מאמר שיטה

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

6.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56728

⸱

30 במרץ 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Colby College

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

תקציר

השכבה aleurone של גרגרי שעורה היא מערכת מודל חשוב על ביטוי גנים מוסדר הורמון בצמחים. בתאים aleurone, גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המנגנון של GA ו ABA איתות יכולה להיחקר על ידי החדרת כתב ג'ין בונה לתאים aleurone באמצעות הפגזה של חלקיקים, עם ביטוי ארעי וכתוצאה מכך נמדד באמצעות מבחני אנזים. פרוטוקול משופר הוא דיווח זה חלקית הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון דגן, את מבחני אנזים, ומאפשר תפוקה יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות. המגון הדגימות תבואה מתבצעת באמצעות מהמגן רקמות אוטומטיות של, מבחני גאס (β-glucuronidase) מתבצעות באמצעות מערכת צלחת 96-ובכן. נציג תוצאות באמצעות הפרוטוקול מראים כי פעילות phospholipase D עשוי לשחק תפקיד חשוב ההפעלה של ביטוי גנים HVA1 על ידי ABA, דרך הפקטור שעתוק TaABF1.

מבוא

השכבה aleurone שעורה היא מערכת מודל ומבוססת על המחקר של ביטוי גנים מוסדר הורמון צמחי1. בפרט, יש מספר גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המשחק ואת ABA מסלולי איתות שלובים זה בזה, כפי הביטוי של גנים מסוימים מופעל GA מעוכבת על ידי ABA, ולהיפך1.

אסטרטגיה חשוב להבין שהתפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות כבר המבוא של בונה ג'ין אפקטור באמצעות הפגזה של חלקיקים, ואחריו הביטוי ארעית של בונה כתב לאפשר את האפקט המתקבל על ביטוי גנים במורד הזרם נקבע. השימוש של הכתב גנים כמו גאס (β-glucuronidase) או לוציפראז מאפשר את המדידה רגיש, תפוקה של ביטוי גנים במיוחד בתוך התאים, כי קיבלו הבונה אפקטור. לדוגמה, כניסתה של הבונה אפקטור קידוד של פקטור שעתוק TaABF15,6 הוקם כי ABA-induced גנים כגון HVA1 הם המושרה על-ידי TaABF1, תוך כדי משחק-induced גנים כגון Amy32b . מדוכאים. הפגזה של חלקיקים כמו אסטרטגיית ניסיוני שימש על ידי מעבדות מרובים כדי לחקור היבטים שונים של GA/ABA איתות. עבודה כל כך הוביל לזיהוי של יזם אלמנטים חשובים עבור ההפעלה של GA-induced2 וגם הגנים ABA-induced3, לגילוי של חלבונים kinases4 , תמלול גורמים5 המסדירים ביטוי של גנים אלה.

קיימים פרוטוקולים2,3,4,5,6 עבור חלקיקים הפגזה ומדידה עוקבות של ביטוי גנים ארעי הם די עמל רב, כמו כל קבוצה של מופגז בקושי גרגרים הוא הומוגני על ידי יד ומכתש, מבחני אנזים מבוצעות בנפרד. כתב יד זה מדווח על פרוטוקול משופרת זה הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון חלקית, מבחני גאס כדי לאפשר תפוקת יותר באופן משמעותי, המתיר מספר גדול יותר של טיפולים כדי שיהיה ניתן לבחון אותו אותו ניסוי, או הכללה של משכפל נוסף עבור כל טיפול להשיג תוצאות סטטיסטית חזקים יותר. נציג התוצאות יוצגו עבור הביטוי של בונה כתב HVA1 , Amy32b , מוסדר על ידי הגורם שעתוק TaABF1, כמו גם על ידי GA, ABA, מולקולות רגולטוריות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת אפקטור, מדווח בונה

