הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56625

⸱

17 בנובמבר 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.

תקציר

טרשת עורקים הוא תורם מרכזי למחלות לב וכלי דם, הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, אשר טוען 17.3 מיליון אנשים בשנה. טרשת עורקים הוא גם הגורם המוביל של מוות פתאומי, אוטם שריר הלב, שעודד פלאק לא יציב נקרעים ועוברים occlude את כלי הדם ללא אזהרה. זרם שיטות הדמיה לא יכול להבדיל בין פלאק לא יציב ויציבה להיקרע. פפטיד חומרים פעילי שטח הקזאין (PAMs) יכול להתגבר על חיסרון זה כפי ניתן לשנותן עם מגוון של פילוח moieties לאגד במיוחד כדי רקמות חולות. ומונוציטים הוכחו להיות סמנים מוקדם של טרשת עורקים, בעוד הצטברות גדולה של monocytes משויך הפלאק נוטה להיקרע. לפיכך, חלקיקים שיכולות היעד ומונוציטים ניתן להפלות בשלבים שונים של טרשת עורקים. לשם כך, כאן, נתאר פרוטוקול על פי פילוח מונוציט PAMs (מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) PAMs). PAMs MCP-1 הם התאספו עצמית דרך סינתזה בתנאים מתון כדי טופס חלקיקים של 15 ננומטר קוטר עם יד תשלום משטח נייטרלי. במבחנה, PAMs נמצאו מסתיימים והיתה זיקה מחייבת גבוהה עבור ומונוציטים. בשיטות המתוארות בזאת מבטיחים למגוון רחב של יישומים טרשת עורקים, כמו גם מחלות דלקתיות אחרות.

מבוא

מחלות לב וכלי דם להישאר להיות הגורמים המובילים. למוות באופן גלובלי עם 17.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. מחלות לב וכלי דם נתרמים על ידי טרשת עורקים, מצב שבו הפלאק לבנות את העורקים, ובכך מעכבים דם, זרימת חמצן אל התאים של הגוף2,3. ההתקדמות של טרשת עורקים כרוך את עיבוי ואת התקשות של העורקים על ידי תגובה דלקתית, חילוף החומרים של השומנים לא סדיר, הצטברות פלאק, המוביל אל רובד אוטם שריר הלב ולמסמנים4,5. תאי אנדותל מבטאים מולקולות ציטוקינים והצמדות, הכוללים MCP-1 זה נקשר לקולטן C-C כימוקין (CCR2) על פני השטח של monocytes6,7,8. כולסטרול מחומצן ממירה ומונוציטים מקרופאגים בשלב מוקדם של היווצרות הפלאק, אשר מגביר את התגובה דלקתית באזור, מוביל פגיעה ברקמות ואת היווצרות הפלאק לא יציבה או פגיע9, 10.

באופן מסורתי, טרשת עורקים מחושבת על-ידי הערכת היצרות luminal על ידי הדמיה אנטומית באמצעות11,של מסתמים או אולטרסאונד-12. עם זאת, שיטות אלה יכול לקבוע אך ורק היצרות חמורה של הקיר עורקים, לא שבשלב מוקדם של טרשת עורקים, כמו צמיחה שלט הראשונית גורמת שיפוץ העורקים כדי לשמור על גודל עורק ודם תזרים קצב12,13, 14. לכן, angiograms underrepresent שכיחות טרשת עורקים. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה, דימות תהודה מגנטית שימשו לאחרונה לאפיין פלאק מורפולוגיה כפי שהם יכולים לספק פרטים הראשונית, אפיון של הפלאק. עם זאת, האופנים האלה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי חוסר רגישות, רזולוציה מרחבית, או דורשים השימוש של קרינה מייננת, ביצוע הדמיה פלאק התקדמות בשלבים שונים הרבה יותר מאתגר15,16, 17. מערכת משלוח הדמיה אשר במיוחד מזהה שלטי בשלבים שונים של טרשת עורקים נשאר להיות מפותח.

