הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התבוננות וניתוח של מהבהב פיזור ראמאן השטח משופרת

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56729

⸱

11 בינואר 2018

1Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הניתוח של מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור עקב ההליכה אקראי של מולקולה בודדת על משטח כסף באמצעות חוקים כוח.

תקציר

ממולקולה בודדת-צומת סילבר nanoaggregate, מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור (SERS) הוא ציין. כאן, פרוטוקול מוצג כיצד להתכונן הפעילים SERS סילבר nanoaggregate להקליט וידאו של כתמים מהבהב מסוימים בתמונה מיקרוסקופית, לנתח את הסטטיסטיקה מהבהב. ניתוח זה, חוק החשמל מתרבה של התפלגויות ההסתברות לאירועים בהיר יחסית משך הזמן שלהם. התפלגויות ההסתברות לאירועים כהה מצוידים ע פ חוק החשמל הפונקציה המעריכית. הפרמטרים של החוק כוח לייצג ההתנהגות המולקולרית במדינות הכהים והבהירים כאחד. המודל אקראי הליכה ואת המהירות של מולקולת כסף על פני כל יכול להיות מוערך. קשה להעריך אפילו בעת שימוש ממוצעים, פונקציות autocorrelation, וכן הדמיה SERS ברזולוציה-העל. בעתיד, כוח החוק ניתוחים לשלבו עם הדמיה ספקטרלי, כי מקורם של מהבהב לא יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח פעולת שירות זו לבד.

מבוא

השטח משופרת ראמאן פיזור (SERS) היא רגישה מאוד ספקטרוסקופיית ראמאן ממשטח מתכת אצילה. מאז ספקטרום ראמאן מספק מידע מפורט על מבנה מולקולרי. המבוסס על העמדות שיא חדה, דרך הלטראלית של קבוצות פונקציונליות בהמולקולות, המידע של מולקולה בודדת על משטח מתכת יכול ייחקרו באמצעות SERS1,2,3. מ nanoaggregate כסף עם adsorbate רמה מולקולה בודדת, איתות מהבהב נצפית1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16, ו הספקטרום תנודות1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. מהבהב יכולה להיגרם על ידי מולקולה בודדת שזז בצורה אקראית בין שדה (EM) אלקטרומגנטית משופרת-צומת nanoaggregate כסף בגודל ננומטר. לכן, מהבהב נחשבת ראיה פשוטה לגילוי מולקולה בודדת, לעומת טכניקה באמצעות התפלגות פואסון SERS עוצמות,3,2,דו-analyte17. עם זאת, המנגנון מפורט של הספקטרום מהבהב, המשתנות, אשר בתוקף תלויים ההתנהגות המולקולרית על פני Ag, הם עדיין שנוי במחלוקת.

במחקרים קודמים, מהבהב SERS נותחה באמצעות הפונקציה autocorrelation, אשר ניתן לחשב את מקדם דיפוזיה וריכוז של מולקולות נע פנימה והחוצה משופרת EM שדה12,13,14 . יתר על כן, ציון מנורמל סטיית תקן, אשר מייצג את חוסר היציבות בעוצמה מוחלטת, יש כבר נגזר לפרופיל זמן של אות ה-15. עם זאת, גישות אנליטיות אלה עשויה להתבסס על ההתנהגות של מספר מולקולות. לעומת זאת, בתחום ההדמיה סופר רזולוציה של מהבהב SERS, מולקולה בודדת התנהגות בשדה EM משופרת יכול להיות מזוהה16. עם זאת, שיטות אלה ניתן לקבל פרמטרים כגון רק ב שדה EM משופרת. התנהגות אקראית של מולקולה בודדת בתוך מגוון רחב (למשל, ב מהבהב SERS) יכול להיות מיוצג חוק החשמל במקום ממוצע4,5,6,7,8 ,9,10,11, הדומה פלורסצנטיות מהבהב מ18,19נקודה (QD) קוונטית בודדת מוליכים למחצה. על-ידי שימוש של כוח החוק ניתוח4,5,6,7,8,9,10,11, ההתנהגות המולקולרית יכול להיות משוער ב מדינת בהיר (בתחום EM משופרת) והן המדינה כהה10; כלומר, אופן הפעולה של המולקולה על פני השטח כולו כסף יכול להיות מוערך.

