מאמר שיטה

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

DOI:

10.3791/56745

⸱

29 בדצמבר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Tumor Immunology, Radboud University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מסיסים N- ethylmaleimide פיוז'ן רגיש חלבון (NSF) מצורף חלבון קולטן (מוקש) חלבונים הם המפתח על קרום סחר, כפי שהם לעודד ממברנה פיוז'ן בתוך התאים האיקריוטים. משפחת חלבונים מוקש מונה כ-36 חברים שונים. נתיבי תחבורה תאיים מסוימים הם מזורז על ידי קבוצות ספציפיות של חלבונים מוקש 3 או 4, ובכך לתרום יחודיות ונאמנות של קרום סחר בבני אדם. עם זאת, לומד את תפקידו המדויק של חלבונים מוקש הוא טכנית מאתגר, בגלל מלכודות הם מאוד שופע ומיותר תפקודית, עם רוב מלכודות מרובות ואני חופפים פונקציות. ב פרוטוקול זה, מתוארת שיטה חדשה עבור הפריט החזותי של היווצרות מורכבות מוקש בתאים חיים. שיטה זו מבוססת על ביטוי חלבונים מוקש C-סופני התמזגו חלבונים פלורסנט ולהעביר מדידה האינטראקציה שלהם על ידי פורסטר תהודה אנרגיה שלמים פלורסצנטיות המעסיקים (סריג) הדמיה במיקרוסקופ (FLIM). על-ידי הזזת את היסטוגרמות שלמים זריחה עם דגם ל דעיכה, סריג-FLIM מאפשר (דו-) הערכה כמותית של השבר של היווצרות מורכבות מוקש-שלפוחית שונים. פרוטוקול זה יושם בהצלחה להמחיש מוקש היווצרות מורכבות קרום פלזמה ובבית endosomal בתאים בתרבית של תאים וקווי תאים חיסוניים הראשי, ניתן להרחיב בקלות ללמוד מוקש פונקציות על אחרים organelles ב חיה, צמח ותאים פטרייתי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממברנה סחר הוא מאפיין מרכזי של התאים האיקריוטים, שבו קרום שלפוחית באד מ אברון התורם לעבור ואז הפתיל עם היעד אברון1,2. חוץ המיטוכונדריה, כל השלבים פיוז'ן קרום הם מזורז על ידי חברי של מוקש חלבון משפחה1,2. משפחת חלבונים מוקש כוללת כ-36 בתאים בתרבית של וחברי כ-20 שמרים2. מוקש חלבונים להכיל אחד או שניים ~ 52 שאריות ארוך, מקורי לא מובנים אזורים, שנקרא מוקש-מוטיבים. מוקש חלבונים הם לעיתים קרובות קשורה לממברנות מאת C-מסוף סליל transmembrane1,2. ניתן לסווג מלכודות בהתבסס על משקעי המרכזית שהם לתרום הסנייר מורכבים אל ארגינין (R) וגלוטמין (Q) מלכודות1,2. ממברנה היתוך הוא מונע על ידי האינטראקציה של מלכודות cognate 3 או 4 יחד תורמים מוקש 4-מוטיבים, ופרושות על התורם והן מקבל קרום1,2. מתחם מוקש מורכב מוטיב R-מוקש אחד שלושה מוטיבים Q-מוקש (הנקרא אבטחת איכות, Qb ו- Qc). היווצרות מורכבות מתחיל ב- N-טרמיני של המוטיבים מוקש, ויוצרים עם מה שמכונה טראנס-מוקש-מורכבים, וממשיך לכיוון C-טרמיני, ויוצרים צרור סליל מפותל α-הסליל חזק בשם של חבר העמים-מוקש-מורכבים. הקמת מתחם אפילו מלכודת אחת מורכבת גורר את הקרומים התורם ואת מקבל יחד, מתגבר על מחסום האנרגיה עבור ממברנה fusion3.

