בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי

Summary

השכיחות של השמנת יתר עולה ומגבירה את הסיכון של מחלות ריאה כרונית. להקים את המנגנונים שבבסיס ואת אסטרטגיות מניעה, חיה מוגדרים היטב דרושים מודלים. כאן, אנו מספקים שלוש שיטות (גלוקוז-סובלנות-בדיקה, הגוף plethysmography של הריאה קיבוע) לחקור את ההשפעה של השמנת יתר על תוצאות ריאתי בעכברים.

Abstract

השמנת יתר בעיות נשימה בעיות בריאות קשות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. השמנת יתר הופכת למגיפה המתעוררים עם מספר הצפוי של מעל 1 מיליארד אנשים שמנים ברחבי העולם 2030, ובכך המייצג נטל חברתי-כלכלי הולך וגדל. במקביל, הקשורות להשמנת יתר מחלות רקע, כולל סוכרת, כמו גם מחלות ריאה כרוניות, והלב הם ברציפות בעלייה. למרות ההשמנה נמצא קשור לסיכון מוגבר עבור אסטמה exacerbations, החמרה של תסמינים נשימתיים, ושליטה המסכן, תפקיד פונקציונלי השמנה וחילוף החומרים מודאג בפתוגנזה של מחלת ריאות כרונית היא לעתים קרובות underestimated, ולהישאר המנגנונים המולקולריים שבבסיס חמקמק. מאמר זה שואף להציג את השיטות כדי להעריך את ההשפעה של השמנת יתר על חילוף החומרים, כמו גם ריאות מבנה ותפקוד. כאן, אנו מתארים שלוש טכניקות ללימודי עכברים: (1) ובחינת בקרום הבטן גלוקוזה (ipGTT) כדי לנתח את השפעת השמנת יתר על חילוף החומרים של הגלוקוז; (2) מידת ההתנגדות דרכי הנשימה (במיל ') ותאימות מערכת הנשימה (Cdyn) כדי לנתח את השפעת השמנת יתר על תפקוד הריאות; (3) אופן ההכנה, קיבוע של הריאה להערכת היסטולוגית כמותיים הבאים. מחלות ריאה הקשורים להשמנה הם כנראה multifactorial, הנובעות מערכתית dysregulation דלקתיות וחילוף זה פוטנציאל לרעה על תפקוד הריאות ואת התגובה לטיפול. לכן, מתודולוגיה מתוקננת ללמוד המנגנונים המולקולריים ואת השפעת טיפולים חדשניים חיוני.

Introduction

על-פי ארגון הבריאות העולמי (WHO) בשנת 2008, יותר מ- 1.4 מיליארד מבוגרים, בגילאי 20 ומעלה, היו בעלי משקל עודף עם מדד מסת הגוף (BMI) גדול או שווה ל- 25; יתר על כן, יותר מ-200 מיליון אנשים, כמעט 300 מיליון נשים היו שמנים (BMI≥30)¹. השמנת יתר תסמונת מטבולית גורמי סיכון עיקריים עבור מספר רב של מחלות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בעוד השמנת יתר, והמצוות מוגברת שומן לבן מסה בצורה אינטימית נקשר הקלד^2,2 סוכרת³, מחלות קרדיו-וסקולרית, כולל מחלת לב כלילית (CHD), אי ספיקת לב (HF), פרפור פרוזדורים⁴ דלקת מפרקים ניוונית⁵, תפקידיהם פונקציונלי בפתוגנזה של הפרעות נשימה נשארים ממעטים להבין. עם זאת, מחקרים אפידמיולוגיים הדגימו כי השמנת יתר הוא קשור מאוד עם נשימה כרוניות, כולל exertional קוצר נשימה, תסמונת דום נשימה בשינה חסימתית (OSAS), השמנת יתר hypoventilation תסמונת (OHS), כרונית מחלת ריאות חסימתית (COPD), תסחיף ריאתי, שאיפה דלקת ריאות, אסטמה^6,7,8,9. מנגנונים פוטנציאליים קישור השמנה וחילוף החומרים מודאג, למשל, עמידות לאינסולין ועל סוג סוכרת II, בפתוגנזה של מחלת ריאות כרונית לא רק מהווים ההשלכות מכני והפיזי של משקל רווח אלא גם אוורור זירוז של המדינה דלקתית כרונית subacute^10,11. עלייתו של השמנת יתר, מחלות ריאה בעשור האחרון, יחד עם העדר אסטרטגיות מניעה אפקטיביות וגישות טיפוליות, מדגיש את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים להגדרת דרכים חדשות כדי לנהל ריאות הקשורות להשמנת יתר מחלות.