טכניקה זו, nanoaggregates colloidal כסף הם בשימוש4,5,6,7,8,9,10,11. Nanoaggregates אלה מראים להקות תהודה (LSPR) שונות המותאמות לשפות אחרות פלזמון משטח חזק להשפיע על שדות אלקטרו-מגנטיים משופרת כאשר הם מתרגשים באורכי גל מסוימים. לפיכך, פעיל SERS סילבר חלקיקים קיים צמיגי, חלק מהנתונים מיד ניתן להשיג. במקרה של nanostructures פשוט, שבו יש, ספציפית הסדרים, צורות וגדלים, התלות LSPR של SERS מהבהב יכול להסתיר אחרים dependences7; כלומר, אם ננו-מבנה טוב או רע כדי LSPR, הפרמטרים יהיה קבועים, dependences אחרים לכן יוסתרו. ניתוח החוק כוח שימש לגלות dependences שונים של SERS מהבהב כסף colloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת הדוגמא

  1. הכנת כסף colloidal חלקיקי 20
    1. להמציא כסף colloidal חלקיקי, להמיס 0.030 g של חנקת הכסף ו- g 0.030 של ציטראט trisodium וגופרית והרכבו של 150 מ ל מים בבקבוקון התחתון עגול 200-mL.
    2. משלבים את הבקבוק עם הקבל ריפלוקס (Dimroth).
    3. מוסיפים את הפתרון הבקבוק עם פס מגנטי בחישה ומערבבים. לאחר מכן, מחממים את הפתרון מלהיב ב. הבקבוק באמבט שמן ב 150 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
      הערה: הפתרון תהפוך אפור צהוב, אז חלבי.
    4. מגניב ההשעיה בטמפרטורת החדר, ואל המתלה הבקבוקון מכוסה ברדיד אלומיניום במקרר.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה. השתמש colloidal חלקיקים, לאחר אחסון במקרר, בתוך חודש אחד.
  2. הכנת דוגמת עבור צבעוני מהבהב פליטה 11
    1. להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.
    2. 0.1% פולי-L-ליזין תמיסה מימית להוסיף לוח הזכוכית, והסר את הפתרון עם מפוח.
    3. להוסיף את המתלים colloidal כסף לוח הזכוכית, וכן להסיר את הבולם עם מפוח.
    4. הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.
    5. לשפוך מים מזוקקים על לוח הזכוכית, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור שקופית מיקרוסקופ ולמנוע המים מתאדים.
  3. הכנת דוגמת עבור מונוטוני SERS מהבהבת בצבע 7 , 8 , 9 , 10
    1. להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.
    2. מערבבים את המתלים colloidal כסף עם צבע thiacyanine או thiacarbocyanine (25 או 4 מיקרומטר, בהתאמה), תמיסה מימית של NaCl (10 מ מ)-יחס נפח של 2:1:1.
    3. זרוק את המתלים מדגם על צלחת זכוכית, להסיר את הבולם עם מפוח.
    4. הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.
    5. ירידה של תמיסה מימית של NaCl (1 מ') על לוח הזכוכית כדי לשתק את סילבר חלקיקים, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור צלחת שקופיות מיקרוסקופ ולמנוע את הפתרון מתאדים.

2. התבוננות מהבהב סילבר חלקיקים

  1. תאורה של מדגם
    1. מקם את לוח הזכוכית מדגם שהוכנו באמצעות פרוטוקול 1.2 או 1.3 על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.
    2. יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות אור לבן דרך שדה אפל מעבה, המוקד על כתמים צבעוניים שונים (כחול, ירוק, צהוב ואדום) על לוח הזכוכית באמצעות עדשת אובייקטיבי (60 X).
    3. יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן הקלוש, שהועברו בזווית של 30 מעלות יחסית משטח הדגימה, שאוב מצב מוצק (DPSS) דיודת לייזר מכ (cw) דרך מסנן הפרעות.
    4. כדי להשתמש תאורה לייזר כדי לבחון את nanoaggregates כסף כמו כתמים צבעוניים מונוטוני אותו בצבע של סביבה, להזיז את האזור תאורה לייזר למרכז התצוגה ולהתמקד הכתמים על לוח הזכוכית על-ידי התאמת השלב z-כיוון.
  2. התבוננות מהבהב
    1. להוסיף מסנן לעבור זמן רב לאחר העדשה אובייקטיבי, להאיר את לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן לייזר cw DPSS גאל בזווית של 30 מעלות ביחס השטח מדגם באמצעות מסנן הפרעות.
    2. למצוא את המצמוץ יבחין כמוצג באיור 1 (ראה גם איור S1 בחומר משלים) על-ידי הזזת השלב ב x - ו y-ההוראות.
    3. להקליט וידאו נקודות מהבהב עם המיקרוסקופ הפוכה, מצמידים מקורר דיגיטלי תשלום מצמידים מכשיר (CCD) מצלמה, בעל רזולוציה זמן של ms 61-120, כעשרים דקות.