חלקיקים הוכיחו להיות פלטפורמה המתעוררים ויוו פלאק מיקוד ואבחון18,19,20,21. בפרט, PAMs הם יתרון בשל המגוון הכימי שלהם ואת היכולת להכיל מגוון moieties, יצירות, גדלים, צורות של פני השטח functionalization22. פפטיד חומרים פעילי שטח (PAs) מורכב הידרופיליות, פפטיד "headgroup" מצורף וזנב הידרופובי, אשר בדרך כלל שומנים; מבנה amphiphilic זה מקנה יכולות וההספק עצמי ומאפשר תצוגה multivalent של פפטידים על פני השטח של חלקיקים22,23,24. Headgroups פפטיד יכול להשפיע על צורת החלקיקים באמצעות קיפול ומימן מליטה בין פפטידים25. פפטידים מקפלים כתהליכי β-גיליון הוכחו יוצרות הקזאין מוארך, ואילו אישור α-הסליל יכולים ליצור שני כדורי ומוארך הקזאין22,23,24, 2526,,27. ניתן להניח linkers פוליאתילן גליקול (PEG) למגן את המטען משטח של פפטיד בין פפטיד הידרופילית את וזנב הידרופובי של PAMs, שיפור הזמינות של ננו-חלקיק מחזור מערכתי28, 29 , 30 , 31. PAMs הם גם יתרון כי הם אינם מסתיימים הוכחו, יש מגוון רחב של יישומי32,33. המסיסות במים הקזאין מציע יתרון על פני מערכות אחרות כגון חלקיקים פולימרים מסוימים אינם מסיסים במים, יש להיות מושעים ב- solubilizers עבור זריקות34מבוססי ננו-חלקיק. בנוסף, היכולת ליצור PAMs זה לפרק בתגובה לגירויים ספציפיים הופכת PAMs מבוקר הסמים תאיים משלוח35ההרסני.

על ידי קשירה לקולטן CCR2 המצטבר קשת אבי העורקים, PAMs פותחו בעבר עבור מונוציט מיקוד לעקוב אחר השלבים השונים התרדמה ב אבי העורקים9. בעכברים ספקיות- / - , הצטברות מונוציט מגדילה באופן פרופורציונלי פלאק התקדמות36. יתר על כן, נמצא כי חולים עם שלטי נוטה להיקרע, בשלב מאוחר מכילים כמויות גבוהות של monocytes37. לכן, השינוי של PAMs לשלב MCP-1 הוא שימושי כי זה מאפשר להגדיר מיקוד ובידול בין התרדמה, מאוחר-בשלב מוקדם. מחקרים אלה הוכחה הרעיון לאמת גם כי PAMs בטוחים מספיק לשמש pre-clinically, נמחקים renally38. מאז ומונוציטים ודלקת האופייני למחלות אחרות, PAMs MCP-1 יש פוטנציאל לשמש ליישומים טיפוליים ואבחון מחלות אחרות מעבר טרשת עורקים-8,-39,-40 , 41.

במסמך זה, אנו מדווחים על הזיוף של PAMs MCP-1 מאוד מדרגיים, שהורכבו עצמית, אשר הדגים של החלקיק לגודל האופטימלי משטח הטעינה, המיקוד סלקטיבי ומונוציטים עבור יישומי הדמיה משופר של טרשת עורקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: קרא את MSDS עבור ריאגנטים ופעל כל אמצעי בטיחות כימית כנדרש על-ידי מוסד מקומי.