כאן, אנו מתארים שלוש בדיקות תקן, אשר הם יסודות חשוב לחקור ההשמנה והשפעתה על ריאות מבנה ותפקוד במודלים של העכבר: גלוקוז (1) בקרום הבטן סובלנות (ipGTT) (2) מדידה של דרכי הנשימה ההתנגדות (במיל '), מערכת הנשימה תאימות מערכת (Cdyn); (3) אופן ההכנה, קיבוע של הריאה להערכת היסטולוגית כמותיים הבאים. IpGTT הוא מבחן הקרנה חזקה כדי ספיגת הגלוקוז מידה, ולכן ההשפעה של השמנת יתר על חילוף החומרים. הפשטות של השיטה מאפשרת סטנדרטיזציה טוב, ולכן את comparability של תוצאות בין מעבדות. שיטות מתוחכמות יותר, כמו מלחציים hyperglycemic או מחקרים על איים מבודדים, יכול לשמש לניתוח מפורט של פנוטיפ מטבולית¹². כאן נוכל להעריך גלוקוזה להגדרת מצב הקשורים להשמנה של הפרעה מערכתית וחילוף כבסיס ללימודי על תוצאה ריאתי. כדי להעריך את ההשפעה של השמנת יתר, הפרעות מטבוליות על תפקודי ריאה, מדדנו התנגדות דרכי הנשימה (במיל ') ותאימות מערכת הנשימה (Cdyn). לאפיון מחלות ריאה, שיטות ערככם וכן מאופקת עבור הערכה של תפקוד הריאות הינם זמינים. Plethysmography ערככם במעבר בחופשיות חיות מחקה מצב טבעי, המשקף את דפוסי נשימה; לעומת זאת, שיטות פולשניות, כגון מדידת עכבת Res, cDyn בעכברים עמוקות ומורדמת ולהעריך מכניקת ריאות דינמי, הן מדויקות יותר¹³. מאז כרוניות בדרכי הנשימה משתקפים על ידי שינויים היסטולוגית של רקמת הריאה, ריאות תקין קיבוע לצורך ניתוח נוסף הוא בלתי נמנע. הבחירה של השיטה של קיבוע הרקמה והכנות תלוי התא של הריאה אשר להילמד, לדוגמה, ניצוח איירווייז או parenchyma הריאה¹⁴. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת הערכה כמותיים של דרכי הנשימה ניצוח לחקור את ההשפעה של השמנת יתר על פיתוח אסטמה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים אושרו על ידי רשויות מקומיות (קרקע NRW, AZ: 2012.A424), היו בהתאם לחוק הגרמני רווחת בעלי חיים והתקנון על רווחתם של בעלי החיים שבהם משתמשים עבור ניסויים או למטרות מדעיות אחרות. מאז ניתוח תפקוד הריאות עלולה להשפיע על מבנה הריאות ומנתח הבאים ולכן היסטולוגית, מדידת Res Cdyn, הכנה ואת קיבוע של הריאה עבור histomorphometry צריכה להתבצע בבעלי חיים שונים. עם זאת, מדידה של מיל ו- Cdyn בעקבות ipGTT אפשרי. מאז מתח במהלך ipGTT עלולה להפריע בהרדמה לצורך תפקוד הריאות בדיקות, תקופת ההחלמה כשבועיים לאחר ipGTT מומלץ לאפשר עכברים להתאושש ירידה במשקל הגוף ושינוי פרמטרים דם¹².

1. הכנה בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן (ipGTT)

הערה: לאחר 12 שעות של צום, ipGTT השלם לוקח כ 2 h.

