תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תקציר

חלבונים הם במצב דינמי של סינתזה, השפלה, החצי חייהם יכול להיות מותאם תחת נסיבות שונות. עם זאת, הנפוץ ביותר גישות לקביעת חלבון מחצית חיים האם מישהו מוגבל ממוצעים באוכלוסייה מתאי lysed או מחייבות שימוש מעכבי סינתזת חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדוד חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות SNAP-תג פיוז'ן חלבונים בשילוב עם מיקרוסקופ זמן לשגות זריחה. כל חלבון עניין דבוקה תג SNAP יכולות להיות covalently קשורות על ידי תא פלורסנט, חדיר לצבוע את זה משולב נגזרת benzylguanine, ניתן לנטר את הדעיכה של האוכלוסייה חלבון שכותרתו לאחר שטיפה של לצבוע שיורית. תא עוקבות מעקב, כימות עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב מעל הזמן יוצרת מעגל דעיכה מעריכית עבור כל תא מסומנים, מתן אפשרות לקביעת חלבון השפלה בבתי תאים בודדים על ידי עקומת התאמה. שיטה זו מספקת הערכה הטרוגניות של מחצית החיים בקרב אוכלוסיה של תאים בתרבית, אשר לא יכול בקלות להיות מוערך על ידי שיטות אחרות. הגישה המוצגת כאן היא ישימה לכל סוג של בתרבית תאים חסיד ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP. כאן אנו משתמשים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר גדל על צלחות תרבות תא E קדהרין-מצופים להמחשת השפלה תא יחיד איך המחירים של חלבונים עם מגוון רחב של מחצית החיים יכול להיקבע.

מבוא

זה ידוע כי החלבונים עוברים תחלופת נרחב, עם המחירים סינתזה והשפלה להיות ספציפיים עבור כל חלבון ובכפוף תקנה פיזיולוגיים. באופן מסורתי, חלבון השפלה המחירים כבר נמדד בשיטות בתפזורת, כגון ניתוח צ'ייס הדופק רדיואקטיביים, או מעורבים מעכבי סינתזה חלבונים כגון cycloheximide¹. לאחרונה, איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (SILAC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה הוקם לכמת חלבון מחזור על מידה עולמי². עם זאת, שיטות אלה מוגבלים על ידי ממוצע של אוכלוסייה, מידע על השתנות לתא ולכן הוא אבוד. יתר על כן, אין אפשרות לזהות שינויים חולף ב השפלה חלבון זה הם מסונכרן על פני האוכלוסייה תא.

לחלופין, חלבון מחצית החיים יכול....

פרוטוקול

הערה: במחקר זה, הקו תא E14 ES שימש. עם זאת, פרוטוקול זה ישימה ישירות על כל העכבר ES תא קו אחר ביטוי חלבון עניין דבוקה תג SNAP, על-ידי תיוג החלבון אנדוגני או באמצעות ביטוי. על הדוגמאות המוצגת במקטע תוצאות, שימשו דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג פיוז'ן תא קווים (SNAP-תג דבוקה החלבונים הבאות: Nanog, Oct4, Srsf11, או חלבונים פלורסנט mOrange2, sfGFP ו- put תחת השליטה של דוקסילין-inducible יזם. ראה¹¹ למידע נוסף פלסמידים משמש את הדור של הקווים תא דוקסיציקלין-inducible SNAP-תג fusion). דוקסילין-inducible המערכת יכול להיות שימושי במיוחד, שכן היא מאפשרת לפיקוח הדוק על התזמון והעוצמה של הביטוי של החלבון עניין. C-מסוף מיצוב של הצמד-התג מומלץ, כמו שינוי של N-מ....

תוצאות

הפרוטוקול המתואר מספקת הערכה של מידת ההשתנות לתא בתוך מחצית חיים עבור כל חלבון נתון דבוקה תג SNAP. השימוש רקומביננטי E-קדהרין-Fc לציפוי של צלחת הדמיה מאפשרת לתא בודד רזולוציה ES תאים, אשר אחרת צומחים במושבות. תאים בודדים ניתן לעקוב בנפרד לאורך כל הקורס של הסרט ( איור 1 א').

על מנת לקבוע זמן מחצית החיים חלבון עבור כל תא יחיד, זה חיוני למדוד את האות פלורסצנטיות SNAP-תג משולב, רקע המופחת לאורך זמן ( איור 1B), עם סיכום עוצמות משולבת של שנ.......

דיון

השלב המכריע ביותר כאשר היא בעזרת תג SNAP לפקח חלבון דעיכה כדי להבטיח כי אין צבע לא מאוגד שיורית שנשאר במדיום או בתאים אחרי כביסה, אחרת זה עלול להיקשר החדש מיוצר מולקולות SNAP-תג מאוחר יותר במהלך ניסוי של שם פשרה eby העקומה דעיכה. זה מצד אחד, מושגת על ידי ביצוע בקפידה את כל השלבים המתוארים כביסה. מצד שני, הריכוז צבע יש לשמור נמוך ככל האפשר, תוך שהם עדיין בטווח המאפשר קבלת אות לרעש יחס טוב. כפי שמוצג באיור2, ריכוז צבע צריך להיות אופטימיזציה עבור ניסוי על-ידי בדיקת דילולים שונים. במקרה שלנו, הק.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ציוד
ES המבטא חלבון היתוך SNAP-tag מעניין	-
פלקון 100 מ"מ TC-Assisted Cell	Culture Corning	353003
96 באר, שחור/שקוף, קורנינג צלחת מטופל בתרבית רקמות		353219
תא ספירה משופר של נויבאואר, 0.1 מ"מ	Marienfeld-superior	640030
CO2 Incubator	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
צנטריפוגה 5804 R	Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System	GE Healthcare Life Sciences	29027886
Name	Company	מספר קטלוגי	Comments
>Reagents
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	G5154
סרום בקר עוברי, תאי גזע אמביוניים מוסמכים	ThermoFisher	16141-079
תמיסת נתרן פירובט	Sigma-Aldrich	113-24-6
מדיום חיוני מינימלי  חומצות אמינו לא חיוניות	ThermoFisher	11140-035
פניצילין-סטרפטומיצין	BioConcept	4-01F00H
L-גלוטמין 200 מ"מ	ThermoFisher	25030-024
2-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	63689-25ML-F
גורם מעכב לוקמיה	-	-	מיוצר במעבדה על ידי טרנספקציה חולפת של תאי HEK-293T, ולאחר מכן איסוף וסינון של הסופרנטנט.
CHIR99021 (מעכב GSK-3 XVI)	Merck Millipore	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
ג'לטין מעור בקר	Sigma-Aldrich	9000-70-8
PBS 10x מרוכז של Dulbecco	BioConcept	3-05K00-I
PBS של Dulbecco ללא Ca++/Mg++	BioConcept	3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25%	Sigma-Aldrich	T4049
עכבר רקומביננטי E-Cadherin Fc חלבון כימרה	R& D systems	748-EC-050
דוקסיציקלין היקלאט	סיגמא-אולדריץ'	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	ניו אינגלנד BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	ThermoFisher	A18967-01
שם	חברה	מספר קטלוגי	הערות
תוכנה
FIJI	-	-	-תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח
MATLAB R2014a	Mathworks-Microsoft
Excel	Microsoft	-

קו תאים