הקצאת מתחמי מוקש ברורים נתיבי תחבורה ספציפיים בתוך התאים הוא לעיתים קרובות טכנית מאתגר. למרות מלכודות בבירור לתרום יחודיות של קרום סחר בבני אדם, הם מופקר, יתירות פונקציונלית, הפונקציות שלהם חופפים1,2. בגלל זה, ניסויים ההפרעות מיקוד, מלכודות, כגון על ידי נוקאאוט גנטי, התערבות RNA, כניסתה של חסימת נוגדנים, או עם שברי מוקש מסיסים כגורם דומיננטי התשלילים, לעתים קרובות התוצאה אינה ברורה פנוטיפים מהשני מלכודות לפצות2,4. יתר על כן, קשה להבדיל ממברנה ספציפי פיוז'ן צעדים נגד הזרם אירועים לסחר בבני אדם, כי מלכודות יכולים להיות מעורבים נתיבי התחבורה מספר2. מחקרים לוקליזציה של מלכודות על ידי גישות מיקרוסקופ, באמצעות immunolabeling או פיוז'ן גנטי כתב פלורסנט חלבונים, סובלים מבעיות זה: (i) מלכודות לאתר כדי organelles מרובים כפי שהם לעיתים קרובות לתווך סחר שלבים מרובים, ו (ii) הגרסא המקומית שלהם אומר באופן אוטומטי שהם עוסקים באופן פונקציונלי היווצרות מורכבות מוקש. לבסוף, מתחמי מוקש ניתן לזהות באמצעות ניסויים immunoprecipitation שימוש באחת מלכודות פיתיון מגיננו אחרים כמטרות, אך זה אינו מאפשר הקצאה של אלה מתחמי organelles ספציפי או נתיבי הסחר בבני אדם. לפיכך, בשלב זה אין טכניקה חלופית להמחיש מתחמי מוקש עם רזולוציה אבחון. Immunofluorescence הוא לא מסוגל להוכיח את האינטראקציות מוקש אבל יכול להראות רק נוכחות או היעדרות של לוקליזציה משותף, בעוד immunoprecipitation רק יכול להראות מוקש אינטראקציות בכל תא האוכלוסייה אך לא תקצה את organelles שבו אלה אינטראקציות להתרחש.

כדי להתגבר על מגבלה אלה, שיטה ומאפשר החזיית מוקש מתחמי בתוך תאים חיים עם רזולוציה אבחון כמותי פותחה לאחרונה על ידי Verboogen. ואח 5 שיטה זו מבוססת על הביטוי של זוגות של מלכודות עם חלבונים פלורסנט שהוסטו spectrally C-סופני דבוקה helices transmembrane שלהם. לאחר השלמת ממברנה היתוך ועל היווצרות cis-ללכוד מורכבים, אלה fluorophores ב C-טרמיני של helices transmembrane מוצבות מיד אחד לשני. Fluorophores. נמצאות אז המרחק פורסטר (בדרך כלל < 5 nm), וכתוצאה מכך סריג מ fluorophore ירוק-העביר התורם מקבל אדום-העביר5,fluorophore, או6. תדאג תוצאות לכבות את fluorophore התורם ואת של פליטה מוגברת של fluorophore מקבל שניתן למדידה של היחס של התורם ואת מקבל הפליטה (רציומטרי סריג). עם זאת, רציומטרי סריג בין שתי מולקולות שונות הוא מאתגר, בגלל קרינה פלואורסצנטית צולבות לדבר אחר רמות של מלכודות התורם ואת מקבל organelles שונים, בין תאים7,8. ניתן גם למדוד סריג מן החיים פלורסצנטיות, וזה הזמן בין עירור את הפליטה של הפוטונים. אם fluorophore התורם יכול לשחרר את האנרגיה שלה על ידי תדאג, כתוצאה תהליך מתחרות זו נראית לעין לקיצור של משך החיים של זריחה. זה נמדד על ידי7,FLIM8. כל החיים סריג היא הרבה יותר חזקה מאשר רציומטרי סריג למדידת האינטראקציות בין שתי מולקולות שונות, כמו משך החיים של קרינה פלואורסצנטית הוא מאפיין מהותי של fluorophore והוא חסר רגישות הריכוז שלו. יתר על כן, סריג היא על ידי קירוב כמותיים, כי היעילות של סריג היא ביחס הפוך ל הכוח השישי של המרחק בין התורם ואת מקבל fluorophores (בעיקרו של דבר פונקציית מדרגות). לכן, על-ידי הזזת את היסטוגרמות שלמים פלורסצנטיות נרשם על ידי FLIM עם דגם כפול-רכיב דעיכה, סריג-FLIM מאפשר (דו-) כמותית ההערכה של השבר של מולקולות מוקש עוסקת מוקש היווצרות מורכבות5.

