הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56645

⸱

19 בדצמבר 2017

 ,  , 
1Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Illinois at Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור חוקרים צורת בגירוי הכימית של wholemount חולדה הרשתיות במבחנה עם גלוטמט עצבי. בגירוי כימי הוא אלטרנטיבה מבטיחה בגירוי חשמלי המקובלת של הנוירונים ברשתית לטיפול עיוורון בלתי הפיך הנגרם על ידי מחלות ניווניות קולט אור.

תקציר

מחלות ניווניות קולט אור לגרום לעיוורון בלתי הפיך דרך אובדן הדרגתי של קולט אור תאים ברשתית. תותבות ברשתית הם טיפול המתעוררים עבור מחלות ניווניות קולט אור אשר מבקשים לשחזר את הראייה על ידי גירוי מלאכותי הנוירונים ברשתית ששרדו, בתקווה לקבל תפיסה ויזואלית מובנים בחולים. תותבות ברשתית הנוכחית הוכיחו הצלחה שיקום הראייה המוגבלת לחולים באמצעות מערך של אלקטרודות חשמלית לעורר הרשתית אך להתמודד עם מחסומים פיזיים ניכר שחזור חדות גבוהה, ראייה טבעית לחולים. בגירוי כימי באמצעות נוירוטרנסמיטורים מקורית גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים, נוכל לעקוף את המגבלות הבסיסיות הקשורות ברשתית תותבות שימוש בגירוי חשמלי. באופן ספציפי, בגירוי כימי יש פוטנציאל כדי לשחזר את חזון טבעי יותר עם acuities דומות או יותר של visual מטופלים בהזרקת כמויות קטנות מאוד של נוירוטרנסמיטרים, הסוכנים טבעי אותו לתקשורת המשמשת רשתית כימית synapses, ברזולוציה יותר עדינה יותר מאשר תותבות חשמל הנוכחי. עם זאת, כמו פרדיגמה גירוי נחקרו יחסית, אין שום פרוטוקול הוקמה להשגת גירוי כימי של ה רשתית במבחנה. מטרת עבודה זו היא לספק מסגרת מפורטת לביצוע גירוי כימי של הרשתית לחוקרים המבקשים ללמוד על פוטנציאל של neuromodulation כימי של הרשתית או דומה רקמות עצביות בתוך חוץ גופית. בעבודה זו, אנו מתארים את הגדרת הניסוי ואת מתודולוגיה העלאת גנגליון תא (מהרשות לשיקום האסיר) ספייק תגובות הדומה חזותית אור תגובות בפראי-סוג ומבוקר מנוון-קולט אור wholemount הרשתיות חולדה על ידי הזרקת כרכים של גלוטמט עצבי אל החלל subretinal באמצעות micropipettes זכוכית והתקן מותאם אישית microfluidic מרובה. מתודולוגיה זו ופרוטוקול הם כללי מספיק כדי להיות מותאם neuromodulation באמצעות עצביים אחרים או אפילו אחרים רקמות עצביות.

מבוא

מחלות ניווניות קולט אור, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, הקשורות לגיל ניוון מקולרי, מובילים גורם בירושה של אובדן ראייה, כיום חשוכת מרפא1,2. למרות מחלות אלו נובעים מגוון מוטציות גנטיות מסוימות, מחלות ניווניות קולט אור מאופיינים כקבוצה אובדן הדרגתי של תאי קולט אור ברשתית, הגורמת בסופו של דבר לעיוורון. האובדן של גורמים photoreceptors נפוצה שיפוץ לאורך הרשתית אבל לשרוד את הנוירונים ברשתית, כולל תאים דו-קוטביים, RGCs, נותרו ללא פגע ופונקציונליים יחסית אפילו בשלבים מתקדמים של קולט אור ניוון3 ,4,5,6,7.

מנגנונים של פתולוגיות המחלות האלה היה טוב מאופיין3,4,5,6,7 אך טיפול יעיל עודנו. בשלושת העשורים האחרונים, חוקרים ברחבי העולם יש חקר מגוון רחב של טיפולים רפואיים עבור שחזור חזון אלה מושפעים עם קולט אור מחלות ניווניות כולל טיפול גנטי8, טיפול בתאי גזע9, השתלת רשתית10ו-11,לגירוי מלאכותי12 של הנוירונים ברשתית ששרדו. אלה, זמינים ביותר קלינית הם פרותזה ברשתית, אשר הם התקנים מלאכותיים בגירוי באופן מסורתי נעזרו מערך אלקטרודות חשמלית לגרות את התאים הפרעה דו קוטבית או RGCs בתבניות ספציפיות עם המטרה של יצירת תפיסות חזותי מלאכותית לחולים11. פרותזה חשמל הדור הנוכחי, כגון ארגוס II13 ו אלפא-IMS14 מכשירים, השיגו אישור רפואי, מחקרים ראשוניים הראו כי הם יכולים לשפר את איכות החיים לחולים על-ידי שחזור מידת הראייה באמצעות על פני רישתית (קדמי של הרשתית) והן subretinal (מאחורי הרשתית) מושתלים מכשירי15,16. קבוצות מחקר ברחבי העולם פועלים לקידום תותבות ברשתית מעבר ההצלחות של אלה מכשירים דור ראשון17,18,19,20 אבל התמודדו קשיים בעיצוב של תותבת חשמלי מסוגל לשחזר גבוהה חדות הראייה מתחת לרמת עיוורון משפטי לחולים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השגת ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר זה מופעל על ידי הדור הנוכחי תותבות מבוססות חשמל הוא מאתגר בגלל המגבלה הזרקת תשלום, אשר מחייבת את השימוש אלקטרודות גדול לעורר בבטחה הנוירונים ברשתית במחיר של רזולוציה מרחבית, קרי ראייה11,21. יתר על כן, גירוי חשמלי הוא יותר מוגבל כי היא בדרך כלל מעוררת את כל התאים הסמוכים, ולכן מעורר תפיסות לא טבעי ומבלבל בחולים, בעיקר בגלל שזה הפרדיגמה21גירוי טבעי מטבעו. ובכל זאת, ההצלחות מוקדם של גירוי חשמלי הדגימו שבגירוי המלאכותי הזה יכול להיות טיפול יעיל עבור מחלות ניווניות קולט אור. זה מוביל אחד משערים כי טיפול יעיל עוד יותר יהיה בר השגה על ידי גירוי הרשתית עם עצבי כימיקלים, הסוכנים הטבעי של הסנסור הסינפסות כימי. מטרת השיטה המובאת בעיתון הזה היא לבחון את הכדאיות טיפולית של גירוי כימי, אשר מבקש לחקות את המערכת הטבעית של סינפטית תקשורת בין הנוירונים ברשתית, כמו גירוי אלטרנטיבה חשמל ביונים עבור תותבת ברשתית.