  1. לבנות מבנים אפקטור כי מעסיקים מקדם מכוננת (למשל תירס אוביקוויטין, UBI) לביטוי נסיעה מן מסגרת קריאה פתוחה הרצוי. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל UBI::TaABF1 לביטוי מכוננת חזקה נסיעה של TaABF15.
  2. לבנות מבנים כתב הכוללים ייצוג המקדם הפעילות נועד למדוד, ממוקמים במעלה הזרם של מסגרת קריאה פתוחה, כמו גאס. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל HVA1::GUS כדי למדוד את הביטוי בין2,יזם HVA1 5.
  3. לבנות לבנות בקרה פנימית (למשל UBI::לוציפראז).
  4. באמצעות עמודת איגוד סיליקה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים), להכין פלסמיד באיכות גבוהה עבור כל אחד בונה הגן חובה. בעזרת ספקטרוסקופיית אולטרה סגול (ראה טבלה של חומרים), בקפידה למדוד את ריכוז כל הכנה פלסמיד.

2. הכנה של גרגרי שעורה הפגזה

  1. להגדיר את גיליון אלקטרוני (לקבלת דוגמה, ראה איור 1 ) המציין את פלסמידים זה תהיה מופגז, הטיפולים המתאימים הורמון, ומידע רלוונטי נוסף עבור כל טיפול זה יהיה חלק מהניסוי.
  2. באמצעות קרש חיתוך, סכין גילוח סטרילי, לחתוך את העוברים בין גרגרי שעורה ההימליה (40 הטיפול כלולה הניסוי). הכללת גרגרים דהוי או קטנים יותר באופן משמעותי מהממוצע.
  3. מניחים שכל הגרגרים embryoless לתוך צינור 50 מ. להוסיף 40 מ של מים, סלע במשך 10 דקות.
  4. שופכים את המים בזהירות (כדי להימנע מאובדן גרגרים) ולהוסיף 40 מיליליטר 10% מלבין. רוק במשך 20 דקות.
  5. שופכים את המלבין ולהוסיף 40 מיליליטר מים סטריליים. רוק למשך 5 דקות. חזור על זה לשטוף במים סטריליים ארבע פעמים נוספות.
  6. להוסיף 40 מ"ל של שתיית פתרון (succinate נתרן 20 מ מ, 20 מ מ סידן כלורי, pH 5.0) וμl 40 של פתרון מניות כלורמפניקול (10 mg/mL).
  7. להעביר את רוב הפתרון שתיית (עם כלורמפניקול) באמצעות הרכבת התחתית לתוך צלחת ורמיקוליט (ראה טבלה של חומרים). ואז להעביר את הגרגרים על גבי המשטח של נייר הסינון הרטוב בצלחת ורמיקוליט. שמתפזר הגרגרים. יציקת בפתרון imbibing מספיק כדי לשמור על הגרגרים חלקית (אבל לא לגמרי) במים. מקם את המכסה על גבי הלוח ורמיקוליט.
  8. דגירה החיטים embryoless ב 24 מעלות צלזיוס במשך כ- 48 שעות עם תאורת פלורוסנט. להוסיף פתרון שתיית נוספים לפי הצורך.
  9. להיפתח 90 מ מ פלסטיק פטרי, שופכים 20 מ של פתרון שתיית לתוך המנה עצמה, 20 מ"ל לתוך המכסה הפוך. להוסיף כל אחד μL 20 כלוראמפניקול (10 mg/mL). לעקר את שני זוגות של הצבע בסדר מלקחיים בטבילת אותם באלכוהול.
  10. מניחים כמה מן החיטים embryoless המכסה של הפטרי. עם המלקחיים, להסיר בעדינות קליפת הזרע (שקוף) כל גרגיר. בעת הסרת קליפת הזרע מן הצד חלקה של התבואה, לא לפגוע בתאים (aleurone) המשמש כבסיס. להעביר את התבואה קלופים הפטרי הכוללת שתיית פתרון.
  11. לאחר קילוף קליפת הזרע מכל הגרגרים, להחזיר אותם לצלחת ורמיקוליט. תקופת דגירה החיטים embryoless קלופים ב 24 ° C של 16-20 שעות.
  12. רק לפני השימוש הגרגרים עבור הפגזה, להסיר לחות משטח ע י ניעור אותם בין מסנן המסמכים בצלחת פטרי.