1. מאז הלחץ משפיע על רמת הסוכר בדם באופן משמעותי, ודא כי שני התאקלמות של עכברים, כמו גם הכשרה של המדען, מבוצעות.
2. העברת החיות לאזור הניסוי בתנאים שקטה ורגועה.
3. שקול את היישום של דיאטה hypercaloric לזירוז השמנת יתר בעכברים. עיין בסעיף הדיון לייעוץ נוסף.
4. חיות מהירות של 12 שעות בין לילה, מבלי להגביל גישה למים. למחרת, לאחר 12 שעות של צום, הכנת מד הסוכר הדם על פי היצרן של פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הוספת ציור נסיון החדשות ליציאת רצועת הבדיקה.
5. פצעים וחתכים בקצה הזנב באמצעות מספריים סטרילי, תוך שמירה על העכבר על זנבו, בעדינות, מיד למדוד את רמת הסוכר בדם התענה על-ידי החלת טיפה דם זורמת (מינימום מדגם בגודל 0.5 µL) רצועת הבדיקה של מד גלוקוז בדם.
   הערה: טיימר מתחיל על המסך לאחר יישום מספקת דגימת הדם. לאחר 4 s, תוצאת הבדיקה מופיעה על המסך.
6. לאחר מכן, שוקל, תווית החיות בנפרד באמצעות צבע סימון.
7. לנהל דור 2 גלוקוז/ק"ג גוף במשקל באמצעות בקרום הבטן הזרקה. ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם משקל (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק).
8. לאחר מכן, למדוד רמת הסוכר בדם אחרי 15, 30, 60, 120 דקות על-ידי החלת טיפת דם זורמת למפצל מבחן חדש.
   הערה: זרימת הדם יכול להיות מוגברת על ידי עיסוי עדין של המחלקות הקצה הזנב. אם הפצע זנב encrusts, נקה אותו באמצעות מקלון סטרילי ספוגה פתרון נתרן כלוריד 0.9%.
9. לאפשר את החיות לנוח בכלובים שלהם הביתה עם גישה בלתי מוגבלת למים בין המדידות.

2. ריאות ניתוח פונקציה מדידה Res, cDyn

הערה: למדידה ללא הפרעה בין Res cDyn, עכברים צריך להיות מאוורר תחת הרדמה עמוקה. נטולת מתחים לטיפול בבעלי חיים, פיקוח נאות של הרדמה חיוניים. לקבלת הוראות כלליות תוך שימוש בטכניקות סטריליות, נא עיין במאמר על-ידי Hoogstraten-מילר. et al. ¹⁵

