Method Article

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

DOI:

10.3791/56650

⸱

June 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הריאות הוא מחלה עקשן טיפול קטלני זה הטרוגנית מבחינה ביולוגית. כדי להבין ולטפל ביעילות את הספקטרום קליניים מלאים של ממאירות בית החזה, בדגמי בעלי חיים נוספים ניתן לסכם סוגי סרטן מגוונות אמבריולוגיה ו בשלבים הדרושים. מודלים להשתלת או xenograft הם מגוונים ולאפשר כימות של קיבולת tumorigenic ויוו, באמצעות תאים ממאירים ממקור אנושי או מאתר. עם זאת, שיטות שתואר לעיל engraftment התא סרטן ריאות שנעשו באתרים שאינם-פיזיולוגיים, כגון האגף של עכברים, עקב חוסר היעילות של השתלת orthotopic של התאים אל הריאות. במחקר זה, אנו מתארים שיטה כדי לשפר orthotopic ריאות סרטן תא engraftment על-ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם bleomycin הסוכן inducing פיברוזיס. בתור ניסוי הוכחה הרעיון, אנחנו מוחלים בגישה זו כדי engraft בתאי הגידול של המשנה ריאות אדנוקרצינומה, המתקבל העכבר או מקורות אנושיים, לתוך זנים שונים של עכברים. נדגים כי ופצעו את דרכי הנשימה עם bleomycin לפני הזרקת תאי הגידול מגביר את engraftment של תאים סרטניים מ 0-17% ל- 71-100%. באופן משמעותי, שיטה זו משופרת שכיחות סרטן ריאות, תוצר עוקבות באמצעות מודלים שונים וללחצים העכבר. בנוסף, תאי סרטן ריאות engrafted להפיץ מהריאות אל איברים רחוקים הרלוונטיים. לכן, אנו מספקים פרוטוקול יכול לשמש להקים ולתחזק דגמים חדשים orthotopic של סרטן ריאות עם הגבלת כמויות של תאים או biospecimen, להעריך באופן כמותי את יכולת tumorigenic של סרטן ריאות תאים בהגדרות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הריאות הוא המוביל סיבת סרטן הקשורים מקרי מוות ברחבי העולם1. חולים עם סרטן ריאות נכנעים בסופו של דבר מן גרורות לאיברים מרוחקים, ובמיוחד אל מערכת העצבים המרכזית, כבד, בלוטות יותרת הכליה, עצמות-2,-3,-4. ממאירות בית החזה מסווגים באופן מסורתי כמו תאים קטנים סרטן הריאות (SCLC) או תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC)5. NSCLC הוא הכי קרובות אובחן גידול ממאיר, נחלקים תת היסטולוגית שונים, כולל ריאות אדנוקרצינומה (LUAD) וריאות קרצינומה של תאים קשקשיים (LUSC)6. אנליזה גנומית של סרטן הריאות העיקרית האנושי resected גי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת ייל.

1. קבע / הכנת נוגדנים.