3. הכנה של פלסמיד DNA עבור הפגזה

  1. תווית צינור 1.5 mL עבור כל טיפול זה ייכלל הניסוי הפגזה. כדי כל שפופרת להוסיף 2.5 µg של UBI::לוציפראז בקרה פנימית פלסמיד, µg 2.5 פלסמיד כתב גאס , את הסכום הרצוי (בדרך כלל 0.025 µg כדי 2.5 µg) של פלסמיד אפקטור. מוסיפים מים כדי להביא את הנפח הכולל 5 µL.
  2. להכין 1.6 מיקרומטר זהב microcarriers (ראה טבלה של חומרים) בעקבות פרסום הפרוטוקולים6.
  3. עבור כל טיפול, להוסיף 50 µL של microcarriers על תנאי לתוך הצינור 1.5 mL המכילה DNA פלסמיד. מעיל של microcarriers עם פלסמיד הדנ א על פי פרוטוקולים של היצרן6.
  4. בשלב הסופי, כאשר microcarriers מצופים פלסמיד מושעים 48 µL 100% אתנול, pipet 8 μL של microcarriers על תנאי על גבי כל אחד חמש macrocarriers ולאפשר להם לאוויר יבש.

4. חלקיקים הפגזה של גרגרי שעורה Embryoless

  1. להרכיב את המערכת הפגזה של חלקיקים (ראה טבלה של חומרים)6.
  2. להכניס דיסק קרע 1550 psi בתוך הכיפה שהגנו והר אותה על המכשיר.
  3. המקום של macrocarrier המכילה את השילוב הרצוי פלסמיד (יחד עם מסך עצירה) לתוך מכלול ההשקה microcarrier. הכנס את מכלול לתוך החריץ העליון של התא הפגזה. קבעו את המרחק בין הדיסק קרע שמירה, פקקי מכסה כיסוי macrocarrier ממרחק סטנדרטי (6 מ מ), ולמקם את תמיכת מסך עצירה במיקום האמצעי (רגיל), המאפשר מרחק הנסיעה macrocarrier של 11 מ"מ (איור 2 א).
  4. לסדר את גרגרי embryoless 8 בדפוס רדיאלי חזק (עם מסתיים רזה הצבעה פנימה) על עיגול נייר סינון מודבקת למטה שטוח המכסה של צלחת פטרי 90 מ מ (ראה איור 2B).
  5. מקם את המנה עם הגרגרים אל החדר הפגזה, במרחק של 6 ס מ מן המסך עצירה.
  6. לפנות את החדר הפגזה 95 kPa, ואז להפציץ את הדגימה.
  7. לאחר שחרור האבק, להעביר החיטים bombarded צלחת פטרי עם תוויות 60 מ מ המכיל 4 מ"ל של שתיית פתרון המכיל 1 מ ג/מ ל כלורמפניקול.
  8. חזור עד כל הפגזות הושלמו. דגירה (על פלטפורמה חזק 100 סל"ד) ב 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

5. החילוץ של חלבון מסיס מן החיטים Bombarded

  1. באמצעות מלקחיים, להסיר את החיטים bombarded 8 צלחת פטרי 60 מ מ, למחוק אותם יבש על מגבת נייר. לחלק את הגרגרים mL 2.0 שכותרתו שני צינורות (4 גרגרים למחזור) שכל אחד מהם מכיל 800 μL טחינת מאגר (100 מ מ נה פוספט pH 7.2, 5 מ מ DTT, 10 leupeptin µg/mL, גליצרול 20%) וחרוז נירוסטה 5 מ מ. חזור על תהליך זה עבור כל הדגנים מופגז.
  2. להכניס צינורות 2.0 mL (עד 48) בתוך המדפים שני של מהמגן חרוז (ראה טבלה של חומרים). הר המדפים על מהמגן.
  3. לנער את הדגימות ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
  4. להסיר את המדפים מהמגן מהמגן ולמקם אותם על קרח (5 דקות) מחדש לצנן את הדגימות.
  5. הר המדפים על מהמגן - בכיוון ההפוך. לנער את הדגימות שוב ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
  6. מגניב המדפים על קרח, ואז חזור על צעדים 5.3 ל 5.5. זה יוסיף סך של 12 דקות של טלטול.
  7. Centrifuge תמציות דגן ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  8. מיד לאחר צנטריפוגה, decant את supernatants ברור לתוך קבוצה שנייה של microcentrifuge צינורות. לתת כל שפופרת מערבולת מהירה. לאחסן הצינורות על קרח.
  9. לאחר העברת את תגובת שיקוע, לשחזר את החרוזים פלדה כדורי אז הם יכולים להיות שטופים לעשות בה שימוש חוזר.

