יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

Abstract

לימפוציטים מסוג T לעסוק מהירה, מקוטב איתות, המתרחשים בתוך דקות לאחר הפעלת TCR. זה גורם להיווצרות הסינפסה חיסוניות, צומת הסטראוטיפי תא-תא זה מווסת את תא T הפעלה ויעדים directionally אפקטור תגובות. ללמוד ביעילות של תהליכים אלה, נחוצה גישה הדמיה המותאם לתפיסת תגובות מהר, מקוטב. פרוטוקול זה מתאר מערכת כזו, אשר מבוססת על photoactivatable פפטיד-מייג'ר histocompatibility מורכבים (pMHC) זה שאינו מופחתים עד חשוף לאור אולטרה סגול. Decaging יישוב של ריאגנט הזה במהלך הניסויים videomicroscopy מאפשר שליטה ייתכן מדויקת של הפעלת TCR וניטור ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר עוקבות מאת גמורה (TIRF) הדמיה. גישה זו מתאימה גם אסטרטגיות ההפרעות גנטיות ולא תרופתי. דבר זה מאפשר ההרכבה של מסלולים מולקולריים מוגדרים היטב לקשר TCR איתות היווצרות המבנים cytoskeletal מקוטב העומדים בבסיס הסינפסה אימונולוגי.

Introduction

T לימפוציטים (T תאים) לשחק תפקיד מרכזי חסינות תאית על ידי זיהוי פפטידים antigenic מוצג בהקשר של תא השטח MHC. זיהוי אנטיגן, אשר מתווך על ידי TCR, מניע את הבידול של תמים T תאים ומעודדת המסירה של התגובות cytolytic וקומוניקטיבי אפקטור אוכלוסיות. TCR האירוסין גורם גם שינויים דרמטיים אדריכלות הסלולר. בתוך דקות, תאי T אני מטפל לצד של התא אנטיגן (APC), ויצרו ממשק מקוטב המכונה סינפסה אימונולוגי (IS)^1,2. IS potentiates תא T אפקטור תגובות על-ידי הפעלת שחרור כיוונית של ציטוקינים או, במקרה של לימפוציטים T ציטוטוקסיות (Ctl), חלבונים lytic להרוס את APC.

TCR האירוסין מאת pMHC גורם זירחון מהירה של מ....

Protocol

1. הכנה של משטחי זכוכית מופחתים

1. המעיל. ובכן שמונה תאיים coverglass עם biotinylated פולי-L-ליזין (ביו-PLL) מדולל שבערך במים מזוקקים, יונים (ddH₂O). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
2. לשטוף עם H₂O.
3. היא יבשה 2 h-RT.
4. בלוק ביו-PLL מצופה משטחים עם מאגר חסימה (באגירה HEPES תמיסת מלח [10 מ מ HEPES pH 7.4, 150 מ מ NaCl], עם 2% BSA) במשך 30 דקות ב- RT.
   1. להמיס 5 מ"ג פולי-L-ליזין מנות ב- 1 מ ל 10 מ מ נאפו₄, pH 8.5.
   2. להוסיף μmol 125 (0.55 מ ג) של NHS-ביוטין (מתוך מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב דימתיל סולפוקסיד) ולבדוק את רמת החומציות של התגובה. אם ה-pH מתחת 8.5, להוסיף 2 μL של 4 N NaOH לגדל אותו....

Results

הגישה photoactivation ודימות מאפשר התבוננות נתיישב כימות של תגובות איתות מהירה, מקוטב. כדי להדגים את היכולות שלה, לשכפל הנה ניסוי בחינת המתאם ייתכן בין צבירה דאג TCR-induced ולהתפכחות centrosome. ג 5 תקיעות התא C7 T היו transduced retrovirally עם שני הכתבים פלורסנט: ביוסנסור דאג המכיל קבוצות המחשבים C1 טנדם מכל חלבון קינאז C-θ באמצעות מקושר GFP (C1-GFP) ו- RFP-טובולין כדי לנטר את centrosome. תאי T צורפו אז אל תאיים coverglass המכיל photoactivatable MCC-אני-E^k. C1-GFP צולמה באמצ.......

Discussion

בשנים האחרונות התפתחה אור כלי מצוין עבור הפעלה מבוקרת spatiotemporally של תהליכים תאיים. מתודולוגיות שונות פותחו, כל אחד עם המשויך יתרונות וחסרונות. המערכת המתוארת כאן, אשר מבוססת על decaging של ליגנדים קיבוע, חוץ-תאית, מתאימה באופן אידיאלי עבור הניתוח של תגובות איתות מהירה, subcellular, מקוטב. גישה זו הוחל לבחון הוא היווצרות בתאי T כפי שתואר לעיל. בנוסף, ליגנדים בכלוב על רצפטורים אחרים יש מהונדס, ומאפשרת לנו ליישם את האסטרטגיה אותה כדי להעריך מעכבות איתות תאי הרג טבעיים, רוברטסונית הגרעין של הגורם שעתוק NF-κB בתגובה על .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
פולי-L-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'	P2636	יצטרך לייצר ביוטינילציה פולי-L-ליזין
EZ-Link NHS-ביוטין	Thermofischer Scientific	20217	יצטרך להפוך את ביוטינילציה פולי-ליזין
סטרפטווידין	תרמופישר מדעי	434301
BirA-500: ערכת תגובה סטנדרטית של חלבון ביוטין ליגאז	של BirA Avidity	BirA500	תשמש לביוטינילציה של חלבונים
ביוטינילטים Hb E-EK			לקיפול חלבון, ראה התייחסות 6. לביוטינילציה, יש להשתמש בערכת BirA
NPE-MCC I-EK  ניתן לרכוש	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) מ-Anaspec
Biotinylated α נוגדן H2-Kk	נוגדן BD Biosciences	553591
ביוטינילציה NPE-OVA H2-KbAnaspec			Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) ניתן לרכוש מ-Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db		ניתן לרכוש חלבון מסונתז מותאם אישית של Anaspec (KAVYDFATL) מ- Anaspec
			לקיפול חלבון, ראה הפניה בפרוטוקול. לביוטינילציה, השתמש בערכת BirA
מנורת UV ידנית	UVP	UVGL-25	מוחזקת < 1 ס"מ מהמדגם.  30 שניות של 365 אור מספיקות לזיהוי, 20 דקות לניקוי כמותי.
מערכת אולימפוס IX-81 OMAC TIRF.	אולימפוס		מידע נוסף על מערכת ההדמיה ניתן למצוא בכתובת איור 6
Mosaic דיאפרגמה דיגיטלית	Andor
Slidebook תוכנה	חידושי