1. הכנת PAMs MCP-1

  1. הכנת פפטיד MCP-1
    1. שוקלים לצאת mmol 0.25 של Fmoc-L-ליס (מפחיד)-Wang בכלי התגובה (RV). יש לשטוף את הצד של הקרוואן עם dimethylforamide מ ל (DMF) בשכונה fume כימי.
    2. לטעון את הקרוואן על סינתיסייזר פפטיד benchtop אוטומטית. לטעון ארוזים מראש הבקבוקונים חומצת אמינו, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", מ- C כדי אמיני. לכלול את מבחנה ריקה בסוף השלב הסופי deprotection.
      הערה: פפטיד מקושקשות עם רצף, N "- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C", יכול גם להיות מסונתז שימוש באותו הפרוטוקול.
    3. לאחר סיום סינתזה, להעביר את פפטידים על שרף הקרוואן המבחנה נצנוץ עם 2-3 מ ל מתנול עד כל שרפים מועברים. לאחר השרף שקעה לתחתית, להסיר את מתנול supernatant ולא להתאדות הנותרים עד יבש. אבק יבש h 2 נוספות או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    4. להפוך את פתרון המחשוף 12 mL המכיל חומצה trifluoracetic (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane ב 94:2.5:2.5:1% vol בשכונה fume כימי. מערבולת הפתרון המחשוף כדי לוודא כי הוא מעורב באופן שווה.
      התראה: כי triisopropylsilane ethanedithiol אוויר רגיש בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד, ארגון לטהר צלוחיות מניות של triisopropylsilane ו- ethanedithiol עבור 1 דקות לפני שמוציאים אותם בחזרה.
    5. הניחו את כלי הקיבול של סינתזה (SV) על גבי שאכר זרוע על ידי מחבר חובק למעקה ליד החלק התחתון של ה-SV. העברה פפטיד-שרף ה-SV 2 מ של פצילות פתרון עד כל פפטיד-שרפים מועברים.
    6. לשטוף את הצדדים של ה-SV עם 3 מ ל המחשוף פתרון. לסגור את הפקק של ה-SV ומנערים ב 300 תנודות/דקה במשך 4 שעות.
    7. שוקלים את צינור צנטריפוגה ריק 50 מ. להקליט את המסה.
    8. לאחר 4 שעות, לנקז את הפתרון cleaved פפטיד של ה-SV לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ. לשטוף את ה-SV מספר פעמים עם הפתרון המחשוף הנותרים.
    9. להתנדף פפטיד cleaved פתרון עם חנקן עד שיש פחות מ 4 מ ל שנותרו בצינור צנטריפוגה.
    10. להוסיף 36 מ"ל של האתר כקרח הפתרון ביקע פפטיד.
    11. הפתרון עד מערבולת הוא לגמרי לבן או צהוב. צנטריפוגה ב 3000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C, decant את תגובת שיקוע.
    12. הוסף אתר קר כקרח 40 מ"ל ברכבת התחתית. מערבולת, sonicate שוב. חזור על תהליך צנטריפוגה. Decant את תגובת שיקוע.
    13. יבש בגדר הרשות הפלסטינית גולמי עם חנקן גז מנקה עד האתר הוא בעליל התאדו.
    14. הוסף 20 מ"ל מזוקק פעמיים מים, מערבולת, ו- sonicate עד פפטיד היא התפרקה לחלוטין בפתרון.
    15. להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.
    16. ברגע פפטיד הוא מיובש, לשקול את המסה של הצינור צנטריפוגה המכיל את פפטיד גולמי. להמיס את פפטיד גס 5 מ"ג/מ"ל מים.
    17. להמיס 25 מ ג של פפטיד גולמי MCP-1 ב- 5 מ ל מים מזוקק פעמיים כדי ליצור ריכוז מוחלט של 5 מ"ג/מ"ל. לטהר את גולמי MCP-1 פפטיד על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) באמצעות 0.1% TFA במים (הממס A) ו- 0.1% TFA ב- acetonitrile (הממס B) בתור שלבים ניידים על עמודה הפוכה-פאזי C8. להזריק את 5 מיליליטר פפטיד לתוך HPLC.