תרגום של המושג טיפולית גירוי כימי תותבת ברשתית כימי מסתמך על כימית הפעלת המטרה הנוירונים ברשתית עם כמויות קטנות של נוירוטרנסמיטרים מקורי, כגון גלוטמט, באמצעות microfluidic התקן הכוללת מגוון רחב של microports בתגובה גירוי חזותי. בדרך זו, תותבת ברשתית כימי יהיה בעצם שכבה קולט אור מלאכותי ביונים המתרגמת פוטונים באופן טבעי להגיע הרשתית לאותות כימיים. מאז אותות כימיים אלה להשתמש את אותם מעבירים עצביים מנוצל איתות ברשתית נורמלי ולעורר את הנוירונים ברשתית ששרד הרשתית מנוונת דרך מסלולים סינפטית אותו בשימוש על ידי חזון נורמלי מסלולים, הדימוי שנוצר התפיסה מושגת באמצעות תותבת ברשתית כימי יכול להיות מובנת וטבעית יותר בהשוואה אחד ברמיזות על הפרוטזה חשמל. יתר על כן, מאז microports שדרכו משתחררות נוירוטרנסמיטורים יכולים להתבצע מאוד קטנים, ערוכים בצפיפות גבוהה, בניגוד האלקטרודות, חומר כימי פוטנציאלי תותב עשוי להיות מסוגל להשיג הרבה יותר. גירוי מוקד ומעלה מרחבית רזולוציה יותר תותבת חשמל. לפיכך, בהתבסס על יתרונות פוטנציאליים אלה, תותבת ברשתית כימי מציע אלטרנטיבה תותבות חשמל מאוד מבטיח.

גירוי כימי של הרשתית, עם זאת, יש יחסית מעט נחקרו עד לאחרונה. בזמן גירוי חשמלי של הרשתית מאפיין טוב במשך עשרות שנים של עבודה דרך חוץ גופית ב22,23 ויוו23,24, מחקרים קליניים13 ,14, מחקרים על גירוי כימי היה מוגבל אך ורק כמה במבחנה עבודות25,26,27,28. Iezzi ו- Finlayson26 ואברהם זילברשלג. et al. 27 הפגינו על פני רישתית גירוי כימי של ה רשתית במבחנה באמצעות אלקטרודה אחת של מערך multielectrode (מאה), בהתאמה, כדי להקליט את התגובות גלוטמט עורר של הנוירונים ברשתית. לאחרונה, Rountree. et al. 28 הפגינו גירוי דיפרנציאלית של המסלולים ברשתית לסירוגין באמצעות גלוטמט מן הצד subretinal MEA להקליט את התגובות עצביים מאתרים מרובים על הרשתית.למרות עבודות אלו preliminarily הקימו את הכדאיות של גירוי כימי, יותר מחקרים הם חיוניים כדי לחקור רבים מההיבטים של גישה זו מעבר לאלה התייחס כה26,25,27 , 28, והגדר את הפרמטרים גירוי טיפולית במודלים של בעלי חיים גם במבחנה וגם ויוו לפני לתרגם את המושג הזה כדי תותבת ברשתית כימי כמתואר לעיל. עם זאת, כיום יש אין מתודולוגיה הוקמה לביצוע גירוי כימי של הרשתית בספרות, האמצעים שננקטו בעבודות קודמות לא תוארו בפירוט כזה יהיה חיוני ללימודים replicative. לכן, הרציונל שבבסיס מאמר שיטות היא לספק מסגרת מוגדרים היטב עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הרשתית לחוקרים הללו מעוניינים או שכפול שלנו הקודם מחקרים27, 28 או נוסף לקידום רעיון nascent בגירוי כימי.

כאן נדגים שיטה עבור ניצוח במבחנה גירוי כימי של הנוירונים ברשתית ב wholemount הרשתיות של חולדות פראי-סוג ודגם קולט אור עכברוש מנוונת כי מקרוב מחקה את ההתקדמות של קולט אור ניוונית מחלות בבני אדם. הרציונל מאחורי פיתוח שיטה זו גירוי במודלים במבחנה הוא להעריך את הטווחים טיפולית של פרמטרים גירוי שונים וללמוד מאפייני תגובה עצבית, זה יהיה בלתי אפשרי או קשה להתבונן ב- ב ויוו מודלים, במיוחד במהלך הלימודים הראשוני התמקדו להערכת הכדאיות של גישה זו. בהליך זה, אנו מראים גם יחיד-אתרים וגם בו זמנית אתר רב stimulations כימית של הרשתית על-ידי אספקת כמויות קטנות של 1 מ מ גלוטמט ליד היעד הנוירונים ברשתית דרך זכוכית אחת זמינים מסחרית micropipettes מותאמת אישית ההתקן microfluidic מרובת יציאות micromachined, בהתאמה. בעוד stimulations יחיד-אתרים וגם אתר רב להשיג את המטרה הבסיסית של חוקרים את הכדאיות טיפולית של neuromodulation כימי, אחד משרת מטרה ברורה עם יתרון ייחודי. גירוי בודד-אתרים, אשר יכול להתבצע עם זכוכית מראש משך זמינים מסחרית micropipettes, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים ישירות לתוך מהסבא של הרשתית באתר אחד ומגישה כדי לחקור אם מהרשות לשיקום האסיר הנצפה ספייק קצב תגובות דומות מבחינה ויזואלית עורר תגובות האור יכול להיות elicited focally תחת ההזרקה. מצד שני, ריבוי האתר גירוי, הדורש מכשיר מיוחד מפוברק microfluidic מרובה, יכול לשמש כדי להזריק חומרים כימיים במרחב באתרים מרובים על-פני הרשתית ומגישה לחקור כיצד גם עורר גלוטמט קבוצת ריינהולד כהן דפוסי תגובה תואמות התבניות להזרקת גלוטמט במחקרים גירוי דפוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות המפורטות על ידי המדריך של המועצה הלאומית למחקר על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. פרוטוקולי טיפול והמתת חסד בבעלי חיים היו נבדקו ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.

