שור אלבומין, 2 מ מ EDTA ב- PBS 1 x). לספור את התאים בתוך תא נויבאואר ולהתאים להם את צפיפות של עונה 1 פרק 10-7 תאים/30 µL של פתרון במאגר.
    2. עבור כל התאים7 עונה 1 פרק 10, להוסיף 10 µL של ה-FcR חסימת ריאגנט ו- µL 10 קוקטייל ביוטין-נוגדן מונוציט המכיל נגד CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, A Glycophorin (כולל קיטים מסחריים).
    3. לערבב את התאים, תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C. להוסיף על µL 30 נוספים של הפתרון כביסה באגירה מלאה פלוס 20 µL של גרגרי אנטי ביוטין (כלול בערכה); לערבב תאים, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
    4. שטיפת התאים פעם עם פתרון במאגר, צנטריפוגה-g 430 x עבור 5 דקות ב RT, resuspend ב 1.5 מיליליטר buffered פתרון הפרדה מגנטית.
    5. לטעון התליה תא על עמודה הפרדה מגנטית שטופים מראש ולהוסיף 7 מ של פתרון במאגר. לאסוף את השבר מועשרת מונוציט צינור חרוטי 15-mL, לספור את התאים, אם לא תרבותי מיד, הקפאת ומונוציטים על צפיפות של 2 x 106 תאים/1 מ ל DMEM/F12 בינוני בתוספת 50% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד ב −80 מעלות צלזיוס.
      הערה: הימנעו משימוש ומונוציטים לאחר יותר מ 2 חודשים לקפוא, הכדאיות שלהם יכול להיות בסכנה.
  5. לשמור על תרבויות של PMs DMEM/F12 בינוני בתוספת 6% FBS פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg 100/mL, ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  6. לבצע כל ערכה של ניסויים ניצול PMs מתורמים שונים לפחות שני באופן עצמאי, כמו צירוף חיבורים ומונוציטים מתורמים שונים יכולים לגרום מונוציט הפעלה.

4. יצירת 3D תרבויות שיתוף

  1. תרבויות המשנה 3D עם אינטראקציה עקיפה
    הערה:     לבצע מבחני אלה ב- 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות צלחות באמצעות פוליקרבונט תא תרבות מוסיף עם ממברנות של 0.4 גודל הנקבוביות מיקרומטר. ב הזה assay, הן supernatants והן תאים ניתן יהיה לאחזר בסוף הניסוי.
    1. לטפח 2 x 106 ומונוציטים U937 ו- THP-1 ב- 10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS, 1% אנטיביוטיקה/antimycotic, ולטפח PMs טריים שהושלם DMEM/F12 בינוני (כפי שצוין בתחילת שלב 3.5), ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
    2. צלחת ומונוציטים5 4 x 10 1 מ"ל/טוב של המדיום המתאים שלהם (בתוספת 2% ECME ו- 2% FBS ומונוציטים U937 ו- THP-1, או 2% ECME ו 6% FBS עבור תסמונת קדם וסתית).
    3. במקום מוסף כל היטב ולהוסיף 0.9 מ של 4 x 105 BrC תא השעיה בתוך המדיום המתאים (בתוספת עם 2% ECME ו- 2% FBS עבור שורות תאים מסחרי או 5% סוס סרום עבור תאים BrC הראשי). להחליף מחצית מדיה סה כ כל 48 שעות.
    4. דגירה-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה במשך 5 ימים ולשחזר את supernatants. לאחזר תאים על-ידי trypsinization אם לאחר מכן ניתוח זה מבוצע.
    5. כוללים את הפקדים של תרביות תאים בודדים עם התקשורת בהתאמה.
  2. תרבויות המשנה 3D עם אינטראקציה ישירה
    1. תווית BrC התאים, ומונוציטים עם צבעי פלורסנט שונים לפני תרבית תאים כדי לאפשר מיון עצמאית של כל שושלת היוחסין של תאי אחרי תרבות לניתוח של הביטוי mRNA וחלבון. השתמש זמינים מסחרית נגזרות קומרין ו rhodamine לעבור בחופשיות דרך קרום התא של תאים חיים. פרוטוקול כללי עבור תיוג הוא הדברים הבאים:
      1. להכין של טפט של תאים BrC עניין (2 × 106 תאים בבקבוקון תרבות2 25 ס מ), להחליף את המדיום סטנדרטי מספיק הפתרון עובד ומחוממת מראש של הפלורסנט (1:2, 000 של הפלורסנט במדיום בסיס רגיל ללא כל תוספת). דגירה 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. האחות הפתרון לצבוע ולשטוף בעדינות עם מספיק 1 x PBS. האחות של PBS ולהוסיף המדיום סטנדרטי.
      2. Trypsinize את טפט תא עם 2 מיליליטר תמיסת EDTA טריפסין ו 0.48 מ"מ 0.05% למשך 5-10 דקות ב 37 º C. הוסף µL 200 FBS להפסיק trypsinization של 7 מ של המדיום כתב בלי תוספי מזון. Resuspend התאים על ידי pipetting. . בסדר aliquot של µL 10 לספור תאים בתוך תא נויבאואר ממשיכים עם פרוטוקול תרבות משותפת לאחר ספירת תאים.
      3. גלולה התאים ב- g x 430 עבור 5 דקות ב RT (לבצע פעולה זו הראשונה מאז ומונוציטים לגדול ההשעיה). למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend תאים עם 3 מ"ל של הפתרון עובד ומחוממת מראש של הפלורסנט (1:2, 000 של הפלורסנט במדיום הבסיס הסטנדרטי ללא תוספי תזונה). תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
      4. גלולה התאים שוב, למחוק את הפתרון עובד צבע, resuspend בעדינות עם 5-7 מ ל 1 x PBS. גלולה פעם נוספת, למחוק את PBS ו resuspend תאים ב- 5-7 מ ל בינונית רגילה. . בסדר aliquot של µL 10 תא השעיה לספור תאים בתוך תא נויבאואר ממשיכים עם פרוטוקול תרבות משותפת לאחר ספירת תאים.
    2. הגדר את תרבות משותפת כדלקמן:: התפשטה מספיק ECME בתחתית הבאר כדי ליצור שכבת אפילו כל היטב של מערכת שקופית 4-ובכן קאמרית. צלחת µL 20 של השעיה תא בודד המכיל 5 × 105 שכותרתו BrC תאים לכל טוב.
    3. לאחר 15-20 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, מוסיף השעיה של 2.5 10x5 שכותרתו ומונוציטים 80 µL assay בינוני (בתוספת 60% ECME).
    4. לאפשר ECME לגבש למשך 15-20 דקות ב 37 º C.
    5. להוסיף 1 מ"ל של שילוב 1:1 של תאים BrC מונוציט תרבות המדיה.
    6. דגירה תרבויות המשנה ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה עבור 24 שעות, 48 שעות או 5 ימים כדי לעקוב אחר שינויים בנקודות זמן שונות.
    7. לבזות ECM חלבונים להתאושש התאים התרבויות. מחוק לגמרי, למחוק את המדיום, להוסיף 0.5 מ"ל של PBS 1 x עם 0.1% טריפסין, 0.25% EDTA, תקופת דגירה של h 3-37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה, להוסיף 0.5 מ של PBS 1 x עם 10% FBS כדי לנטרל את טריפסין, ואת resuspend את התאים על ידי pipetting נמרצות כדי לקבל השעיה תא בודד.
    8. גלולה תאים ב- g 765 x עבור 5 דקות ב RT למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים ב 5 מ של PBS 1 x עם 10% FBS. חזור על שלב זה פעם אחת.
    9. נושא התליה תא תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עם הכלי המתאים. ודא האוכלוסיות הסופי לפחות 95% טהור).
    10. לאחר מיון, לשטוף את התאים עם x 1 סטרילי PBS, גלולה (430 גרם x עבור 5 דקות ב RT), resuspend ב x 1 סטרילי PBS. התאים יכולים להיות מעובדים על-פי תקנונים ספציפיים RNA בידוד או חלבונים.
    11. חזור על כל assay שלוש פעמים, כולל תרבויות תלת-ממד של כל שושלת היוחסין של תא בודד כפקדים.
  3. האינטראקציה הישירה של תרבויות שיתוף תלת-ממד כדי להעריך קולגן השפלה
    1. ליצור תרביות תאים תלת-ממד שיתוף כפי שמתואר בשלב 4.2, בצעד הנוסף של הוספת µg/mL 32.5 סוג הקולגן הרביעי עם fluorescein isothiocyanate כדי ECME תוויות. הריכוז הסופי של קולגן הרביעי ב ECME הוא 0.5%. לגדול תרבויות coverslip 35 מ מ ב- צלחות פטרי.
    2. מורחים שכבה של 40 µL של ECME בתחתית הפטרי. לאפשר ECME לגבש ב 37 º C.
    3. להוסיף 2.5 x 10 תאים BrC5 10 µL של המדיום ולאפשר תאים להתמסד.
    4. הוסף השעיה של 1.25 x 105 U937 ומונוציטים 40 µL assay בינוני (בתוספת 60% DQ-קולגן הרביעי הנקרא-ECME).
    5. לאפשר ECME לגבש למשך 15-20 דקות ב 37 º C.
    6. להוסיף 2 מ של שילוב 1:1 של תאים BrC מונוציט תרבות המדיה.
    7. דגירה התרבויות שותף במשך 5 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה. להחליף את תרבות המדיה כל 48 שעות.
    8. לנתח את פליטת קרינה פלואורסצנטית במיקרוסקופ קונפוקלי סריקה ולמדוד את הצפיפות האופטית משולב (iod תבקש) לכל 50 מיקרומטר2 של תרבות. להשוות IODs תרבויות בודדות ותרבות בזמן אפס (איור 2).