      הערה: שלב ניידים הראשונית כללה 100% ממס A בקצב הזרימה של 9.0 מ ל לדקה להקטין הממס A לאט כדי 30% 27 דקות והחזק הזה בהרכב במשך 3 דקות חזרה מעבר הצבע כדי 100% ממס מעל 3 דקות והחזק הזה בהרכב עבור 1 דקות לתת ריצה-הזמן הכולל 34 למינימום של שמור על הטמפרטורה עמודה 55 מעלות צלזיוס. השתמש מצב מקור יון חיובי עבור הניתוח. חומצה פורמית יכול לשמש במקום TFA, אם TFA הוא חומצי מדי עבור העמודה HPLC. מומלץ כי המהירות הרמפה ההרכב הממס האורגני לא יעלה על 2%/min להפרדה טובה יותר.
    18. לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) עבור המוצר הצפוי ז/ז-2,890.
      הערה: להמיס חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic-1 מ ג/מ ל acetonitrile/מים (50: 50% vol) כפתרון מטריקס. במקום µL 0.75 של מטריקס פתרון לצלחת MALDI, ואחריו 0.75 µL של כל שבר. לבצע את הניתוח באמצעות מצב חיובי יון רפלקטיביים במגוון המונית של 500-5000 Da.
    19. לשלב המוצר שברים, לפוצץ את acetonitrile, להקפיא, ולאחר lyophilize פפטידים מטוהרים עד יבש.
  2. הכנה של הרשות הפלסטינית MCP-1
    1. הכן של עודף טוחנת 1.1 של 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-יתד (2000)-maleimide כדי פפטיד של נצנוץ נפרד בקבוקונים. להמיס שתי תרכובות במים מזוקק פעמיים כדי להפוך ~ 15 מ"ג/מ"ל. Sonicate למשך 15 דקות, או עד שני פתרונות ברורים לחלוטין.
      הערה: DSPE-יתד (2000)-Cy5 הוא מסונתז באמצעות פרוטוקול זהה עם DSPE-יתד (2000)-אמין, N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר-functionalized Cy5, למעט שלב 1.2.3, איפה ה-pH של התמיסה מותאם 8.5.
    2. להוסיף פתרון (2000)-maleimide DSPE-יתד הפתרון פפטיד. המערבולת ו sonicate.
    3. להוסיף 1 מ' NaOH dropwise (1 µL) עד ה-pH של התמיסה הוא 7.
    4. חנקן לטיהור לפתרון 5 דק מערבבים את הפתרון בין לילה.
    5. להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.
    6. ברגע שהמוצר גולמי הוא מיובש, להמיס המוצק של 5 מ"ג/מ"ל מים.
    7. לטהר עם HPLC כמתואר לעיל.
      הערה: פפטיד Unconjugated ו- DSPE-PEG(2000) צריך elute בין 15-30% ריכוז אורגנית (vol %), בעוד DSPE-יתד המספר המשלים (2000)-MCP-1 צריך elute בין 40-50% ריכוז אורגנית.
    8. לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI עבור המתאימים m/z. DSPE-יתד (2000)-MCP-1 צריך לשיא מ רחב/z-5,760.
      הערה: 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה מתאימה ביותר לשימוש כמו המטריקס DSPE-יתד (2000)-MCP-1 עם MALDI.
  3. הרכבה של MCP-1 PAMs
    1. להמיס 1.75 מ ג PAs MCP-1 עם מתנול 3 מ בבקבוקון 1-דראם. Sonicate עד שהרשות MCP-1 היא התפרקה לחלוטין.
      הערה: ניתן לשלב חומרים פעילי שטח Cy5 ביחס של שן טוחנת של 10:90 הרשות הפלסטינית MCP-1 עבור יישומי הדמיה.
    2. להתנדף מתנול תחת חנקן בתנועה סיבובית בזמן השטיפה מתנול הנותרים את הצד של המיכל עד סרט אחיד נוצר בתחתית המבחנה. ואקום-יבש הסרט בן לילה.
    3. מימה את הסרט עם 3 מ"ל של מאגר מים או פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להפוך פתרון 100 מיקרומטר של PAMs MCP-1. בעדינות המערבולת ו sonicate הפתרון עד שקוף. דגירה ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: הטמפרטורה מוגברות הוכח כדי להאיץ את תהליך הרכבה עצמית ומאפשרת את הרכיב פפטיד ליצור משני המבנה היציב ביותר, תוך כדי הנמכת42,את הריכוז (CMC) מיצלה קריטי43.
    4. מגניב את פיזור וכתוצאה מכך לטמפרטורת החדר.

2. אפיון PAMs MCP-1

  1. פיזור אור דינאמי (DLS) ואת פוטנציאל זטה
    1. המקום 100 מיקרומטר של פאם MCP-1 או פאם מקושקשות ב cuvette על פי ההוראות של המכשיר פוטנציאליים DLS או זטא.
      הערה: DLS, זטה וואקום פוטנציאלי יכול להיות שונה בהתבסס על ההוראות של המכשיר.
    2. Equilibrate הכלי לטמפרטורת החדר. למדוד את גודל ואת משטח הטעינה של פאם.
  2. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
    1. להוסיף 7 µL של 50 מיקרומטר פאם MCP-1 או פאם מקושקשות על גבי רשת TEM מושעים בתוך פינצטה עצמית הסגירה עבור 5 דק הפתיל משם ה-droplet עם מגבון המשימה העדינה.
    2. להוסיף 7 µL של מים כדי לשטוף את הרשת. לפתיל משם ה-droplet.
    3. להוסיף 7 µL של wt 1% חומצה phosphotungstic עבור 2 דק הפתיל משם ה-droplet. חזור על שלב 2.2.2.
    4. יבש את הרשת TEM לפני ניתוח TEM.
  3. ספקטרוסקופיה קיווטות (CD)
    1. הפעל את החנקן למשך 5-10 דקות לפני השימוש בכלי.
    2. מקום µL 300 של ריק (מים או PBS) cuvette.
    3. למדוד ספקטרה-190-265 nm, 0.2 מ מ אורך נתיב עם זמן אינטגרציה s 1, ורוחב הפס nm 1 הטמפרטורה בחדר. לאסוף 3 משכפל.
    4. מדד 100 מיקרומטר MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, ביצים מקושקשות פפטיד, ונעמד פאם תחת באותו המצב שמתואר בשלב 2.3.3. להחסיר מן הריק.
    5. להתאים את הנתונים באמצעות אינטרפולציה ליניארית של polylysine בסיס ספקטרה.
    6. כבה את המכשיר. לחכות 10 דקות לפני ביטול את החנקן.

3. ניתוח במבחנה של MCP-1 PAMs

  1. במבחנה הביו
    1. תרבות ולהרחיב את ה-וואי 274.1 ומונוציטים מאתר של Dulbecco ששינה נשר בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, מ מ 0.05 מרקפטואתנול, ב- 37 מעלות מתחת 5% CO2 כדי מעבר 5.
      הערה: ה-וואי 274.1 הם תאים ההשעיה. כאשר culturing, התקשורת צריכה להיות מתחדש כל 2-3 ימים.
    2. Pipet ומונוציטים בתקשורת לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
    3. האחות המדיה הישנה, resuspend בתקשורת טריים 10 מ"ל לתוך הצינור צנטריפוגה. מערבבים לאט עד תאים מופצים בצורה שווה בתקשורת. לספור את התאים באמצעות צביעת trypan blue ו- hemocytometer.
    4. לדלל תאים כאלה ישנם 4,000 ומונוציטים לכל µL 90 של מדיה לכל טוב. להוסיף 90 µL של תאים בבארות של צלחת 96-ובכן. תקופת דגירה של 24 שעות.
      הערה: הימנע משימוש הבארות על הקצה החיצוני של הצלחת כדי למנוע הבדלי אידוי ושינויים תרמי בצלחת. למלא הבארות החיצוני 100 µL PBS.
    5. להמיס µmol 0.15 של MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות או מקושקשת. פאם ב- PBS µL 150 צינורות microcentrifuge נפרדים, מעוקר. לבצע דילול טורי כדי להפוך µL 65 של 1, 10 ו- 100 מיקרומטר של כל דגימה.
    6. להוסיף 10 PBS µL ריכוז כל בבארות המכיל את ה-וואי 274.1 (סה כ עוצמה: µL 100 לכל, 6 קווי, בארות סה כ 96). תקופת דגירה של 72 h.
    7. להוסיף 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) כל היטב. תקופת דגירה של 1 h.
    8. לנתח את ספיגת שימוש בקורא צלחת 490 nm או בהתאם להוראות היצרן.
  2. במבחנה מיצלה איגוד
    1. ומונוציטים זרע 500,000 ב כל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של המדיה המכילה 100 מיקרומטר התווית על-ידי Cy5 פאם MCP-1 (יחס טוחנת 10:90 של DSPE-יתד (2000)-Cy5 והרשות MCP-1). תקופת דגירה של 1 h.
    2. לאסוף ה-וואי 274.1 על ידי צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. האחות התקשורת.
    3. Resuspend ולשטוף את התאים ב- 2 מ"ל PBS. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. מחוק לגמרי מגניב. חזור על התהליך הכביסה עם 2 מ"ל PBS. מחוק לגמרי מגניב.
    4. להוסיף 2 מ של paraformaldehyde 4% קר לתקן את התאים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    5. Pipet התאים קבוע על גבי coverslip זכוכית סטריליים בתוך בארות של צלחת 6-. טוב. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.
    6. להסיר את paraformaldehyde. לרחוץ ולשטוף עם 2 מ"ל PBS פעם אחת. Resuspend עם 1 מל PB
      הערה: כאשר שטיפה, להימנע לשבש את פעולת התאים על coverslip.
    7. לשים 10 µL של 90% גליצרול PBS לשקופית. השתמש במחט עם פינצטה כדי לאסוף את coverslip. יבש על קצה coverslip. הנח בעדינות את coverslip לשקופית עם הפנים למטה.
    8. בעדינות חותם על קצה coverslip עם לק ברורה. מניחים במקרר עד מוכן עבור הדמיה.
    9. להשתמש לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) המותקן עם לייזרים עבור Cy5-λעירור = 650 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכנה של פאם MCP-1
מוטיב CCR2 מחייב (שאריות 13-35) של MCP-1 חלבון [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] או מקושקשות פפטיד [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] שונתה על-ידי הוספת משקע ציסטאין על קצה אמיני. פפטיד MCP-1 היה מסונתז על ידי שיטה מוצק-פאזי בתיווך Fmoc באמצעות סינתיסייזר של פפטיד אוטומטית. פפטיד גולמי היתה מטוהרת על-ידי הפוכה-פאזי HPLC על עמודה C8 ב 50 מעלות צלזיוס באמצעות 0.1% TFA ב תערובות acetonitrile/מים, מאופיין MALDI ספקטרומטר מסה (איור 1). פפטיד המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