1. מודלים

  1. פראי-סוג רב-אוונס חולדות
    1. להשיג בת 24-32 יום פראי-סוג אוונס ארוך אפור עכבר של מין או הרים עם קצב יום/לילה סטנדרטי 12 שעות.
    2. כהה להתאים את החולדה על-ידי הצבתו בחדר חשוך לחלוטין עבור h 1 לפני תחילת הניסוי.
  2. S334ter-3 עכברים
    1. לחצות לבקן הטרנסגניים homozygous S334ter-3 החולדות (גם סקס), המבטאים את שני עותקים של הגן המוטנטי אופסין # רודופסין, עם עכברוש לונג-אוונס פראי-סוג פיגמנט לייצר פיגמנט חולדות S334ter-3 משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים כי התערוכה ניוון קולט אור דומה בהתקדמות האנושית רטיניטיס פיגמנטוזה29,30.
    2. לגדל צאצא משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עם תקן 12 שעות יום/לילה קצב ולהשתמש חולדות של מין או לניסויים של הדורות הבאים המתאימים בשלבים הבאים של ניוון קולט אור: ניוון בשלב מוקדם: 14-20 ימים הישן; המזרח התיכון ניוון הבמה: 21-27 ימים הישן; ניוון בשלב מאוחר: בת; 28-35 ימים עיוור לחלוטין: > בן 50 ימים.
    3. כהה להתאים את החולדה על-ידי הצבתו בחדר חשוך לחלוטין עבור h 1 לפני תחילת הניסוי.

2. הכנת פתרון בינוני של איימס ומערכת זלוף

figure-protocol-1
איור 1: סכימטי של הגדרת הניסוי. מפרטים טכניים של ההתקנה ניסיוני לגירוי כימי באמצעות micropipette של זכוכית (א) והתקן מותאם אישית microfluidic מרובה (B). הרשתית היא מונחת על pMEA, perfused ללא הרף עם טרי, מחומצן איימס בינוני פתרון הן מהחלק העליון והתחתון דרך החורים pMEA. אותות עצביים התגובה נאספות על ידי האלקטרודות של pMEA מוזנים דרך המגבר MEA למחשב רכישת נתונים. גירוי ויזואלי וכימיים מוכשרות באמצעות נורית LED ירוקה של מזרק לחץ 8 ערוצים, בהתאמה, שני גירויים מופעלות על ידי מחשב גירוי ייעודי, אשר משמש גם כדי למקם את פיפטה באמצעות 3-ציר דיוק micromanipulator. מיקרוסקופ הפוכה משמשת להתבוננות ברשתית במהלך ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-protocol-2
איור 2: הגדרת הניסוי. (א) תצלום של השלמת ההתקנה ניסיוני מראה היחסיים של כל הרכיבים. מערכת מגבר MEA מונחת על גבי מיקרוסקופ הפוכה, אשר משמש באופן חזותי הרשתית ולהתאמה דיגיטלית תמונה בממשק המכשיר-רשתית באמצעות המצלמה במהירות גבוהה צמוד במהלך הניסוי. זלוף העליון והתחתון נשלטים באופן עצמאי באמצעות מערכת זלוף שבשליטת ברז חשמלי. הזרקת עמדת שליטה, מדידות עכבה מוכשרות באמצעות מזרק לחץ, micromanipulator, תיקון קלאמפ מגבר (כתום תיבת; המוצגות באופן מפורט יותר B), בהתאמה. Micropipette או ההתקן מוכנס לתוך headstage מלחציים תיקון עבור מדידות עכבה ואת רכוב על גנטרי (שצוין על-ידי תיבת ירוק; מוצג בפירוט רב יותר בשפת C) כדי להקל על מיקום תוך שימוש של micromanipulator. (B) תקריב של מכשירי מדידה ובקרה המשמשים את הניסוי: מזרק של ערוץ 8 לחץ, מערכת בקרה micromanipulator, תיקון מגבר קלאמפ למדידה עכבה, כלי היניקה לחיסול זלוף. (ג) תקריב של מערכת הזרקת gantry מציג מכשיר רב-יציאות לממשק עם מחזיק פיפטה, תיקון קלאמפ headstage, micromanipulator. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-protocol-3
איור 3: הגדרת זלוף. (א) תצלום של החלק העליון של המגבר MEA המציג את המיקום של זלוף העליון את, שאיבה, כמו גם ה-LED ירוק המשמש לצורך גירוי חזותי אור. (B) מקרוב לשכת זלוף pMEA הממחישות את מיקומי המדויק של זלוף העליון, שאיבה, pMEA את האלקטרודה הפניה המשמש למדידה עכבה. (ג) photomicrograph של צלחת זלוף התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הערה: ראה איור 1, איור 2ו- 3 איור

  1. למדוד את 900 מ ל מים מיוננים בטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ומניחים בתוך מיכל 1 ליטר.
  2. Perfuse את המים עם 100% CO2 באמצעות מנגנון מבעבע.
    1. הוסף 8.8 גר' בינוני אבקת איימס למים במיכל 1 ליטר.
    2. שוטפים מיכל של איימס בינוני עם כמה מיליליטר מים מיוננים כדי להסיר כל עקבות של אבקת איימס בינוני ולהוסיף מיכל 1 ליטר.
    3. להוסיף 25.3 מיליליטר הפתרון סודיום ביקרבונט (w/v של 7.5%31) מיכל 1 ליטר.
    4. להוסיף מים נוספים כדי להביא את הפתרון הסופי נפח של 1 ל'
    5. המשך פרפוזיה המים עם CO2 כ 5 דקות.
  3. תפסיק CO2 זלוף ולהתחיל פרפוזיה פתרון עם תערובת דלק באיכות רפואית של 95% O2 ו- 5% CO2 במשך לפחות 30 דקות, או עד ה-pH מייצבת ב 7.4.
    הערה: לצורך של פרוטוקול זה, המדיום איימס נשמרת בטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) לאורך כל הניסוי כדי למנוע CO2 או O2 outgassing, אשר ניתן occlude את הקווים זלוף עם בועות אוויר.
  4. לנקות את הצינורות זלוף תחתון ועליון על ידי מילוי עם אתנול 70% ולאחר מכן לשטוף שני קווי 3 פעמים עם מים מיוננים. למלא את השורה התחתונה עם הקו העליון עם אוויר ומים מיונן.
סגור את שני קווי באמצעות מערכת שסתום סולנואיד.
  • לצרף את הצינור הראשי זלוף החיבור סכינים סטריליים של המיכל בינונית של איימס 1 ליטר.
  • פתח את השסתום העליון זלוף, להשאיר את זה פתוח עד בפתרון היציאות מהשפך זלוף העליון. כבה את השסתום העליון זלוף.
  • פתח ששקע זלוף התחתון, תשאיר את זה דולק עד כל הבועות אקזיט דרך שקע זלוף התחתון.
  • לצרף כלי היניקה ריק לקו יניקה ראשי והפעל את מקור יניקה. ודא החלק העליון והחלק התחתון אינלטס היניקה פתוח ועובד.
  • ודא כי כל בצגי מחשב מכוסים על ידי מסכי מסנן אדום כדי למנוע גירוי חזותי לא מכוונת של הרשתית.