לאחרונה, שיטה זו סריג-FLIM היה בשימוש על ידי. Verboogen et al. כדי להמחיש את היווצרות מורכבות מוקש בתאים דנדריטים ראשיים של המערכת החיסונית5. זה הוצג כי על מפגש עם גירוי פתוגניים, תאים דנדריטים לנתב שלהם ממברנה סחר בליווי של complexing מוגברת של החלבון קרום שלפוחית-הקשורים R-מוקש (ערפדים) 3 עם syntaxin Qa-מוקש 4 במיוחד- קרום פלזמה. צורה מורכבת מוקש מוגברת זו נדרש צפויה לפגוש את יכולת הפרשה מוגברת ההפרשה של ציטוקינים דלקתיים כגון interleukin-65. פרוטוקול זה מתאר את השלבים ניסיוני לצורך רכישת סריג-FLIM נתונים למדידה כמותית ויזואליזציה, (נולד בלמחצה) של מתחמי מוקש.זה מוסבר איך להתאים את היסטוגרמות שלמים תאים כל זריחה עם פונקציות דעיכה מונו - ו -bi-מעריכית, וכתוצאה מכך בגלגול זריחה נראית לעין כמו הערכה כמותית מוקש אינטראקציות. פרוטוקול זה, הקו בשימוש נרחב התא הלה משמש כדוגמה, אך השיטה ניתן להרחיב בקלות ללמוד מתחמי מוקש שאר התאים האיקריוטים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הדגימות מיקרוסקופ

  1. ביטוי של Qa-סנר syntaxin 4 דבוקה mCitrine (syntaxin 4-mCitrine; fluorophore התורם) ומאוחדים. VAMP3 R-מוקש עם mCherry (VAMP3-mCherry)
    הערה: מלכודות אחרות עם חלבונים פלורסנט דבוקה שלהם helices transmembrane C-מסוף יכול גם לשמש. במקום mCitrine-mCherry, זוגות אחרים מקבל התורם של fluorophores spectrally מופרדות ניתן גם בשימוש (למשל, CFP-YFP).
    1. גדלים הלה תאים ומתחלקים 900,000 הלה תאים מעל שלוש 35 מ מ קוטר תחתון כלי הזכוכית מתאים מיקרוסקופ.
      הערה: באופן עקרוני, פרוטוקול זה ניתן להתאים סוגי התאים האיקריוטים ומנות מיקרוסקופ אחרים.
      1. לשמור על תרביות תאים הלה ב T75 מבחנות עם 10 מ"ל של גלוקוז גבוהה Dulbecco של בינוני הנשר ששינה (DMEM), בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS) ו 1% אנטיביוטיקה-antimycotic (המכיל המפוטריצין פניצילין, סטרפטומיצין) ב 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 בחממה תרבות התא.
      2. לחדש את המדיום פעמיים בשבוע, לפצל תאים 1:10 פעם בשבוע או כאשר התאים להגיע 85-90% T75 confluency חדש מבחנות (500,000 תאים/מבחנה על ממוצע).
      3. להסיר את DMEM ולשטוף את monolayers הלה פעמיים עם 8 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS) למשך 3 דקות.
      4. להסיר את PBS ולהוסיף 2 מ של PBS בחומצה ethylenediaminetetraacetic 2 מ מ (EDTA).
      5. דגירה את התאים עבור 5 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה התרבות תאים, לאחר מכן בקלילות להתסיס את הבקבוק כדי להפריד בין תאים הלה מהחלק התחתון של הבקבוק.
      6. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של מדיום, להעביר את המתלים צינור 15 מ"ל ולהסיר aliquot 10 µL עבור ספירה.
      7. לדלל את aliquot 1:1 עם הכתם trypan blue 0.4% ולספור את התאים עם hemocytometer Bürker9.
        הערה: לספור שני 4 x 4 ריבועים ומספר מרובים תא על-ידי 10,000 עבור מספר תאים למ"ל.
      8. לאחר התא ספירה, לקחת תאים 900,000 מהצינור 15 מ"ל, לחלק אותם מעל הכלים התחתון זכוכית 3 (ראה שלב 1.1.1), ולהכין תרביות תאים.
    2. Transfect התאים על ידי אלקטרופורציה10 (ראה טבלה של חומרים) עם syntaxin 4-mCitrine לבנות (התורם בלבד, דוגמת #1), syntaxin 4-mCitrine יחד עם VAMP3-mCherry (לדוגמה #2), syntaxin 3 דבוקה (גם mCitrine וגם mCherry דוגמה מס ' 3).
      הערה: שיטות אחרות של תרביות תאים התא יכול להיות גם בשימוש11. הבונה טנדם מדגם #3 הוא פקד חיובי עבור הערכת הקצר החיים צפוי (קרי, סריג צפוי מקסימלי).
  2. התרבות שהתאים לינה גלוקוז גבוהות DMEM שסופק עם FCS 10%, 1% אנטיביוטיקה-antimycotic ב 37 ° C עם 5% CO2 בחממה תרבות התא.
  3. האחות DMEM. ולשטוף את התאים פעם אחת עם תא חי הדמיה בינוני (140 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ אשלגן כלורי, מ מ 1.8 CaCl2, 1 מ MgCl2, 20 מ מ HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; לראות טבלה של חומרים) למשך 2 דקות, ממקם את התאים בתחום ההדמיה טריים בינוני.