PAMs MCP-1 הם פלטפורמה הדמיה מולקולרית מבטיח, המורכב פפטיד מיקוד הידרופילית וזנב הידרופובי שמניע את מהות עצמית שהורכב ננו-חלקיק. מיצלה פילוח מונוציט הזה ניתן להכין על ידי סינתזה פשוטה ואת שלבי טיהור של פפטיד MCP-1 ו- DSPE-יתד (2000)-MCP-1. PAMs יש מאפיינים רבים מועילים ויוו מולקולרית הדמיה כגון שלהם הרכבה עצמית תחת תנאים מתון biodegradability מהותי, מבניים וכימיים גיוון המאפשר שיתוף אחרים moieties הדמיה או פילוח פפטידים למסור באופן סלקטיבי אתר מסוים של עניין. יהיה מכוון שלהם גודל החלקיקים, צורה, הרכב על ידי שינו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים, הייתי רוצה להכיר את התמיכה הפיננסית של אוניברסיטת דרום קליפורניה, הלב הלאומית, ריאות, ודם המכון (NHLBI), R00HL124279, אלי ו אידית פרס החדשנות רחבה, L.K. Whittier קרן Non-סרטן פרס המחקר translational שהוענקו EJC. המחברים תודה למרכז מיקרוסקופ אלקטרונים, Microanalysis, מרכז של מצוינות NanoBiophysics, מרכז התמחות על אפיון מולקולרי ומרכז Translational הדמיה-אוניברסיטת דרום קליפורניה לעזרה בארגון כיוונוני אינסטרומנטלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-ethanedithiolVWRE0032לסינתזה של פפטידים
10 מ"ל צנרת סרולוגית חד פעמיתVWR89130-898לתרבית תאים
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה, פוליפרופילןVWR89401-566ליישומים שונים
2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית, 99%AC165200050 מדעי של פישרעבור MALDI
25 מ"ל חד פעמי צנרת סרולוגיתVWR89130-900לתרבית תאים
2-Mercaptoethanol, 50 מ"מThermoFisher Scientific31350010לתרבית תאים
5 מ"ל צנרת סרולוגית חד פעמיתVWR89130-896לתרבית תאים
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR89039-658ליישומים שונים
בקבוק תרבית 75 ס"מFisher Scientific13-680-65לתרבית תאים
75 מ"ל כלי תגובהחלבון3000005לסינתזה של פפטידים
צלחת תרבית תאים 96 בארותVWR40101-346לבדיקת MTS
אצטוניטריל, HPLC כיתהפישר סיינטיפיקA998SK-4לטיהור HPLC
זכוכית בורוסיליקט, 1 דראםVWR66011-041לסינתזה PAM
פיפט זכוכית Borosillicate, טיפים ארוכיםVWR14673-043ליישומים שונים
Coverslip, 0.16-0.19 מ"מ, 22 x 22 מ"מFisher Scientific12-542Bלמיקרוסקופיה קונפוקלית
Cy5 אמיןAbcamab146463לצימוד פפטידים
אתר דיאתיל, כיתה ACSFisher ScientificE138-1למשקעי פפטיד
חד פעמי מזרקים, 20 מ"לפישר סיינטיפיק14-817-54לטיהור HPLC
נויבאואר כפול נשלט המוציטומטרVWR63510-13לספירת תאים
DSPE-PEG(2000) אמיןAvanti880128Pלצימוד פפטידים
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pלצימוד פפטידים
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kלצימוד ל-Cy5
Dulbecco's עיט גלוקוז בינוני-גבוהסיגמא אולדריץ'D5796-500MLלתרבית תאים
סרום בקר עוברי, מוסמך, מומת בחוםThermoFisher Scientific10438026לתרבית תאים
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-Aלסינתזה