    • 3. Wholemount רשתית הכנה

    figure-protocol-4
    איור 4: הכנת רשתית ניתוח ו- wholemount. (א) תצלום של עיינית שלמים שנלקחו חיה מנוון-קולט אור. Photomicrograph (B) של הרשתית עם חתכים אורכיים כדי לרדד אותו. (ג) לאחר שיטוח הרשתית, זה מושם על גבי רשת רשת עם הצד קולט אור פנייה אל רשת השינוי, משוטחים באוויר (מחוץ זלוף בינוני) כדי להבטיח שם בלי קיפולים או קצוות מסולסל. (ד) רשת השינוי, רשתית העין במהירות להעביר את pMEA עם הצד תא גנגליון פנייה אל האלקטרודות, מיד perfused בינונית איימס מחומצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-protocol-5
    איור 5: מחורר מערך multielectrode. (א) תצלום של המערך multielectrode מחורר בשימוש בפרוטוקול. הרשתית מושם על המערך אלקטרודה (שצוין על-ידי המלבן האדום, אשר מוצג בפירוט רב יותר ב') בתוך תא pMEA כדי לאפשר זלוף מתמיד בינונית איימס מחומצן. (B) photomicrograph של המערך אלקטרודה עצמה הממחישות את הסידור של נקבים בין האלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    הערה: ראה איור 4 , איור 5

    1. באמצעות פנס LED אדום כף יד כדי לספק תאורה אדומה עמומה, המתת חסד חיה באמצעות פחמן דו-חמצני חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם או בשיטה אחרת, על פי פרוטוקולים IACUC.
    2. Enucleate בשתי העיניים באמצעות המלקחיים #5 של צורף ולמקם עיניים enucleated בצלחת פטרי בקוטר 60 מ מ עם 3-4 מ"ל של טרי, מחומצן איימס בינוני פתרון.
    3. תוך התבוננות העין דרך stereomicroscope חיתוך עם העליון והתחתון illuminators כיסתה עם מסך מסנן אדום, עושים חתך קטן בפנים הקרנית בעזרת איזמל או זוג מספריים חדים.
    4. לחתוך מ חתך קטן כזה לקצה של הקרנית ואז להרחיב את החתך בקטע במבניו סביב קצה שלם של הקרנית. הסר את הקרנית עכשיו מנותקת יחד עם העדשה, ליחות מימית, בזגוגית שקוף.
    5. תוך החזקת בעדינות עיינית עם זוג מלקחיים, להפוך בזהירות שני חתכים קטנים משני צידי המתרס של עיינית. בשלב הבא, השתמש שני זוגות של מלקחיים כדי להפריד את עיינית בכל החתכים ובעדינות להפריד בין הרשתית לבין sclera.  לאט הרימו הרשתית כולו בסקלרה, עיינית. חותכים את עצב הראייה, אם הוא עדיין מחובר.
    6. קיצוצים האורך ברשתית לקבל חצי או רבע למקטעים באמצעות מספריים, ופרש לאחר מכן בעדינות מקטע הרשתית אחד על גבי רשת ניילון (100 מיקרומטר חוט קוטר עם 350 מיקרומטר פתיחה) עם מול (קעורה בצד של הרשתית) תאי גנגליון מן הרשת.
    7. מניחים את רשת השינוי ואת הרשתית על מערך multielectrode מחורר (pMEA) עם תאי גנגליון במגע עם המשטח pMEA. ואז בעדינות להציב רשת משוקלל פרוסה על גבי רשת השינוי להחזיק הרשתית במקום.

    4. MEA וההתקנה רכישת נתונים

    figure-protocol-6
    איור 6: רעש רמות של pMEA. (א) הקלטה נציג של קבוצת משנה של אלקטרודות pMEA מפגין רעש גבוהה מתמיד. הרעש הזה הוא בדרך כלל בשל חוסר קשר תקין בין הידיות קשר pMEA את הסיכות של המגבר MEA כתוצאה ללבוש נורמלי של השכבה פוליאימיד מחורר דק מעל pMEA, במיוחד בזמן רפידות קשר. מקור אפשרי אחר של רעש הוא בדרך כלל פתרון הדליף על הידיות קשר של מגבר pMEA. רעש מתמשך עקב סיכה המסכן לפנות ו/או דלף פתרון על הקשר ניתן לתקן רפידות בדרך כלל על ידי העברת המיקום של pMEA בתוך המגבר להשיג קשר טוב יותר, ניקוי וייבוש של רפידות, בהתאמה. אם הרעש לא יכול לסלק על-ידי ניקוי או ומזיזה את המיקום pMEA, pMEA ייתכן שתצטרך להיות מוחלף לחלוטין. (B) הקלטה נציג של רמות רעש של תת-קבוצה של אלקטרודות pMEA מ pMEA נקי עם קשר טוב בין pMEA לבין מגבר. בדרך כלל, רמת הרעש הממוצע הוא ±16 µV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    הערה: ראה איור 6