2. רישום של הנתונים FLIM

  1. המקום מדגם #2 תחת בתחום הזמן FLIM מיקרוסקופ קונפוקלי עם מקור עירור פעמו עבור התורם fluorophore (כלומר, mCitrine) וזמן לפתור והקפאה. שמור את התאים ב 37 ° C עם שלב מחוממת.
    הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי בשימוש פרוטוקול זה מצויד עם 63 X 1.20 נה מים טבילה יעד, לייזר פעמו אור לבן (הפועמים 80 מגה-הרץ, < משך פעימה 100 ps), שפופרת פוטונית מכפיל (PMT), ו Time-Correlated יחיד פוטון לספור (TCSPC ) המערכת (ראו טבלה של חומרים ספציפיים לכיוונון המשמש). מיקרוסקופים אחרים FLIM ניתן גם בשימוש (למשל, דיודות מפולת פוטון בודד (בשמו, הידיים. שלך) במקום PMTs, יחיד באורך הגל פעמו לייזרים במקום לייזר פעמו אור לבן).
  2. בחר בתא עם ביטוי גלוי של mCitrine, התווית על-ידי mCherry חלבונים מוקש והקלטה של תמונת קונאפוקלית של 256 × 256 פיקסלים עם עירור בו זמנית של שתי fluorophores לפני כל מדידה FLIM. צעד פיקסל של קיפול כפול בערך קטן יותר עקיפה מוגבלת והרזולוציה המרחבית של המיקרוסקופ (~ 200 ננומטר) אמור לשמש. עבור mCitrine, לרגש 516 ננומטר, פליטה לאסוף מ- 521-565 ננומטר; עבור mCherry, לרגש-610 nm ולאסוף פליטה מ 613-668 ננומטר.
    הערה: האם לא מיקום המטוס הדמיה קרוב מדי לחלק התחתון של המנה (בתוך ~ מרחק 2 מיקרומטר), כמו זה יגרום לשיא השתקפות בהיסטוגרמה שלמים זריחה. עירור סימולטני של fluorophores התורם ואת מקבל הוא המועדף, כמו זה מאפשר להתגבר על הבעיה פוטנציאלי של דגימת תנועה. עם זאת, עירור רציפים יכול לשמש גם כן.
  3. שיא תמונה FLIM על ידי לחיצה על הפעל FLIM עם תמונה FLIM מוקלטת עם אותו המידות והרזולוציה המרחבית של התמונה קונאפוקלית הקליטו צעד 2.2. להקליט את הפוטונים תמונה לפחות 50,000 עבור כל תא FLIM ניתוח, או לפחות 400 פוטונים לפיקסל. רק לרגש את fluorophore התורם mCitrine, לא fluorophore מקבל את mCherry, ובכך לעורר-516 פליטה nm ולאסוף מ- 521-565 ננומטר.
  4. חזור על שלבים 2.1-2.3 עבור תאים מרובים, את הדגימה #1 (התורם בלבד) והודעות מדגם #3 (mCitrine-mCherry טנדם הבונה) אחרים.
  5. לתעד את פונקצית תגובה כלי נגינה (IRF). לכוון את monochromator של הגלאי פליטה כדי הגל עירור (למשל, הפקת הרשומה של 510-550 ננומטר), ואז להקליט את תמונת FLIM עם בחזרה פיזור תגית כיסוי זכוכית נקי על ידי לחיצה על לחצן הפעל FLIM. השתמש באותם אורכי גל עירור (516 ננומטר) לייזר כוח משמש להקלטת הנתונים תא צעדים 2.1 2.4.
    הערה: אם מספר פסגות גלויים ב- IRF או אם לא יכול להיות מכוון את פליטת monochromators, IRF גם ניתן למדוד עם פתרון של הפלורסנט עם אורך מרביים, למשל על-ידי קרינה פלואורסצנטית שכבתה של אורגניים צבע ב רווי מימית תמיסת אשלגן יודיד. יתר על כן, זה לא נדרש בקפדנות כדי להקליט IRF, כי גם יכול להיות מצויד המדרון דעיכה של היסטוגרמות פלורסצנטיות בלי deconvolution של IRF. אולם, IRF מאפשר ולתיקון המאפיינים התזמון של גלאי הפוטונים משמש, ובכך הופך את התקפי היסטוגרמות שלמים מדויק יותר.