6. מדידת פעילות לוציפראז מן התבואה תמציות

  1. לכל שפופרת של תבואה תמצית כדי להיות לבדיקה, להכין 12 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית מבחנה המכילה 200 μL תערובת Assay לוציפראז (45 מ מ טריס חומצה גופרתית pH 7.7, 15 מ מ MgCl2, 20 מ מ DTT, 1.5 mM EDTA, luciferin 1 מ מ, 1 מ מ ATP).
  2. להוסיף 100 μL של תמצית תבואה הראשון הצינור assay הראשון. מערבולת במהירות כדי לערבב היטב. מיד למקם את הצינור לתוך צינור האוחז luminometer וסגור את הדלת. עם סיום המדידה, הסר את הצינורית luminometer – השארת הדלת פתוחה עבור מיקום של הצינור הבא.
  3. חזור על תהליך זה עד כל הדגימות נמדדו.

7. מדידה של גאס פעילות של תמציות של דגנים

  1. להוסיף 200 μL גאס Assay מאגר (50 מ מ נה פוספט pH 7.2, 2.5 מ מ 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 מ מ DTT, 2 מ מ EDTA, leupeptin µg/mL 10, 20% מתנול, אזיד הנתרן 0.02%) כל טוב של צלחת טוב 96.
  2. במקום 50 μL של כל גרגיר לחלץ לתוך המתאימה היטב. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. חותם העליון עם איטום הסרט.
  3. תקופת דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך של 20 שעות.
  4. Centrifuge את הצלחת היטב 96 ב g 4,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומניחים אותו על קרח.
  5. להוסיף 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 כל טוב של צלחת טוב שחור 96.
  6. להוסיף 6.25 μL של כל תערובת assay גאס centrifuged המתאימה טוב (המכיל 0.2 מ' נה2CO3) של השחור 96 טוב צלחת. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. לכלול וולס עם μL 6.25 μM 10, 40 μM ו 100 μM 4-methylumbelliferone כמו סטנדרטים.
  7. למקם את הלוח השחור fluorometer צלחת ולקרוא את זריחה של methylumbelliferone. קח את הקריאות-גל עירור של 360 ננומטר, אורך גל של פליטה של 460 ננומטר. להגדיר את הרווח של המכשיר כך על μL טוב המכיל 6.25 של 4 μM 40-methylumbelliferone 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 מאפשר קריאה של 1000 יחידות קרינה פלואורסצנטית.