1. לכייל את היא תגלה לפני כל קבוצה של ניסויים ולהכין את ההגדרות מחקר בתוך התוכנה (ראה טבלה של חומרים).
2. לפני הניתוח, עמוק עזים ומתנגד חיות דרך בקרום הבטן הזרקה של חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק). ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
   הערה: מאז קטמין יש אפקט כאבים נאות בעכברים, אין טיפול כאב נוסף הכרחי. הליך פולשני והכו אותי קטטר/היא תגלה אורכת כ- 5-7 דקות, ולאחר מכן הנתונים יכול להתחיל.
3. הנח את העכבר במצב פרקדן על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
4. מכסים את העיניים עם משחה למניעת יובש תחת הרדמה.
5. כל הזמן לפקח על העומק של הרדמה באמצעות הבוהן קמצוץ-התגובה.
   הערה: ממשל נוספים של הרדמה ייתכן הדרוש לשמירה על מטוס כירורגי של הרדמה.
6. להרטיב את הפרווה של האזור כירורגי באזור בלוטת התריס עם 70% אתנול.
7. בזהירות פצעים וחתכים האמצע עבור 1 ס מ בין החריץ צוואר של עצם החזה symphyses פקעת של mentum העור באמצעות הרמת אותו עם מלקחיים חיתוך העור תחת בדיקה ויזואלית באמצעות מספריים בוטה (איור 1 א').
8. דמיינו את רקמת השומן התת עורית הבסיסית ואת בלוטת התריס.
9. חושפים את קנה הנשימה על ידי בקפידה בוטה המפריד בין שתי אונות בלוטת התריס מצר, דיסקציה של sternothyroid ושל sternothyroid השרירים (איור 1B). להיזהר לא לפגוע בכל כלי, לגרום לדימום, מאחר שהדבר עלול לגרום השפעות שליליות על מערכת הלב וכלי הדם, ובסופו של דבר על המדידות.
10. לאחר מכן, תעביר בתפר כירורגי קלועה 4-0 בין הנשימה לבין הוושט באמצעות מלקחיים בוטה. בזהירות פצעים וחתכים קנה הנשימה קרוב הגרון בין הסחוסים והכו אותי עם מספריים מיקרו.
11. לצנרר עם צינור הנשימה (0.04 אינץ/1.02 מ"מ קוטר) תחת שליטה ויזואלית (איור 1C). לתקן את הצינור דרך מצדו עם תפירה כדי למנוע נזילה במערכת.
12. הבא, להעביר את החיה המיטה מחוממת של גוף התא, לחבר את הצינור בקנה הנשימה לצלחת הפנים (איור 1D) והפעל האוורור על-ידי לחיצה על כפתור אוורור בלוח הקדמי של הבקר (איור 1E).
13. סקר האוורור על ידי התבוננות את תנועת בית החזה contemporaneously עם קצב האוורור. כדי לאשר השמה נכונה של הצינור בקנה הנשימה, ודא כי שני הצדדים של בית החזה להעביר בו זמנית.
14. . שימו לב ללחץ אות על מסך המחשב (איור 1F). ודא עקומות אוורור אחיד. אם זה לא המקרה, לנתק את החיה, נבדוק את הצד ניתוח. היזהרו דם או ליחה חוסמת את הצינור בקנה הנשימה.
    הערה: לבעלי-חיים למבוגרים עם משקל הגוף של 20-25 גרם, ההגדרות הנשמה כמודגם באיור 2 הם הציעו בהתאם להמלצות היצרן.
15. כדי לשלוט שינויי הלחץ הטרנס-ריאות במהלך אוורור, הכנס של צינור הוושט (0.04 אינץ/1.02 מ"מ קוטר) לתוך הוושט בעומק המעריכה את הרמות של הריאות. תסתכל על המסך בעת הנחת הצינור. במקום שבו לחץ מקסימלי סטיה וחפצים לב מינימלית ניתן לראות על המסך את הצינור.
16. לאחר הניתוח, להכין את החיה המדידה. מזריק הרדמה דרך בקרום הבטן הזרקה של קטאמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) באמצעות מחט 27-G ו- 1 במזרק cc. ודא כי אמצעי האחסון הזרקת 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
    הערה: כדי להעריך hyperreagibility הסמפונות, nebulize בדיקת אתגור, אגוניסט קולטן מוסקריניים לא בררניים של מערכת העצבים הפאראסימפתטית, אשר גורם bronchoconstriction. חדרי קירור והקפאה מבוצעת בארבעה שלבים שונים (איור 3).
17. התחל ייבוא נתונים לפי הפרוטוקול manufacturer´s.
    הערה: התוכנה באופן אוטומטי המדריכים משתמשים בתהליך הרכישה.
18. למרוח את µL 10 ל- PBS (הרכב) מפוחים, ולהתחיל nebulization אחרי 5 דקות של והפיזיולוגי. לאחר מכן, בצע שלב התגובה של 3 דקות, בו נמדדים Res (cmH₂O/mL/s), cDyn (mL/cmH₂O). בסוף, לספק שלב ההתאוששות של 3 דקות החיה לפני nebulization הבא.
19. בצע את התוכנה על ידי יישום stepwise µL 10 של הגדלת ריכוזים של בדיקת אתגור (2.5 µL µg/10, µL µg/10 6.25 ו 12.5 µL µg/10) על ההנשמה.
20. לאחר כל המדידות בוצעו נרשמה, להקריב את החיה על ידי נקע בצוואר הרחם.