3. ניתוח של מהבהב SERS

  1. נגזרת של פרופיל זמן וידאו
    1. בהתוכנה המפקחת על מצלמת CCD, פתח את קובץ הווידאו.
    2. לבחירת נקודות מהבהב ואזור אפלים, גרור אזורים בנפרד לכסות אזורים עם או בלי נקודות של תמונת הוידיאו.
    3. להפיק אותות בעוצמה זמן פרופילים מן כתמים מהבהב אזורים כהים וידאו, בחר ניתוח באונה בניתוחולאחר לחץ על חישוב בחלון ניתוח טמפורלית .
    4. לשמור את הנתונים כקובץ טקסט.
  2. ניתוח של הפרופיל זמן
    1. לשטח תוכנית בסיסית של הפרופיל זמן על-ידי חיסור לפרופיל זמן אזור כהה ו/או התאמה עם פונקציה פולינום, כפי שמוצג דמויות 2A ו- 2B.
    2. להעריך עוצמה בסיסית בממוצע שלא מורכב כ 2000 נקודות, אניהבסיס, סטיית תקן של עוצמות בסיסית, σ, כפי שמוצג דמויות 2C ו- 2D.
    3. להבדיל בהיר אירועים מאירועים כהה שימוש בעוצמות גדולות יותר מסף אניבסיס + 3σ, והקלטה של משך הזמן של כל אירוע. איור 3, לדוגמה, להקליט את האירוע מ- 0 ל 3.5476 s כמו האירוע כהה (עם משך של t = 3.5476 s), ולתעד את האירוע מ 3.5476 כדי 4.0981 s כמו האירוע בהיר (עם משך של t = 0.5505 s). חזור על הליך כפי שמוצג בטבלה 1.
    4. לספור את מספר אירועים הכהים והבהירים למשך כל, כפי שבאה לידי ביטוי הקווים הראשון והשני בטבלה 2.
    5. לסכם מספר האירועים למשך כל, למעט אירועים קצרים יותר מאשר משך זמן t. כפי שבאה לידי ביטוי הקווים השני והשלישי של טבלה 2, לדוגמה, לסכם מספר האירועים למשך כל (מלבד האירועים עבור t = 0.0612 s) כמו 41 + 18 + 9 +...; התוצאה שווה. הסיכום עבור t = 0.1223 s, קרי 103.
    6. מתחלק סיכומים של כל משך, לנרמל אותם. כפי שבאה לידי ביטוי בטבלה 2, לדוגמה, לחלק את הסיכום עבור משך זמן t = 0.0612 s על ידי ה-s משך 0.0612. התוצאה היא 3,351.5791. לאחר מכן, לחלק את התוצאה על ידי הכולל של התוצאות לשורה הרביעית בטבלה מס ' 2. התפלגות ההסתברות נגזר להיות 0.64494.
    7. העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור האירועים בהיר P-(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן10P-(t) מאת יומן10 (figure-protocol-1) להסיק את כוח החוק α המעריךעל ספציפי מהבהב ספוט. אם P-(t) הוא מצויד ידי figure-protocol-2 , קו מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P-(t), כפי שמוצג על ידי הקו המקווקו באיור 4א.
    8. העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור אירועים כהה P.(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן10P.(t) מאת יומן10( figure-protocol-3 להסיק את כוח החוק α המעריךאת , את חיתוך זמן τ מ המצמוץ באותה נקודה. אם P.(t) הוא מצויד ידי figure-protocol-4 , העקומה מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P.(t).
    9. חזור על 3.2.1 כדי 3.2.8 המקומות מהבהב אחרים וידאו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מ nanoaggregates כסף עם פולי-L-ליזין שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.2, כתמים צבעוניים מהבהב SERS, זריחה משופרת משטח שנצפו, כפי שמוצג באיור 111. לעומת זאת, מונוטוני נקודות מהבהב צבעוניות מן SERS נצפו עבור nanoaggregates כסף מולקולות צבען שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.37,8,9,10. ישנם שני סוגים של תוצאות "שלילית": תוצאות ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מצומת nanoaggregate כסף, נפלטת SERS. לפיכך, עלינו להכין את nanoaggregates יותר מאשר colloidal חלקיקי, אשר מכוסים אניונים ציטראט. אגרגטים כסף נוצרות מן שיטת salting out האפקט שנוצר על-ידי התוספת של פולי-L-ליזין, אשר יש -NH3+ , והוא המקור של SERS, או קטיונים Na+ של NaCl, כפי שמוצג באיור S2 של חומר משלים. יתר על כן, כדי להאיר את הנקודות רבים באזור רחב, קרן הלייזר לא ממוקד מועבר בזווית של 30 מעלות יחסית משטח הדגימה, דרך עדשה לא קשור המיקרוסקופ. קיימת אפשרות כי האזור תצפית לא ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר אין לחשוף.