8. ניתוח נתונים

  1. הזן את הערכים עבור לוציפראז ו גאס מבחני לתוך גיליון אלקטרוני. אל תכלול התייחסות דוגמה עם קריאת לוציפראז נמוך יותר מאשר הפריה חוץ גופית יחסית 20,000 יחידות s-1, כי זה מצביע על כי המבנה ג'ין לא בהצלחה נשלחו אל תאי aleurone.
  2. עבור כל גרגיר בהצלחה bombarded לחלץ (ייצוג קבוצה של ארבעה גרגרים embryoless), לחשב את הביטוי גאס מנורמל מתוך הנתונים הגולמיים גאס ואני לוציפראז כדלקמן: מנורמל גאס = [(ביטוי גאס - גאס ריק) x (2,000,000)] / (לוציפראז ביטוי – לוציפראז ריק).
    הערה: זה מווסת את כמות הפעילות גאס מה נצפו בהפגזות שנתן קריאה לוציפראז של 2,000,000.
  3. דווח על הרמה היחסית של ביטוי של מבנה כתב מסוים בנוכחות אפקטור בונה או טיפולים בהורמון נבדק על ידי השוואת לרמה של הביטוי בהיעדרו של effectors או הורמונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן להציג לבנות גן בכל מבחן לתוך התאים aleurone של גרגרי שעורה. רמת הביטוי של הגן הבדיקה ואז הוא יהיה נוח נמדד (איור 2). פרוטוקול תפוקה גבוהה יותר המתוארים כאן מאוד מגדיל את היעילות של זרע שחיקה, אנזים assay צעדים. בשיטה זו נעשה שימוש כדי להעריך את היכולת של5,6 TaABF1 פקטור שעתוק כדי להפעיל את ביטוי הגן ABA-induced HVA17. בתוצאות נציג המובאת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המבוא של ג'ין אפקטור בונה באמצעות חלקיקים הפגזה, ואחריו הביטוי ארעית של הכתב בונה היא אסטרטגיה ערך ניקוד את התפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות וב -הגן מוסדר הורמון וכתוצאה מכך ביטוי.
עם זאת, קיימים פרוטוקולים עבור ביצוע ניסויים אלה שעורה aleurone תאים2,3,4,5,6 הם עבודה מאוד אינטנסיבית. כל קבוצת מופגז בקושי גרגרים להיות יד הומוגני ב ומכתש, ועל תמציות וכת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים תודה גריסון באטלר ולברט מרגרט לעזרה בביצוע ניסויים, ג'ודי אבן לקבלת ייעוץ על תבואה המגון, לין Hannum לקבלת ייעוץ על fluorometry. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (קורע 0443676), על ידי המוסדיים פיתוח פרס (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM0103423, ועל ידי מענקים החלוקה מכללת קולבי של מדעי הטבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת GeneElute HP פלסמיד MaxiprepSigmaNA0310-1KT
ספקטרופוטומטר UV-visNanodropND-1000
גרגרי שעורה הימלאיה//מגוון שעורה ללא קליפה (אחסן בחושך ב-4° ג)
נתרן סוקסינטסיגמאS2378מגיב לספיגת תמיסת
סידן כלורי (דיהידרט)מגיב פישרC79-500להטמעת תמיסת
תמיסת ספיגהתוצרת בית/20 מ"מ נתרן סוקסינט, 20 מ"מ סידן כלורי, pH 5.0. יש לעקר על ידי חיטוי לפני השימוש.
כלורמפניקולסיגמאC0378הכן תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל באתנול 70%.
ורמיקוליטפישרNC0430369משמש ללוחות ורמיקוליט.
עיגולי נייר סינון (90 מ"מ)Whatman1001 090משמש לוורמיקוליט ולהכנת תבואה לפני הפצצה
צלחות ורמיקוליטתוצרת בית/הוסף 50 מ"ל ורמיקוליט לצלחת פטרי מזכוכית. מניחים עיגול נייר 90 מ"מ על גבי הוורמיקוליט. חיטוי.
מלקחיים (מחודדים עדין)פישר13-812-42משמש להסרת מעיל זרעים מגרגרי שעורה.
מלקחיים (נקודה עדינה במיוחד)פישר12-000-122משמש להסרת מעיל זרעים מגרגרי שעורה.
מיקרו-נשאי זהב (1.6 μ m)BioRad1652264
מקרו-נשאיםBioRad1652335