3. ריאות בידוד לניתוח Histomorphometric כמותית של עכברים בוגרים

1. עמוק עזים ומתנגד בבעלי חיים באמצעות בקרום הבטן הזרקה של חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף), קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) (27 G מחט, מזרק 1 סמ ק). אמצעי האחסון הזרקת צריך להיות 0.1 מ"ל/10 גרם לכל משקל גוף.
   הערה: כשמגיעים המדינה של ניתוח רגישות, ההכנה לוקח כ 5 דקות ולאחר מכן על ידי איבר זלוף, 30 דקות עבור קיבעון.
2. ברגע החיה הגיעה המדינה של ניתוח סובלנות (הבוהן שלילי קמצוץ-תגובה), לחטא את החיה עם 70% אתנול, לתקן את החיה על משטח הדבקה.
3. להקריב את החיה על ידי ניקוב לב ודימום. בקצרה, לפתוח את הבטן עם חתך המדיאלי דרך העור של הצפק באמצעות מספריים בוטה.
4. אתר המחלקות ראש הסרעפת של הכבד, ולאחר הפרד בזהירות את הכבד מהסרעפת.
5. עושים חתך קטן בתוך הסרעפת שימוש במספריים קהים, punctate החדר השמאלי של הלב עם מחט 20 גרם המצורפת מזרק 2-mL. לאט לאט תדמם החיה.
   הערה: דימום למוות איטי וזהיר חשוב למניעת החדרים קורסת בשל הלחץ השלילי, עיכוב של זרימת הדם ללא הפרעה.
6. לנתח את הריאה על ידי פתיחת בית החזה בעדינות דרך חתך מתחת לכל אורכו של כלוב הצלעות באמצעות מספריים מעוגלים, בוטה.
7. לאחר מכן, הרם את כלוב הצלעות לחשוף את חלל הצדר (איור 3C). להסיר את בלוטת התימוס כדי לראות את הלב והריאות.
   הערה: הזרקה אופציונלי של החדר הימני, ואחריו זלוף של מערכת כלי הדם בריאה עם PBS קר כקרח, ולאחר מכן עם פתרון מקבע [למשל, 4% (מסה/נפח) paraformaldehyde (PFA)] אפשרי. דע כי יש סיכון מוגבר לקרע septae מכתשי, להשפיע לרעה על מבנה הריאות באמצעות שיטה זו.
8. לנתח את הריאה על ידי הראשון בזהירות להסיר את הלב.
9. לאחר מכן, תעביר בתפר כירורגי קלועה 4-0 בין הנשימה לבין הוושט באמצעות מלקחיים בוטה.
10. בשלב הבא, בזהירות פצעים וחתכים קנה הנשימה קרוב הגרון בין הסחוסים והכו אותי לצנרר עם בצינורית תוך ורידי (26 גרם), לנפח הריאה על ידי לחץ קיבעון, בלחץ קבוע של 20 ס מ H₂O באמצעות הסוכן מקבע [למשל, 4% (מסה /volume) של כדורגלן].
11. עבור כדורגלן קיבעון, להשאיר את מקבע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מאתרים ומפסיקים את קנה הנשימה ולהסיר את הצינורית. לאחר מכן, לסלק את הריאה בזהירות מבלי לפגוע הרקמה, לאחסן אותו לשבועיים סוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: לחלופין, על-פי ATS/החוצנים קונצנזוס נייר 2.5% GA buffered OsO4, אורציל פתרון משמש לייצוב הרקמה הנכונה. הכנה נוספת רקמות, ראית את העיתון הסכמה מאת Hsia. et al. ¹⁴

Results

נציג תוצאות של בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן (ipGTT) (איור 4), ריאות פונקציה מבחן (איור 5), נציג ותמונות הממחישות hematoxylin ואאוזין מוכתם הריאות (איור 6).

IpGTT בוצעה בעכברים שמנים (כחול) לאחר 7 שבועות של high-שומן-דיאטה (HFD). תקן דיאטה-fed עכברים שימש פקדים (שחור). העכברים המשמינים הראה סרום מוגברת גלוקוז רמות 15 עד 30 דקות לאחר ההזרק...

Discussion

דוח זה מספק שלושה פרוטוקולים עבור שלוש שיטות שונות לנתח את השפעת השמנת יתר על מטבוליזם הגלוקוז ותוצאות ריאתי. ראשית, הבדיקה סובלנות גלוקוז מציעה את ההזדמנות כדי לנתח את ספיגת הגלוקוז תאיים, יכול להיות מעיד על עמידות לאינסולין. שנית, כל הגוף plethysmography היא טכניקה כדי למדוד את תפקוד הריאות, ובכך מועיל לבדוק את יעילותם של טיפולים חדשניים. שלישית, פרוטוקול קיבוע מתוקננת חיוני לניתוח כמותי morphometric להעריך את ההשפעה של השמנת יתר על שינויים מבניים.

דיאטה-induced השמנת יתר מחקר בבעלי חיים

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen	LX A.Menarini, פירנזה, איטליה	38969	מד סוכר בדם
GlucoMen LX	חיישן A.Menarini אבחון, פירנזה, איטליה	39765	פסי בדיקה
גלוקוז 20%	B. בראון, מלסונג, גרמניה	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´ Hertogenbosch, הולנד	601-1831-002
FinePointe RC שולחן עכבר אתר יחיד	DSI, MC s´ הרטוגנבוש, הולנד	601-1831-001
בקר FPRC	DSI, MC s´ Hertogenbosch, הולנד	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´ Hertogenbosch, הולנד	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´ הרטוגנבוש, הולנד	601-2306-001
מלקחיים	FST, קולומביה הבריטית, קנדה	11065-07
מספריים קהים	FST, קולומביה הבריטית, קנדה	14105-12
מספריים מיקרו FST	, קולומביה הבריטית, קנדה	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, פורטו ריקו, ארה"ב	736H	תפר
כירורגיRoti-Histofix 4%Roth		P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, ברלין, גרמניה	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine