אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
סרטן הריאות הוא מחלה עקשן טיפול קטלני זה הטרוגנית מבחינה ביולוגית. כדי להבין ולטפל ביעילות את הספקטרום קליניים מלאים של ממאירות בית החזה, בדגמי בעלי חיים נוספים ניתן לסכם סוגי סרטן מגוונות אמבריולוגיה ו בשלבים הדרושים. מודלים להשתלת או xenograft הם מגוונים ולאפשר כימות של קיבולת tumorigenic ויוו, באמצעות תאים ממאירים ממקור אנושי או מאתר. עם זאת, שיטות שתואר לעיל engraftment התא סרטן ריאות שנעשו באתרים שאינם-פיזיולוגיים, כגון האגף של עכברים, עקב חוסר היעילות של השתלת orthotopic של התאים אל הריאות. במחקר זה, אנו מתארים שיטה כדי לשפר orthotopic ריאות סרטן תא engraftment על-ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם bleomycin הסוכן inducing פיברוזיס. בתור ניסוי הוכחה הרעיון, אנחנו מוחלים בגישה זו כדי engraft בתאי הגידול של המשנה ריאות אדנוקרצינומה, המתקבל העכבר או מקורות אנושיים, לתוך זנים שונים של עכברים. נדגים כי ופצעו את דרכי הנשימה עם bleomycin לפני הזרקת תאי הגידול מגביר את engraftment של תאים סרטניים מ 0-17% ל- 71-100%. באופן משמעותי, שיטה זו משופרת שכיחות סרטן ריאות, תוצר עוקבות באמצעות מודלים שונים וללחצים העכבר. בנוסף, תאי סרטן ריאות engrafted להפיץ מהריאות אל איברים רחוקים הרלוונטיים. לכן, אנו מספקים פרוטוקול יכול לשמש להקים ולתחזק דגמים חדשים orthotopic של סרטן ריאות עם הגבלת כמויות של תאים או biospecimen, להעריך באופן כמותי את יכולת tumorigenic של סרטן ריאות תאים בהגדרות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית .
מבוא
סרטן הריאות הוא המוביל סיבת סרטן הקשורים מקרי מוות ברחבי העולם1. חולים עם סרטן ריאות נכנעים בסופו של דבר מן גרורות לאיברים מרוחקים, ובמיוחד אל מערכת העצבים המרכזית, כבד, בלוטות יותרת הכליה, עצמות-2,-3,-4. ממאירות בית החזה מסווגים באופן מסורתי כמו תאים קטנים סרטן הריאות (SCLC) או תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC)5. NSCLC הוא הכי קרובות אובחן גידול ממאיר, נחלקים תת היסטולוגית שונים, כולל ריאות אדנוקרצינומה (LUAD) וריאות קרצינומה של תאים קשקשיים (LUSC)6. אנליזה גנומית של סרטן הריאות העיקרית האנושי resected גי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת ייל.
1. קבע / הכנת נוגדנים.
-
Bleomycin
התראה: מבוסס על כללי ההרמונית מערכת (GHS) של סיווג, תוויות של כימיקלים, bleomycin מסווג כ סיכון בריאותי GHS08.- להכין bleomycin בשכונה כימי. Resuspend 15 U לתוך מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS).
- Aliquot µL 100-200 של הפתרון לזכוכית שבקבוקי ומקפיאים ב-20 ° C לשימוש עתידי. תווית כראוי את הצינורות עם התאריך של resuspension. השתמש בתוך 6 חודשים מתאריך זה.