  1. Bleomycin
    התראה: מבוסס על כללי ההרמונית מערכת (GHS) של סיווג, תוויות של כימיקלים, bleomycin מסווג כ סיכון בריאותי GHS08.
    1. להכין bleomycin בשכונה כימי. Resuspend 15 U לתוך מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS).
    2. Aliquot µL 100-200 של הפתרון לזכוכית שבקבוקי ומקפיאים ב-20 ° C לשימוש עתידי. תווית כראוי את הצינורות עם התאריך של resuspension. השתמש בתוך 6 חודשים מתאריך זה.
      הערה: כל המתח העכבר יש רגישות שונה bleomycin26. בדיקת מינונים שונים ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להגביר את היעילות של LUAD סרטן engraftment תא לריאות של עכברים, פיתחנו פרוטוקול קודם תנאים מראש את דרכי הנשימה באמצעות bleomycin ואחריו הזרקת תאי הגידול orthotopic (איור 1). אנחנו אישר כי גם כאשר מנוהל לתוך immunocompromised athymic עכברים, bleomycin המושרה פיברוזיס ארעי ביום 14 כפי שמעידים אובדן של דרכי הנשימה אדריכלות ומשקעים הקולגן מוגבר (איור 2). פיברוזיס ברוטו בעכברים אלו לפתור 50 ימים פוסט bleomycin הזרקה (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקבילות קליניים מרשימים תועדו בין סרטן ריאות ומחלות כרוניות אחרות של הריאה36. בפרט, חולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) יש לגבי מוגבר לפתח סרטן ריאות, עמותה זו היא עצמאית של עישון היסטוריה37,38. IPF מאופיין על ידי הרס מתקדם ריאות אדריכלות תפקוד לקוי במערכת הנשימה דרך בתצהיר של ECM39. בעקבות כריתה כירורגית, שלב מוקדם NSCLC חולים עם IPF בו-זמניות יש גם תוצאה עניים40. רוב הגידולים NSCLC מכי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן (R01CA166376 ו- R01CA191489 כדי D.X. נגוין) משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0227 כדי D.X. נגוין).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNזהירות סכנה בריאותית GHS08
Exel קטטר 24Gפישר1484121הסר מחט. להזרקה תוך-קנה
קטמין (קטסט inl 100 מ"ג/מ"ל C3N 10 מ"ל)באטלר שיין56344להרדמת עכברים
קסילזיןבאטלר שיין33198להרדמת עכברים
קטופרופן, 5,000 מ"גקיימן כימיקל10006661משכך כאבים
Puralube משחת עיניים וטרינריתBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897למניעת יובש בעיניים בזמן הרדמה
אבקת D-LuciferinPerkin Elmer Health Sciences Inc122799להדמיה זוהרת. להרכיב מחדש אבקה עם PBS לריכוז עבודה של 15 מ"ג/מ"ל. הגן מפני
מעמד אינטובציה של מכרסמיםBraintree ScientificRIS-100מעמד מומלץ להזרקה תוך קנה הנשימה
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823Mלהאיר ולדמיין קנה הנשימה
Graefe מלקחיים, 2.75 (7 ס"מ) ארוך סראטRobozRS-5111להזרקה תוך קנה הנשימה
מזרק Luer-Lok סטרילי 5 מ"לBD / פישר309646
סאטני חלק על ידי Conair נייר כסף כפול רטוב / יבש מכונת גילוח נטענתConair-Toגילוח
עכברים מספריים בון, 3.5 אינץ' ישר 15 מ"מ חד / חד להבים בטוחים חתוכיםRobozRS-5840SC
15 מ"ל צינור חרוטיBD / פישר352097
צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"לארה"ב מדעי בע"מ1615-5500
בקבוקון נצנוץ 7 מ"ל בורוסיליקט זכוכית GPIFisher701350
קצות פיפטה מסנן (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM High GlucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
סרום בקר עוברי USDALife Technologies10437-028
פניצילין-סטרפטומיציןLife Technologies15140-122
אמפוטריצין BסיגמאA2942-20ML
טריפן כתם כחול 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
בקבוק T/C 75 ס"מ צוואר מרובע, כובע כחולפישר / קורנינג353135
ספקטרום IVIS קסנוגן ביולומיניסקנספרקין אלמר מדעי הבריאות בע"מ124262עבור in vivo הדמיית ביולומינסנציה
תוכנת תמונה חיהPerkin Elmer Health Sciences Inc128113עבור in vivo ניתוח ביולומינסנציה
XGI-8 מערכת הרדמה גזPerkin Elmer Health Sciences Inc118918להרדמה איזופלורן
BD מזרק אינסולין מחט קצר במיוחד II 1 סמ"ק. 31 גרם x 8 מ"מ (5/16 אינץ')BD / פישרBD328418להזרקת לוציפרין רטרו-אורביטלית
מזרק 1 מ"לBD / פישר14-823-434לזריקות תוך צפקיות
26 גרם x 1/2 אינץ' מחטBD / פישר305111לזריקות תוך-צפקיות
4% פרפורמלדהידVWR43368-9Mזהירות סכנה בריאותית GHS07, GHS08. לקיבוע
רקמות Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
המטוקסילין של מאיירמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית517-28-2
כתם Eosin Y 0.25% (w/v) ב-57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome StainKit IMEB IncK7228עבור כתם טריכרום מאסון להדמיית קולגן
Superfrost בתוספת שקופיות זכוכיתפישר
צלחת 6 בארותCorningC3516
ערכת זיהוי מיקופלזמה אוניברסליתATCC30-1012K
OCT תרכובת הטמעהELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12להטמעת רקמה לחלקים קפואים
Leica CM3050 S מחקר CryostatLeicaCM3050 Sלרקמת חתך לניתוח
מכתיםמיקרוסקופ פלואורסצנטי Keyence All-in OneKeyenceBZ-X700
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 עבור Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
עכברים אתימיים (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)צ'ארלס ריברNIH-553
NSG (NOD. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)מעבדות ג'קסון5557
עכברי B6129SF1/Jמעבדות ג'קסון101043
תאי NIH-H2030ATCCCRL-5914
368T1מסופק בנדיבות על ידי מונטה ווינסלו (אוניברסיטת סטנדפורד)-
תאי PC9Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51–
תאי BrM3Nguyen DX et al. תא 2009; 138:51– 62-
קלים 17014411 1255015ב 62-H2030

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in a....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Orthotopic Lung CancerBleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

Related Articles