סידן כלורי (דיהידרט)FisherC79-500הכן תמיסת מלאי של 2.5 M ואחסן 1 מ"ל aliquots ב-20&0 מעלות צלזיוס.
spermidineSigmaS0266הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ ואחסן 500 μ L aliquots ב-20° C (לשימוש תוך חודשיים).
דיסקי קרע (1550 psi)BioRad1652331
מסכי עצירהBioRad1652336
מחזיקי מקרו-נשאיםBioRad1652322
מערכת אספקת חלקיקים ביוליסטייםBioRadPDS-1000/He
נתרן פוספט מונוהידראט מונוהידראטSigmaS9638מגיב ל-1M נתרן פוספט pH 7.2
נתרן פוספט דו-בסיסיSigmaS9763מגיב ל-1M נתרן פוספט pH 7.2
1M נתרן פוספט pH 7.2תוצרת בית/שלב 6.9 גרם נתרן פוספט מונוהידראט מונו-בסיסי עם 7.1 גרם נתרן פוספט דו-בסיסי. הוסף מים ל 100 מ"ל. הוסף NaOH כדי לקבל pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)Sigma43819ממיסים במים ל-1 מ'. יש לאחסן ב-20° ב-1 מ"ל מינקוטים.
לופפטיןסיגמאL2884מתמוסס במים ל-10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות;
C.glycerolSigmaG5516הכינו תמיסה של 50% במים.
מאגר טחינהתוצרת בית/לשלב 10 מ"ל של 1 M נתרן פוספט pH 7.2, 500 μ L של 1 מ' DTT, 100 μ ליטר של 10 מ"ג/מ"ל לאופפטין, ו-40 מ"ל של 50% גליצרול. הוסף מים ל 100 מ"ל.
חרוזי נירוסטה (5 מ"מ)Qiagen69989
צינורות 2.0 מ"לEppendorf22363352דגם ספציפי זה של צינור מומלץ לשימוש עם ההומוגנייזר.
הומוגנייזר חרוזים (TissueLyser)Qiagen85210
מבחנות זכוכית 12 מ"מ x 75 מ"מפישר
לוציפריןGoldbioLUCK-100הכן תמיסת מלאי של 25 מ"מ ואחסן 1 מ"ל ב-20&20 מעלות צלזיוס.
ATPSigmaA7699הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ ואחסן 250 μ L aliquots ב-20°  ג.
מגיב בסיס TrisSigmaT1503עבור 1M Tris sulfate pH 7.7.
חומצה גופרתיתSigma258105Reagent עבור 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M טריס סולפט pH 7.7תוצרת בית/ממיסים 12.1 גרם בסיס טריס ב-100 מ"ל מים. התאם את ה-pH ל-7.7 עם חומצה גופרתית.
מגנזיום כלורידSigmaM9397יש להמיס במים לעומק של 2 מ'.
מאגר בדיקת לוציפראז (LAB)תוצרת בית/קומביין 3 מ"ל של 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μ L של 2 M מגנזיום כלוריד, 1 מ"ל של 1 M DTT, ו-200 μ L של 0.5 מ' EDTA. להוסיף מים ל-50  מ"ל.
תערובת בדיקת לוציפראזתוצרת בית/קומביין 15 מ"ל של LAB, 800 μ L של 25 מ"מ לוציפרין, 200 μ ליטר של 100 מ"מ ATP, ו -4 מ"ל מים. זה יוצר מספיק תערובת בדיקה (20  מ"ל) עבור 100 מבחני לוציפראז.
לומינומטר (סיריוס)Berthold/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)GoldbioMUG1מתמוסס ב-DMSO ל-100 מ"מ.
נתרן אזידסיגמאS8032הכן תמיסת מלאי של 2% במים ואחסן 1 מ"ל ב-20&0 מעלות צלזיוס.
96 צלחות באר (סטנדרטיות)פישר12565501
מאגר בדיקת GUSתוצרת בית/שלב 2.5 מ"ל של MUG, 5 מ"ל של 1 M נתרן פוספט pH 7.2, 400 μ L של 0.5 מ' EDTA, 1 מ"ל של 1 מ' DTT, 100 μ ליטר של 10 מ"ג/מ"ל לאופפטין, 20 מ"ל מתנול ו-1 מ"ל של 2% נתרן אזיד. הוסף מים ל 100 מ"ל.
סרט איטום TempPlateUSA Scientific2921-1000
96 צלחות באר (שחור)Costar3916
נתרן פחמתיSigmaS7795הכן תמיסה של 200 מ"מ במים.
4-methylumbelliferoneSigmaM1381הכן 100 μ תמיסת M במים. להקפיא 1 מ"ל ב-20°  ג.
קורא שטף מיקרופלייטBio-TekFLX-800

מקורות

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GUS96DHVA1TaABF1

מאמרים קשורים