5. ניתוח של Supernatants תלת-ממד משותף תרבויות עם אינטראקציה עקיפה

  1. לאחר 5 ימים של תרבות משותפת, לשחזר את supernatants העליון והן התאים נמוך של התרבויות שיתוף תלת-ממד, ומתוך הפקדים תרבות 3D בודדים. מערבבים היטב כל תגובת שיקוע על-ידי pipetting. Aliquot, חנות תגובת שיקוע על −20 ° C עד לשימוש (חודש אחד).
    הערה: לשמור supernatants −80 ° C אם האחסון יהיה יותר חודש אחד.
  2. לנתח את supernatants עם ריבוב assay פלטפורמות, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) או מבוסס-חרוז immunoassays בעקבות בפרוצדורות מומלצות של היצרן.
    הערה: Supernatants יכול להיות גם נותחו על ידי תספיג או מרוכזת דרך מסננים ספציפיים נקבובית להשיג גודל מועשר שברים חלבון כדי לבצע zymography ניתוח16,17. לחלופין, להשתמש supernatants את המדיה ממוזגים לניסויים אחרים, כפי שמתואר להלן. מדיה ממוזגים מתקבלת בדרך כלל מתרבות 5 ימים (איור 3).

6. אפיון ההשפעות של Supernatants מתאי BrC העיקרי על היווצרות Acini ומבנה Acini

  1. כל היטב של שקופית 8-ובכן הקאמרית מערכת להפיץ את בסיס µL 40 של ECME ולתת לו לחזק למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. זרע 800 MCF-10A תאים/טוב ב µL 400 שהושלם בינוני תרבות DMEM/F12, כפי שמתואר בשלב 1.2.
  3. הוסף µL 400 של מדיה ממוזגים או בינוני תרבות DMEM/F12 שהושלם עם 20 ng/mL של האדם רקומביננטי IL-1β.
  4. המקום השקופית קאמרית לתוך צלחת פטרי זכוכית המכילה 35 מ מ פטרי מלא 2 מ של PBS ליצירת סביבת לחות.
  5. החלף את המדיה/תגובת שיקוע כל 48 שעות.
  6. להקליט acini הבלוטות היווצרות כל 24 שעות למשך 14 ימים עם מיקרוסקופ אופטי.
  7. אחרי 14 יום של תרבות כתם acini עם 100 µL של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)-ריכוז של 100 nM ב- 1 x PBS להתבונן גרעין התא. תקופת דגירה של 25 דקות ב RT תוך בחישה מתמדת. לשטוף שלוש פעמים עם PBS x 1 במשך 5 דקות, בכל פעם תוך ערבוב מתמיד-הר RT. ההכנות עם מדיום הרכבה ספציפיים עבור צביעת פלורסנט. חותם עם לק שקוף ולתחזק מוגן מפני אור ב 4 º C.
  8. לנתח את acini עם מיקרוסקופ קונפוקלי לקיחת תמונות של ערימות ואלכסוני בעומקים שונים של acini (איור 4A, B, C).
  9. דמיינו החלבונים שונים ב- acini עם פרוטוקולים מכתימים נאותה. למשל, E-קדהרין היה מוכתם להעריך אדהזיה מתא אל תא, התא קוטביות, ו/או לומן היווצרות18 (איור 4D).

7. העברת מבחני

הערה: לבצע העברת מבחני של U937, תסמונת קדם וסתית THP-1, וטריים ב- 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות צלחות באמצעות פוליקרבונט תא מוסיף תרבות עם ממברנות של 8 גודל הנקבוביות מיקרומטר. בעבר הוכח כי נוגדנים GM-CSF, MCP-1 ו- RANTES נמצאו מופרש בריכוזים גבוהים תרבויות 3D בודדים של הקווים תא BrC אגרסיבי. הוצע כי ציטוקינים אלה היו קריטיים למשיכת ומונוציטים לאתר של הגידול העיקרי; זה נבחנה במבחני ההעברה באמצעות של ציטוקינים כמו chemoattractants.

  1. תרבות U937, תסמונת קדם וסתית THP-1, או טריים כפי שמתואר בשלב 4.1.1.
  2. לשטוף פעם כל הוספה עם 200 µL של RPMI 1640 ללא סרה מימה הקרום.
  3. למלא אותו µL 50 של ECME קר, למקם את הכיסויים צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות, ולאפשר את ECME פולימריזציה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  4. להוסיף 180 µL של RPMI בלי FBS בתא העליון של הצלחת. להוסיף בתא התחתון ללא מבעבע 800 µL של RPMI בתוספת או 100 ננוגרם למ"ל של GM-CSF, MCP-1, או RANTES כמו chemoattractant. השתמש בינונית ללא ציטוקינים כפקד שלילי. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C כדי ליצור מעבר הדרגתי כימוקין.
  5. המקום 1.5 x 105 של כל סוג מונוציט בשפופרת סטרילי, לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של 1 x PBS צנטריפוגה ב g 430 x עבור 5 דקות ב- RT. Resuspend ומונוציטים ב 20 µL של RPMI בלי FBS, מקם אותם בתוך השרוול , ואני מאוד בזהירות homogenize התליה תא (הנפח הסופי של התא העליון הוא 200 µL).
  6. לאפשר את נדידת תאים כדי התקדמות במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
    הערה: כפי ומונוציטים שאינו חסיד, תאים נודדים יהיה בדרך כלל בתקשורת של תא נמוך יותר.
  7. הסר את המכסים, לאחזר את המדיה, ולספור תאים בחלק 2, 4, 6 ו- 24 שעות ביממה באמצעות תא נויבאואר או cytometer של זרימה; לחלופין, במיוחד אם אין תאים נמצאים בתקשורת, לרכוש תמונות של החלק התחתון של התוספות באמצעות מצלמה דיגיטלית. ספירת רשע משדות אקראי 3 (בהגדלה X 100) משמשת לניתוח (איור 5).

8. הפלישה מבחני

הערה: ביצוע מבחני חדירה של תאי BrC צלחות 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות באמצעות פוליקרבונט תא תרבות מוסיף עם ממברנות של 8 גודל הנקבוביות מיקרומטר. במחקרים המקורי שלנו, IL-8 היה אחד ציטוקינים מועשר ב- supernatants של BrC תא/מונוציט תלת-ממד משותף התרבויות. אם ציטוקין השתתפו בפלישה של הקווים תא BrC נבחנה.

  1. הרחב BrC בתאים 75 ס מ2 מבחנות. MCF-7, T47D, HS578T, מד א-MB-231 כפי שמתואר בשלב 1.2 (אך ללא ECME) ותאים BrC העיקרי כפי שמתואר בשלב 2.4.
  2. לשטוף לאחר תרבית תאים הממברנה כל פוליקרבונט 8 מיקרומטר-נקבובית הכנס עם 200 µL בינוני ללא סרה (אופן השימוש תלוי שורת התאים נבדקו) מימה הקרום.
  3. למלא את תותב עם 50 µL של ECME קר (1:4 דילול ECME:cold בינוני ללא FBS), מניחים את הכיסויים צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות, ולאפשר את ECME פולימריזציה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר ECME יש polymerized, להוסיף 180 µL של המדיה המתאימים לתא ללא FBS. הוסף מדיה µL 800 ללא FBS דרך חרכי תותב. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 ° C ליצירת מעבר צבע של IL-8.
    הערה: הימנע מיצירת בועות בתקשורת. מדיה המשמשת ללא FBS אבל בתוספת 100 ננוגרם למ"ל של IL-8 chemoattractant או מדיה טהור ללא FBS, כפקדי שלילי.
  5. לקבל סך של 6 x 105 תאים בכל שורה תא כדלקמן:
    1. התעלם supernatants, לשטוף פעם עם 10 מ"ל של PBS 1 x ולהוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין/0.48 מ"מ EDTA למשך 2 דקות ב 37 ° C כדי לנתק את התאים. להוסיף 4 מיליליטר בינוני שהושלם להפסיק את התגובה טריפסין, resuspend נמרצות על ידי pipetting.
  6. . בסדר µL 10 aliquot של התליה תא לספור את התאים בתוך תא נויבאואר לקחת אמצעי אחסון של השעיה התא המכיל 6 x 105 תאים. צנטריפוגה-g x 430 עבור 5 דקות ב RT, למחוק את תגובת שיקוע, ולשטוף תאים 1 מ"ל של PBS 1 x. חזור על רינס פעם נוספת.
  7. Resuspend תאי µL 20 של המדיה המתאימים ללא FBS ומקום בתוך השרוול המכיל 180 µL של המדיה המתאימים ללא FBS. בזהירות homogenize התליה תא על-ידי pipetting.
  8. לאפשר את הפלישה תא כדי התקדמות במשך 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 סביבה.
  9. לאחר 48 שעות, הסר את תותב, למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את תותב פעם מאוד בזהירות עם 200 µL ל- 1 x PBS. עם המוליך שקצהו כותנה להסיר את עודף של PBS.
    הערה: התאים פולשנית בדרך כלל מחוברים לצד השני של הקדמי כפי במקרה זה איפה תאים חסיד.
  10. לתקן את התאים על ידי הצבת את תותב בטוב של צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות המכיל 1 מ"ל/טוב של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות ב- RT. לאחר מכן. כך, יש לשטוף את הכיסויים פעם אחת עם 1 x PBS.
  11. מכתים את התאים על ידי הצבת את תותב בבאר של צלחת 24-ובכן שטוח התחתונה תרבות המכיל 1 מ"ל/טוב ל- 1 x PBS בויולט קריסטל 0.2% במשך 45 דקות ב RT. בקפידה, עם הסר שקצהו כותנה המוליך כל ECME מהחלק העליון של קרום , אשר מכילה תאים לא להעביר, יש לשטוף היטב עם מים מזוקקים כדי למנוע ביטול קבוע תאים פולשני.
  12. לספור את התאים הפולשים על ידי התבוננות בצד התחתון של הקדמי תחת המיקרוסקופ הפוכה. ספירת רשע משדות אקראי 3 (בהגדלה X 100) משמש. במקרים פלשו כמו אשכולות בהם קשה לספור בנפרד התאים, לרכוש תמונות מ- 3 שדות אקראיים (בהגדלה X 100) באמצעות מצלמה דיגיטלית. לנתח את התמונות עם תוכנה לניתוח תמונות ולהשתמש של IOD לכמת תא הפלישה (איור 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח מורפולוגי של תאים BrC בתרבויות 3D:

המורפולוגיה של גדל בתרבויות 3D ב צפיפויות נמוך וגבוה התאים BrC העיקרי היה למד במשך 5 ימים. במהלך 48 ה הראשונה תאים לדבוק ECME, לשמור על צפיפות נמוכה. בנקודת זמן זו, זה בבירור ניתן להערכה כי תאים להציג צורת פלך דמוי מוארך, חלקם עם שניים או יותר זמן cytoplasmic תחזיות, מבלי להראות לכאורה תא תא אנשי קשר. לאחר 5 ימים של התרבות תאים התרבו תוך שמירה על מורפולוגיה הראשונית שלהם....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים אפיתל לגדול קונפורמציה מרחבית תלת-ממד, האינטראקציה שלהם עם החלבונים ECM מכריע בשביל לרקמות הומאוסטזיס. מחקרים סרטן רבים התבססו על התאים גדלו ב monolayers (2D), למרות שהם כבר קריטי להבנת היבטים רבים של היווצרות הגידול והתקדמות, monolayers לא מסכם את הדברים המאפיינים שמטילה על תאים, ECM עבור מופע: הגבלת ההפצה, אדהזיה תלויית התא הישרדות, הפסגה-basolateral קוטביות, ECM שיפוץ, תאית התמיינות, וכו ' חשוב, לא רק האינטראקציה בין תאים סרטניים ECM חיוניים ההתקדמות של סרטן, אך הקים התקשורת בין גידול תאים שאינם סרטניים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם כל ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי CONACyT FONSEC הסוכן המיוחד/איאמאסאס/ISSSTE פרויקט מס 233061 כדי Ezequiel מ פואנטס-Pananá ועל ידי Fondo Apoyo דה לה Investigación, בית החולים הקניות de México פדריקו גומז (פרויקט מספר לו-2014-053). נה אספינוזה-Sánchez הוא דוקטורנט מן פרוגרמה de Doctorado en Biomédicas עצמה, למד נאסיונאל Autónoma de México (UNAM) ואחווה שהתקבלו 231663 מ- CONACYT. נה E-S, גם להכיר את התמיכה הכספית שסופקו על-ידי המכון המקסיקני של ביטוח לאומי (איאמאסאס).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
U937אוסף תרבות הסוג האמריקאי ATCC CRL-1593.2קו תאים מונוציטי/לימפומה היסטיוציטית 
THP-1אוסף תרבות הסוג האמריקאי ATCC TIB-202קו תאים מונוציטיים/לוקמיה מונוציטית חריפה 
MCF-10Aאוסף תרבות טיפוסים אמריקאית ATCC CRL-10317קו תאי שד לא מותמרים
MCF-7אוסף תרביות מסוג אמריקאי ATCC HTB-22קו תאי סרטן השד
T47Dאוסף תרביות מסוג אמריקאי ATCC HTB-133קו תאי סרטן השד
HS578Tאוסף תרביות מסוג אמריקאי ATCC HTB-126קו תאי סרטן השד
MDA-MB-231אוסף תרביות מסוג אמריקאי ATCC HTB-26קו תאי סרטן השד
RPMI 1640 בינוניGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM גלוקוז גבוה GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 גרם/ליטר גלוקוז
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
אנטיביוטיקה/אנטי-פטרייתGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL פניצילין, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין, ו-0.25 ומיקרו; g/mL
Fungizone סרום בקר עובריGIBCO BRL Life Technologies16000-044
סרום סוסים GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% טריפסין-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (פוספט חוצץמי מלח GIBCO BRL Life Technologies20012-027
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00 מ"ג)
אינסוליןSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
הידרוקורטיזוןSIGMA-ALDRICHH088-5G
רעלן כולרה ויבריו כולרהSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
מטריגל Corning Inc356237סרקומה של עכברים Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), תמצית מטריצה חוץ-תאית, יש לאחסן ב-20° C עד לשימוש ב-4° C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
קריסטל-סגולHycel Mé xico541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
תומכים חדירים Transwell (תוספות)Corning Inc3422קוטר 6.5 מ"מ, 8 ומיקרו; M גודל נקבוביות/צלחות 24 בארות 
תומכים חדירים של Transwell (תוספות)Thermofisher Scientific140620קוטר 6.5 מ"מ, 0.4 ומיקרו; M גודל נקבוביות/צלחות 24 בארות 
ערכת בידוד מונוציטים II אנושי Miltenyi Biotec130-091-153
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
ערכת פאנל חרוזים מגנטיים ציטוקין/כימוקין אנושי 96 באר בדיקת צלחתEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix עם תוכנת xPonent (מכשור בדיקה אנליטי פלואורסצנטי מבוסס לייזר)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek שקופית תא עם כיסוי (8 ובכן)Nalge Nunc International177402
זכוכית תחתון microwell 35 מ"מ petri  כליםMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20(2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505(2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205(2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87(2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18(2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15(2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163(2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21(2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79(2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ECM

מאמרים קשורים