    1. בתאורה אדומה עמומה, למקם את pMEA לי מגבר וסגור מגבר בריחים.
    2. אם סימוני הפניה אינם קיימים על הטבעת תא pMEA כבר, לחרוט שני 'X'-סימני בצורת במרווחים כ 5 מ מ אחד מהשני באזור גלויים בקלות מלמעלה עם המיקרוסקופ הנטען בום-לעמוד.
    3. מיקום בשקע זלוף העליון בתוך תא pMEA, לפתוח את הברז זלוף העליון כדי להשיג שיעור זלוף של 3 מ ל לדקה. מקם לים היניקה העליון ברמת perfusate הרצוי (~ 5 מ מ עמוקה) וודא שזה עובד.
    4. לפתוח את התוכנה רכישת נתונים במחשב רכישת נתונים ולחץ על לחצן 'הפעל' כדי להתחיל לקבל נתונים. להבטיח כי כל הערוצים pMEA ללא רעש, הקלטה אותות עצביים.
    אם לא, למקם מחדש את pMEA בתוך המגבר להשיג קשר טוב יותר בין הפינים מגבר אנשי הקשר pMEA (ראה איור 5).
  • ודא זלוף בסופו של דבר היא ברורה של בועות אוויר, אם זה ללא בועות, לפתוח את הברז זלוף התחתון כדי להבטיח בתחתית הרשתית מסופק עם חמצן וחומרים מזינים.
  • תדליק את המצלמה במהירות גבוהה קשורה המיקרוסקופ האופטי הפוכה (10 X הגדלה עם נ. א של 0.45) ופתחו את תוכנת הדמיה. ודא המאיר מיקרוסקופ הפוכה מכוסה סדין אדום מסנן פולטים אור אדום בלבד ולאחר מכן לקבוע המאיר לאור ברמה נמוכה כדי להימנע photobleaching ברשתית.
    1. לפי תמונה דיגיטלית בשידור חי של הפוך מיקרוסקופ שדה הראייה על צג, להתבונן מהמשטח התחתון של pMEA ראיות כי הפתרון הוא זורם דרך צלחת זלוף התחתון.
  • ברגע זלוף התחתון הוא אישר כדי להיות זורם, אט-אט כבש את היניקה התחתונה על-ידי באופן ידני הפעלת הידית לחץ ואקום ערכת פסולת ואקום תוך התבוננות על הרשתית מבעד למיקרוסקופ הפוכה. הפסקת הגדלת היניקה פעם כוח יניקה הנצפה פועל על הרשתית. הקפד להימנע שאיבה יותר מדי או פחות מדי.
  • לאחר הבטחת התחתון שאיבה מחזיקה הרשתית במקום, תוריד את הרשת פרוסה משוקלל הרשתית בעזרת מלקחיים, להסיר בעדינות את רשת ניילון על-ידי פילינג בפינה אחת בקפידה מן הרשתית. זה צריך להפריד בקלות עוזב הרשתית מחובר היטב לתחתית pMEA עם משטח subretinal חשוף על העליונה. שמור זלוף פועל עבור 30 דקות לאפשר רשתית לייצב מטראומה כירורגי.

    • 5. גלוטמט גירוי הכנה

    figure-protocol-7
    איור 7: זכוכית micropipette והתקן מרובה microfluidic. (א) בעל פיפטה לפני הכנסת של micropipette או התקן. האלקטרודה כסף/כסף כלוריד (קוטר 50 מיקרומטר) חשמלית רתומה למתאם בקצה ממשק עם headstage מהדק תיקון (B) תמונה של micropipette זכוכית לממשק עם המחזיק פיפטה המציג את המיקום של הנמל לחץ להשתמש כדי ליזום זריקות פנאומטיים. (ג) התקן מותאם אישית microfluidic מרובה (1 ס מ 1 ס מ ס מ 0.134) מחובר אביזר מותאם אישית מודפס 3D ו לממשק עם המחזיק פיפטה דרך צינור פלדה אל חלד. ההתקן, אשר היה מפוברק בשתי שכבות, יש שמונה microports (קוטר 14 מיקרומטר) השכבה התחתונה (340 מיקרומטר עבה), שמונה מאגרים על שבב (בקוטר 1.6 מ מ) לאחסון גלוטמט בשכבה העליונה (בעובי 1 מ"מ). כל אחד microports שמונה בשכבה התחתונה של המכשיר מחובר באופן עצמאי המאגר על שבב בשכבה העליונה דרך microchannel בתוך המטוס ולאחר כל המאגר על שבב בתורו מחובר ליציאת הלחץ של מזרק ערוץ 8 לחץ דרך צינור גמיש כדי לאפשר הופעה עצמאית של microports לזריקות בדוגמת ריבוי האתרים. (ד) תקריב של המכשיר מרובה מוחזק על ידי פינצטה לפני שתצרף הנורה ממשק אבובים מציג את הסידור של שמונה מאגרים על שבב למיעון באופן עצמאי, אבובים אינלטס. (ה) photomicrograph של המשטח התחתון של המכשיר מציג את microports 14 8 מיקרומטר קוטר המסודרים בתצורת 3 x 3 עם מרווח מיקרומטר 200 כדי להתיישר עם האלקטרודות של pMEA. השמונה מחוץ microports מנוצלים לזריקות ריבוי האתרים, ואילו הנמל המרכזי שימש אך ורק עבור יישור במהלך ייצור של המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    הערה: ראה איור 7.