הערה: כל המתח העכבר יש רגישות שונה bleomycin26. בדיקת מינונים שונים ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להגביר את היעילות של LUAD סרטן engraftment תא לריאות של עכברים, פיתחנו פרוטוקול קודם תנאים מראש את דרכי הנשימה באמצעות bleomycin ואחריו הזרקת תאי הגידול orthotopic (איור 1). אנחנו אישר כי גם כאשר מנוהל לתוך immunocompromised athymic עכברים, bleomycin המושרה פיברוזיס ארעי ביום 14 כפי שמעידים אובדן של דרכי הנשימה אדריכלות ומשקעים הקולגן מוגבר (איור 2). פיברוזיס ברוטו בעכברים אלו לפתור 50 ימים פוסט bleomycin הזרקה (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מקבילות קליניים מרשימים תועדו בין סרטן ריאות ומחלות כרוניות אחרות של הריאה36. בפרט, חולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) יש לגבי מוגבר לפתח סרטן ריאות, עמותה זו היא עצמאית של עישון היסטוריה37,38. IPF מאופיין על ידי הרס מתקדם ריאות אדריכלות תפקוד לקוי במערכת הנשימה דרך בתצהיר של ECM39. בעקבות כריתה כירורגית, שלב מוקדם NSCLC חולים עם IPF בו-זמניות יש גם תוצאה עניים40. רוב הגידולים NSCLC מכי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן (R01CA166376 ו- R01CA191489 כדי D.X. נגוין) משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0227 כדי D.X. נגוין).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | זהירות סכנה בריאותית GHS08 |
| Exel קטטר 24G | פישר | 1484121 | הסר מחט. להזרקה תוך-קנה |
| קטמין (קטסט inl 100 מ"ג/מ"ל C3N 10 מ"ל) | באטלר שיין | 56344 | להרדמת עכברים |
| קסילזין | באטלר שיין | 33198 | להרדמת עכברים |
| קטופרופן, 5,000 מ"ג | קיימן כימיקל | 10006661 | משכך כאבים |
| Puralube משחת עיניים וטרינרית | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | למניעת יובש בעיניים בזמן הרדמה |
| אבקת D-Luciferin | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | להדמיה זוהרת. להרכיב מחדש אבקה עם PBS לריכוז עבודה של 15 מ"ג/מ"ל. הגן מפני |
| מעמד אינטובציה של מכרסמים | Braintree Scientific | RIS-100 | מעמד מומלץ להזרקה תוך קנה הנשימה |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | להאיר ולדמיין קנה הנשימה |
| Graefe מלקחיים, 2.75 (7 ס"מ) ארוך סראט | Roboz | RS-5111 | להזרקה תוך קנה הנשימה |
| מזרק Luer-Lok סטרילי 5 מ"ל | BD / פישר | 309646 | |
| סאטני חלק על ידי Conair נייר כסף כפול רטוב / יבש מכונת גילוח נטענת | Conair-To | גילוח | |
| עכברים מספריים בון, 3.5 אינץ' ישר 15 מ"מ חד / חד להבים בטוחים חתוכים | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 מ"ל צינור חרוטי | BD / פישר | 352097 | |
| צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל | ארה"ב מדעי בע"מ | 1615-5500 | |
| בקבוקון נצנוץ 7 מ"ל בורוסיליקט זכוכית GPI | Fisher | 701350 | |
| קצות פיפטה מסנן (200 μ L) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| סרום בקר עוברי USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Life Technologies | 15140-122 | |
| אמפוטריצין B | סיגמא | A2942-20ML | |
| טריפן כתם כחול 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| בקבוק T/C 75 ס"מ צוואר מרובע, כובע כחול | פישר / קורנינג | 353135 | |
| ספקטרום IVIS קסנוגן ביולומיניסקנס | פרקין אלמר מדעי הבריאות בע"מ | 124262 | עבור in vivo הדמיית ביולומינסנציה |
| תוכנת תמונה חיה | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | עבור in vivo ניתוח ביולומינסנציה |
| XGI-8 מערכת הרדמה גז | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | להרדמה איזופלורן |
| BD מזרק אינסולין מחט קצר במיוחד II 1 סמ"ק. 31 גרם x 8 מ"מ (5/16 אינץ') | BD / פישר | BD328418 | להזרקת לוציפרין רטרו-אורביטלית |
| מזרק 1 מ"ל | BD / פישר | 14-823-434 | לזריקות תוך צפקיות |
| 26 גרם x 1/2 אינץ' מחט | BD / פישר | 305111 | לזריקות תוך-צפקיות |
| 4% פרפורמלדהיד | VWR | 43368-9M | זהירות סכנה בריאותית GHS07, GHS08. לקיבוע |
| רקמות Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | ||
| המטוקסילין של מאייר | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 517-28-2 | |
| כתם Eosin Y 0.25% (w/v) ב-57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain | Kit IMEB Inc | K7228 | עבור כתם טריכרום מאסון להדמיית קולגן |
| Superfrost בתוספת שקופיות זכוכית | פישר | ||
| צלחת 6 בארות | Corning | C3516 | |
| ערכת זיהוי מיקופלזמה אוניברסלית | ATCC | 30-1012K | |
| OCT תרכובת הטמעה | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | להטמעת רקמה לחלקים קפואים |
| Leica CM3050 S מחקר Cryostat | Leica | CM3050 S | לרקמת חתך לניתוח |
| מכתיםמיקרוסקופ פלואורסצנטי Keyence All-in One | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות בארה" | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 עבור Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | - | |
| עכברים אתימיים (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) | צ'ארלס ריבר | NIH-553 | |
| NSG (NOD. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) | מעבדות ג'קסון | 5557 | |
| עכברי B6129SF1/J | מעבדות ג'קסון | 101043 | |
| תאי NIH-H2030 | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | מסופק בנדיבות על ידי מונטה ווינסלו (אוניברסיטת סטנדפורד) | - | |
| תאי PC9 | Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51– | ||
| תאי BrM3 | Nguyen DX et al. תא 2009; 138:51– 62 | - |
מקורות
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in a....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