תודות

המחבר תודה פרופסור י' וזאקי (אוניברסיטת Gakuin Kwansei), ד ר טי Itoh (הלאומי מכון מתקדם תעשייתי למדעים וטכנולוגיה) לצורך דיון פורה של עבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI (מענק הסיוע עבור C מחקר מדעי) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, והטכנולוגיה (מס 16K 05671).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כסף חנקתי, 99.8%Wako194-00832
טריסודיום ציטראט דיהידרט, 99. %Wako191-01785
תמיסה מימית פולי-L-ליזין, 0.1%סיגמא-אולדריץ'P8920
3,3'-דיסולפרופילתיאציאנין טריאתילאמיןHayashibara Biochemical LaboratoriesNK-2703סוג של צבעי תיאצינין
3,3'-דיאתיל-5,5'-דיכלורו-9-מתיל-תיאקרבוציאנין מלח יודHayashibara Biochemical LaboratoriesSMP-9סוג של צבעי תיאקרובוציאנין
נתרן כלורי, 99.5%Wako191-01665
מעבה דימרוטאיוואקי61-9722-22מופק מ- AS ONE
מערבל מגנטיקורנינגDC-420D
אמבטשמןAdvantechOS-220
צלחת זכוכיתMatsunamiS-1112מפוח שקופיות מיקרוסקופ
HozanZ-288אבק אוויר
עט חוסם נוזליםDaido SangyoLIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). עט מחסום הידרופובי מוכן לשימוש המיועד ליישומי אימונוהיסטוכימיה
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX-70
עדשת אובייקטיביתOlympusLCPlanFl 60×נא 0.7
מעבה שדה כההOlympusU-DCDNA 0.8– 0.92
מצלמת CCD דיגיטלית מקוררתHamamatsuORCA-AGנשלטת על ידי תוכנה Aqua Cosmos
Software עבור מצלמת ה-CCD הדיגיטלית המקוררתHamamatsuAquaCosmosהמשמשת גם לגזירת פרופילי הזמן מהנקודות המהבהבות בסרטון 
מצלמת CCD צבעוניתELMOTNC-C920אינה משמשת לניתוח
לייזר DPSS לייזרRGBNovaPro532-75λ = 532 ננומטר;
60 mW (מתאים לצפיפות הספק של 600 W/cm2)מסנן
הפרעותSemrockLL01-532-12.5
מסנן מעבר ארוךSemrockBLP01-532R-25
תוכנה להבחנה וספירה של האירועים הבהירים/חשוכיםעוזרתשתוכנתה על ידי C++
Software להתאמה על ידי חוקחשמל LightStoneOrigin6.1
מערכת הבית

מקורות

  1. Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
  2. Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
  3. Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
  4. Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
  5. Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
  6. Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).
  7. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
  8. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
  9. Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
  10. Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
  11. Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
  12. Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
  13. Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
  14. Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
  15. Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).
  16. Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
  17. Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
  18. Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
  19. Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).
  20. Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
  21. Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
  22. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SERSCCDPoly l lysine
התבוננות וניתוח של מהבהב פיזור ראמאן השטח משופרת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.