    1. הכן גלוטמט פתרון על ידי ערבוב עם. החומר חמצן גלוטמט מניות איימס פתרון בינוני כדי להשיג דגימה 0.5 mL-ריכוז העבודה של 1 מ מ גלוטמט.
    2. להוסיף בזהירות micropipette מראש משך 10 מיקרומטר בקוטר של או פלדת אל-חלד המוט מחובר למכשיר microfluidic מרובה לתוך בעל פיפטה רגיל המכיל אלקטרודות 50 מיקרומטר בקוטר של כסף/כסף כלוריד.
      הערה: אם זיהוי עכבה אינה זמינה, האלקטרודה חוטי כסף/כסף כלוריד יכול להיות מושמט.
    3. ממשק המחזיק פיפטה עם headstage תיקון-קלאמפ, להתחבר לחץ היציאה סכינים סטריליים החיבור של בעל פיפטה על ערוץ 1 של מערכת הזרקה בלחץ, אם ניצול של micropipette זכוכית, או להתחבר החיבורים סכינים סטריליים לחץ היציאה של כל אחד הזרקת 8 היציאות עם ערוצים 1-8 של מערכת הזרקה בלחץ, אם משתמש בהתקן מרובה.
    4. באופן ידני להפעיל מערכת הזרקה בלחץ ולהפוך על ערוץ 1 (או ערוצים 1-8, לפי הצורך). ודא כי המערכת פרקו לאווירה, הגדר את הלחץ הזרקת 0.1 psi.
    5. הפעל micromanipulator ולאחר לכייל אותו על ידי לחיצה על לחצן 'כיול' בבקר מניפולטור. מקם את micromanipulator כך הקצה micropipette (או החלק התחתון של המכשיר, לפי הצורך) הוא כ- 30 מ מ מעל המגבר MEA.
    6. למלא צלחת פטרי קטן עם פתרון גלוטמט (1 מ מ גלוטמט במדיום איימס סטנדרטי) ולמקם אותו מתחת micromanipulator. להוריד micropipette עצה (או המכשיר) לתוך פתרון למילוי על-ידי לחיצה על הלחצן 'מילוי' על מערכת הזרקה בלחץ (לחץ היניקה של-13 H2O) עד כ 20 מ מ של פתרון גלוי micropipette זכוכית או התקן מרובה אבובים.
      1. אם משתמש המכשיר רב-יציאות, להפעיל ערוץ 1 של מזרק לחץ ביטול וחזור הפרוטוקול עבור ערוצים 2-8. להרים את micropipette עצה או התקן מתוך פתרון, להסיר את צלחת פטרי, ומקמו את micromanipulator מעל תא pMEA.
    7. באמצעות stereomicroscope בום-דוכן-רכוב, ליישר את קצה micropipette או בפינות של המכשיר עם סימוני ההפניה חרוט הטבעת תא pMEA. לאחסן את העמדות מניפולטור לתוך התוכנה שליטה באמצעות הלחצנים 'חנות הפניית A' ו- 'חנות הפניה B' (או פשוט הערה הקואורדינטות מניפולטור ידנית) כדי למפות את מערכת קואורדינטות של manipulator עם האלקטרודות pMEA.
    8. באמצעות תוכנת שליטה מניפולטור, בחר אלקטרודה pMEA של היעד עם פעילות ספונטנית חזקים ולחץ על הלחצן 'העבר ערוץ' כדי ליישר את micropipettewith זכוכית האלקטרודה היעד.
    אם משתמש המכשיר רב-יציאות, ישר microports את המכשיר עם אלקטרודות pMEA היעד בפעילות ספונטנית החזקה, שימוש באותו התהליך.

    6. ממשק עם הרשתית

    1. אם מדידות עכבה זמין, הפעל תיקון קלאמפ מגבר וליזום את תוכנת ויזואליזציה עכבה על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' כדי להמחיש את אימפדנס של האלקטרודה כסף/כסף כלוריד בתוך המחזיק פיפטה. תוך כדי התבוננות הסימנים עכבה בזמן אמת, הורידו לאט את micropipette או את המכשיר עד זה יוצר קשר על פני הרשתית כמצוין על-ידי עלייה מהירה עכבה האות (ראה איור 8). לשמור או רשום של העמדה של פני השטח ברשתית.
      1. אם מדידות עכבה אינה זמינה, לזהות מגע עם משטח הרשתית דרך התצפית הויזואלית, אבל זה יהיה פחות מדויק. להנמיך את פיפטה או התקן עד זה קשר בעליל המשטח העליון של הפתרון בינוני איימס בבית הבליעה MEA.
      2. לאחר מכן, תוך התבוננות על החלק העליון של הרשתית עם מיקרוסקופ הפוכה, הורידו לאט את פיפטה או התקן עד המשטח העליון של הרשתית בעליל תסולף, אשר מציין כי הקשר הפך עם משטח הרשתית. לשמור או רשום של העמדה של פני השטח ברשתית.
    2. לגירוי מהסבא, הנמך את פיפטה נוספים 40 µm (עבור הרשתיות S334ter-3) או 70 מיקרומטר (עבור הרשתיות פראי-סוג).
    3. לבצע כמה זריקות זמן קצר (10-30 ms) באמצעות מערכת הזרקה (0.1 psi) לחץ כדי לקבוע אם התאים ליד הקצה micropipette או התקן microports פתוחים גלוטמט גירוי על ידי התבוננות את האותות העצביים עם רכישת נתונים תוכנה.
      הערה: זריקות מוצלח להפיק את ספייק בבירור קצב פרץ או ספייק עיכוב (ראה איור 9). אם אין תגובה נצפית, למקם מחדש את micropipette או את ההתקן ב אלקטרודה שונים.

    figure-protocol-8
    איור 8: מדידות עכבה. (א) סכימטי של הטכניקה מדידות עכבה. באמצעות המגבר מלחציים תיקון, עכבה של micropipette ברציפות להשגחה כפי היא לאט לאט יורדת לכיוון פני השטח ברשתית. כאשר micropipette מעל הרשתית, מוליכות יונית גבוה יחסית בינוני איימס תוצאות קריאה עכבה נמוכה. Micropipette עושה קשר עם פני השטח ברשתית, מוליכות יונית דרך הכבל כסף/כסף כלוריד מופחת, גורמת לעלייה מהירה עכבה נמדד. (B) מגרש הצגת השינוי עכבה הקליט רק לפני ואחרי הקשר של קצה פיפטה עם משטח הרשתית. עכבה נמדד הוא נמוך יחסית כאשר הקצה micropipette הוא פתרון בדיוק לפני מגע (שצוין על-ידי האזור הכתום בצד השמאל). כאשר הקשר הוא עשה (שצוין על-ידי החץ האדום והסביבה הירוקה בצד ימין), עכבה מגדיל במהירות בשל מוליכות יונית מופחתת לאחר יצירת קשר עם רקמת רשתית. בפועל, פני הרשתית רשומה את הגובה המתאים תחילתה של העלייה תלולה של עכבה נמדד (המיקום ראש החץ האדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-protocol-9
    איור 9: אלקטרודה הקלטות של פעילות עצבית במהלך חזותית, ספונטנית, והקלטות הזרקת גלוטמט. הקלטות נציג (א) 9 אלקטרודות pMEA מציג הרכבת לסנן נתונים אלקטרודה במהלך גירוי חזותי אור עם נורית LED ירוקה שבו כל מלבן מראה הנתונים עצבית אלקטרודה ייחודי. כל הקלטה אלקטרודה ממחישה את הנתונים שנאספו בפעם הראשונה או השנייה לאחר הפעלת הנורה הירוקה (תזמון מוצג עם ראשי חץ כתום בכל מגרש) עם קנה מידה מתח נפוצה שמוצג את y-axes השמאלי. קוצים זוהו באמצעות מתח הסף של µV: תרכיזי (אופקי הקו האדום בכל מגרש אלקטרודה), מיוצגים על-ידי עקבות שחור בנתונים של אלקטרודה ירוק. גירוי חזותי גרם פרץ של קוצים (עירור) כל אלקטרודות מלבד מרכז בראש אחד, ייחסו מענה מעכבות אור. (B) מגרש דומה עבור האלקטרודות באותו מראה פעילות עצבית ספונטנית ללא גירוי חזותי או הזרקה. למרות צרורות קטנים היו נוכחים, הדפוסים של קוצים היו שונות מאלה שנרשם בתגובה גירוי חזותי. (ג) הקלטות נציג המשנה זהה של אלקטרודות הקליט מיד לאחר זריקה גלוטמט על האלקטרודה המרכזית (בתזמון המצוין על-ידי ראשי חץ כתום בכל מגרש). גלוטמט מוזרק elicited פרץ של קוצים בתוך האלקטרודה מרכזי זה היה דומה מאוד התפרצויות ספייק עורר חזותית. כל כימיקלים אחרים לא הושפעו על ידי הזרקת גלוטמט, אשר מדגים את הרזולוציה המרחבית בסדר של הטכניקה גירוי כימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    7. ליזום ברשתית הקלטה של תוכנית הגירוי

    1. אוריינט הנורית הירוקה לעבר המשטח העליון של הרשתית. . מתחיל להקליט באמצעות התוכנה רכישת נתונים במחשב ייעודי הקלטה על-ידי הקלדת שם הקובץ ולחיצה על הכפתור "שיא"
    2. לאחר ההקלטה החלה, פתח את התוכנית שליטה גירוי וטענו את קובץ גירוי ברירת המחדל על-ידי לחיצה על לחצן "גירוי ' קריאת קובץ. בשלב הבא, לחץ על לחצן "הפעל קובץ גירוי" ליזום קובץ גירוי המהווה ברירת מחדל המורכב של פרוטוקול רכישה גירויים ונתונים שתואר בהערה שלהלן.
      הערה: (i) 30 ניסויים של 2 s ON ופלאש 2 s פעיל מלא (בעוצמה2 lm/ז 5) באמצעות ה-LED ירוק. (ii) 120 s של נתונים ללא שימוש הנורית הירוקה כדי להקליט את פעילות ספונטנית של הרשתית על פני ציר זמן דומה. (iii) 1 או יותר קבוצות של זריקות גלוטמט בהיקף של 30 ניסויים של גלוטמט זריקות-0.1 psi עם הזרקת ms 10-30 פעמים (כ 100-300 pL לכל זריקה) ומשכי 3 s interpulse. במקרה של זריקות אתרים מרובים, בחר יציאות 2 או יותר להחדיר בו זמנית.
    (iv) 90 s של פעילות ספונטנית.
  • ברגע שהקובץ גירוי הושלמה, להפסיק את ההקלטה (על-ידי לחיצה על כפתור "עצור") כדי לשמור את הקובץ עבור מיון ספייק העתיד וניתוח נתונים (ראה איור 10 לדוגמה).

    • figure-protocol-10
    איור 10: Peristimulus היסטוגרמות חזותית, ספונטנית, ומענים גלוטמט. (א) היסטוגרמות נציג peristimulus (30 ms binwidth) של ספייק הנתונים קבוצת המשנה של אלקטרודות ב איור 9A, בממוצע על פני 20 ניסויים של גירוי אור חזותי. מידה משותף של קצב ספייק היה מוחל על כל אלקטרודות, מוצג בצד y-axes השמאלי. הקו השחור בכל מגרש אלקטרודה מייצג את קצב ספייק הממוצע עבור כל קוצים הקליט במהלך בפעם הראשונה או השנייה לאחר הפעלת הנורה הירוקה. כפי שניתן לראות, גירוי חזותי גרם לתגובה קצב ספייק מעוררות חולף-אלקטרודות כל פרט האלקטרודה העליון המרכזי, אשר היה בתגובה מעכבות ארעי אור. (ב') התגובות קצב ממוצע ספייק ספונטנית להקליט האלקטרודות אותו ללא כל גירוי חזותי או כימי. ללא גירוי, ספייק במחירים כל אלקטרודה הם קבועים יחסית. (ג) ספייק ממוצע שיעור התגובות להקליט האלקטרודות באותו בתגובה זריקה גלוטמט במיקום מעל האלקטרודה המרכזית. התגובה רק ארעי ניכר הוא התגובות סינאפסות האלקטרודה ישירות מתחת ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעורר כימי הן הרשתיות נורמלי, פראי-סוג, כמו גם קולט אור מנוון באדמומיות, למרות משמעותי הסלולר שיפוץ הנגרמת על ידי אובדן photoreceptors. לפני תחילת הניסויים עם קולט אור או מנוון או פראי-סוג באדמומיות, הקלטה של גירוי ציוד (איור 1 ו- 2 איור) בצורך להיות הרב-שימושי, את pMEA (איור 5) שצריך לנקות כדי למזער רעש על כל ערוץ אלקטרודה (איור 6). למרות קולט ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    השיטה המוצגת כאן מדגים פרדיגמה גירוי עצבי ייחודי, שבו הנוירונים ברשתית הם גירוי כימי על ידי הזרקת כימיקלים עצבי יליד לתוך מהסבא של הרשתית חוץ גופית בתוך. טכניקה זו גירוי כימי מציעה מספר יתרונות הטכניקה המקובלת גירוי חשמלי, כולל סלקטיביות וספציפיות מוקד גבוהה של נוירונים היעד. בפרוטוקול לעיל פרטים כמה קטן נפח זריקות פנאומטיים של גלוטמט עצבי נמסרות ליד הנוירונים ברשתית היעד באמצעות micropipette זכוכית עם יציאה אחת או מכשיר microfluidic מרובה micromachined מותאם אישית להפיק תגובות פיזיולוגית משמעותית מהרשות לשיקום ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    העבודה הציגה בעיתון נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע, המתעוררים גבולות במחקר ולהעניק חדשנות (NSF-EFRI) תוכנית מספר 0938072. תוכן המאמר אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של ה-NSF הינם אך ורק באחריות של המחברים. המחברים גם רוצים להודות ד ר Samsoon אברהם זילברשלג על עבודתו בעיצוב ובדיקה ההגדרה הראשונית ניסיוני לגירוי כימי מר Ashwin Raghunathan עבור עבודתו בעיצוב, בדיית, הערכת המכשיר microfluidic מרובה בשימוש מחקר זה.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    מערך מיקרואלקטרודות, פריסה מחוררתמערכות רב ערוציות, מגבר GmbH60pMEA200/30iR-Ti-prhttp://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti
    MEAמערכות רב ערוציות, GmbHMEA1060-INVhttp://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv
    פלטת קרקע זלוף תחתונהלמערכות רב-ערוציות pMEA, GmbHMEA1060-INV-(BC)-PGPhttp://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp
    סאטר מיקרומניפולטור ממונעים 3 צירים, נובאטו, קליפורניהMP-285
    https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html מערכת בקרת מיקרומניפולטורמכשירי סאטר, נובאטו, קליפורניהMPC-200
    https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html סגנון גנטרי מעמד מיקרומניפולטור עם שקופיות ליניאריותSutter Instruments, Novato, CAMT-75 / LShttps://www.sutter.com/STAGES/mt75.html
    מזרק לחץ רב ערוצי לתכנות 8 ערוציםOEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ
    ספק: Harvard Apparatus UK    		PM-8000 או PM-8OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm
    ספק: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1
    _HAUK_ProductDetail
    Axopatch 200A שילוב התקנים מולקולריים של מגבר מהדק תיקוןסאניווייל, קליפורניהAxopatch 200AAxopatch 200A הוחלף בדגם חדש יותר Axopatch 200B:
    https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier
    מהדק תיקון headstageמכשירים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניהCV 201A
    ערכת פסולת ואקוםhttp://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYVMKhttp://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/
    מחזיק פיפטותWarner Instruments, Hamden, CTQSW-A10Phttps://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915
    משוך מראש 10 μ מיקרופיפטות זכוכית בקוטר m קצהWorld Precision Instruments, סרסוטה, פלורידהTIP10TW1https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/
    זום סטריאומיקרוסקופניקון, טוקיו, יפןSMZ-745T
    https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 מעמד בום מיקרוסקופ עם כדור ליניארי כפול זרוע נושאתOld School Industries, Inc., Dacono, COOS1010H-16BB
    מיקרוסקופ סטריאו זום http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm עם מעמד LED היברידי C-LEDניקון, טוקיו, יפןSMZ-445
    https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 מערכת מיקרוסקופ הפוכהניקון, טוקיו, יפןEclipse Ti-Ehttps://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E
    איימס בינוניסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOA1420http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420
    חומצה L-גלוטמית (גלוטמט)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MOG5667
    http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזוריS8761
    http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 צלחת פטרי 60 מ"מ (גובה 10 מ"מ)Fischer Scientific, Waltham, MAFB0875713Aצלחת פטרי שקופה 60 מ"מ; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a
    Jewelers #5 ForcepsWorld Precision Instruments, סרסוטה, FL555227Fhttps://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/
    להב אזמל סטנדרטי #24מכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, פלורידה500247https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/
    ידית אזמל #4מכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, פלורידה500237https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/
    Vannas Tubingen Dissection מספרייםמכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, פלורידה503378
    https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ ערכת רשת ניילוןוורנר אינסטרומנטס, המדן, CTNYL / רשת
    https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 רשת פרוסות נבלALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYHSG-5ADhttp://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/
    Ag / AgCl התייחסות אלקטרודה גלולהמערכות רב ערוציות, GmbHP1060
    http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 4 ערוצים שסתום מבוקר מערכת זילוף כבידהALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYVC3-4xGhttp://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/
    מצלמת מיקרוסקופ Zyla 5.5 sCMOSAndor Technology, בלפסט, בריטניהZyla 5.5 sCMOShttp://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos
    חוט כסף (50 μ קוטר מ')Fischer Scientific, Waltham, MAAA44461G5https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5
    Tygon microbore Tubing (קוטר 1.6 מ"מ)Cole Parmer, Vernon Hills, ILEW-06419-01
    מחזיק כלי הטיה https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 עם צינוריתפלדהALA Scientific Instruments, Farmingdale, NYTILTPORTאחד מכל אחד מאלה שימש לזילוף ויניקה עליונים; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/
    Roscolux #26 גיליון מסנן אדום בהירRosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CTR2611יצרן: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux
    ספק: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html
    Smith & ווסון גלקסי פנס אדוםסמית & ווסון, שדרת רוזוולט 2100, ספרינגפילד, MA4588יצרן: https://www.smith-wesson.com/
    ספק: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588
    MC_Rack SoftwareMulti Channel Systems, GmbHMC_Rack
    http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack LabviewSoftware National Instruments, אוסטין, טקססLabVIEWhttp://www.ni.com/labview/
    NIS-Elements: תוכנת מחקר בסיסיתNikon, טוקיו, יפןNIS-Elements BRhttps://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research
    מכשירי,

    מקורות

    1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
    2. Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
    3. Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
    4. Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
    5. Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    6. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    7. Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    8. Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
    9. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
    10. Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
    11. Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
    12. Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
    13. Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
    14. Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
    15. Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
    16. Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
    17. Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
    18. Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239(2014).
    19. Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
    20. Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009(2013).
    21. Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002(2013).
    22. Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
    23. Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
    24. Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
    25. Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
    26. Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
    27. Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010(2015).
    28. Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505(2016).
    29. Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
    30. Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
    31. Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
    32. Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148(2014).
    33. Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
    34. Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
    35. Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
    36. Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
    37. Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
    38. Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
    39. Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
    40. The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    תגיות

    גירוי גלוטמטתאי גנגליון ברשתיתהזרקה באמצעות מיקרופיפטההתקן מיקרופלואידי רב-שעריםמערך מיקרו-אלקטרודות מנוקבהזרקה לחלל תת-רשתירשתית עם ניוון פוטורצפטוריםנוירוסטימולציה ביומימטיתטכניקת מיקרופיפטה מזכוכית
    מתודולוגיה Neuromodulation ביונים כימית של עכברוש הרשתיות עם ה עצבי גלוטמט במבחנה
    צרו קשר
    המליצו לספרייה

    פרטיות

    תנאי שימוש

    מדיניות

    זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.