של פפטידיםטכנולוגיות חלבון Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUPS3-H5-RBFלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-NTלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-CTלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-QTלסינתזת פפטידים
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-Iלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-Lלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-KBCלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-Fלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-SBלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-TBלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-YBלסינתזה של פפטידים
Fmoc-L-Val-OH /HBTUטכנולוגיות חלבוןPS3-H5-Vלסינתזה של פפטידים
שרף Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 רשתNovabiochem856013לסינתזה של פפטידים
חומצה פורמית, אופטימה LC/MS כיתהפישר מדעיA117-50לטיהור HPLC
גליצרולVWRM152-1Lלמיקרוסקופיה קונפוקלית
מונה ספירת ידפישר סיינטיפיקS90189לספירת תאים
מוטות ערבוב מגנטיים, בצורת ביצה VWR58949-006לצימוד פפטידים
מתנול, מוסמך ACSFisher ScientificA412-4לסינתזת PAM
ערכת בדיקה קולורימטרית של התפשטות תאי MTSVWR10191-104לבדיקת MTS
N, N-Dimethylformamide, דרגת ריצוףFisher ScientificBP1160-4לסינתזה של פפטידים
N-Methylmorpholineטכנולוגיות חלבוןS-1L-NMMלסינתזה של פפטידים
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250לקיבוע תאים
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049ליישומים שונים
פניצילין/סטרפטומיצין, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122לתרבית תאים
סינתזה פפטיד, 25 מ"ל& נ.ב.פ;פישר סיינטיפיקCG186011לסינתזה של פפטידים
חומצה פוספוטונגסטית פישר סיינטיפיקA248-25
לספקטרוםTEM פיפרידיןP1146-2.5LTGLלסינתזה של פפטידים
שקופית מיקרוסקופ זכוכית רגילה 75 x 25 מ"מפישר סיינטיפיק12-550-A3למיקרוסקופיה קונפוקלית
מאגרי ריאגנטים, סטריליים 95128093VWR לתרבית תאים
פינצטה סגירה עצמיתTedPella515לסרט תמיכה TEM
TEMTedPella01814F
לחומצה טריפלואורואצטית TEM פישר סיינטיפיקBP618-500למחשוף פפטידים וטיהור HPLC
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5 מ"ללמחשוף פפטידים
תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061לספירת תאים
פינצטה, משוננת לשימוש כלליVWR231-SA-SEלמיקרוסקופיה קונפוקלית
WEHI-274.1ATCCATCC  CRL-1679עכברים מונוציטים
אוטומטיים סינתיסייזר פפטיד שולחניחלבוןPS3 סינתיסייזר פפטיד ספסל
ואלפא;- ציאנו- 4- חומצה הידרוקסיצינמית, 99%סיגמא אולדריץ'476870-2Gעבור MALDI
טכנולוגיות כלי טכנולוגיות

מקורות

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MCP 1HPLC
סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.