3.המרה של ההקלטות פוטון FLIM תמונות

  1. להוריד ולהתקין את תוכנת ההמרה PT32ICS5.
    הערה: הנתונים לכל החיים יכולים גם להיות מנותח על ידי תוכנות אחרות, כולל תוכנה של מספר ספקים מיקרוסקופ.
  2. להגדיר את התוכנה PT32ICS.
    1. להגדיר את גודל לגודל 256 × 256 פיקסלים תמונה באמצעות הגדרות | גודל.
    2. הגדר את ערוץ 2 דרך הגדרות | גודל.
      הערה: הערוץ של הפליטה mCitrine תלויה באופן בלעדי התצורה של המיקרוסקופ. ערוץ לא נכון יביא תמונה FLIM עם אין פוטונים (קרי, שחור תמונה), וכתוצאה מכך ריק 'LifetimeTable.txt'-קובץ. הערוץ הנכון יכול להיות מזוהה על ידי משפט--שגיאה.
    3. הפלט מוגדר ImageJ (xyz) (או TRI2 (xyt)) ליצירת תמונות FLIM (שלב 3.4).
  3. לחץ על המר וטען עקבות פוטון אחד או יותר (הקבצים .pt3). כדי לבחור מספר עקבות פוטון, לשמור את מקש Ctrl לחוץ.
    הערה: התבנית .ptu של 64 סיביות החדשים ניתן גם להמיר.
  4. ודא כי התוכנה PT32ICS יוצרת את הקבצים הבאים בבאותה תיקיה שבה נשמרים הקבצים pt3: מחסנית פוטון אחת לכל .pt3 מעקב פוטון התמונה cytometry תבנית סטנדרטית (.ics), קובץ מפת סיביות אחת לכל .pt3 פוטון מעקב (. bmp), קובץ טקסט לכל המרה (_Report.txt) מכיל מידע על הסטטיסטיקה פוטון (כלומר, המספר הכולל של פוטונים ב כל פוטון .pt3 טרייס, הרזולוציה זמן של גלאי) ואת קובץ הטקסט שני לכל המרה (_LifetimeTable.txt) המכילה סה קרינה פלואורסצנטית היסטוגרמות שלמים בתבנית מופרד באמצעות טאבים עבור כל עקבות פוטון .pt3.
    הערה: הקובץ. ics יכול לשמש עבור פיקסל אחד מתאים על מנת ליצור תמונות FLIM, למשל עם TRI2 תוכנה12,13 או העקומה דק מתאים ספריה בפיג'י ImageJ14,15. קובץ זה יכול לשמש גם עבור ניתוח פאזור16, למשל עם התוסף זמן מגודרת פאזור לפיג'י מן Spechron. קובץ מפת הסיביות מכיל מידע לכל החיים. קובץ הטקסט השנייה משמשת לניתוח FLIM כולה-תא בשלב 4.

4. התאמה של קרינה פלואורסצנטית היסטוגרמות שלמים לניתוח כל-תא FLIM

הערה: שלב זה (deconvoluted ההתאמה של IRF) דורש תוכנה מסוגל התאמה deconvoluted. התאמת מורדות היסטוגרמות פלורסצנטיות ללא deconvolution של IRF יכול להיעשות עם תוכנות אחרות גם כן.

  1. פתיחת התוכנית תוכנת ניתוח נתונים מסוגל מתאים עם deconvolution (טבלה של חומרים) ולייבא את קובץ הטקסט המכיל את כל עקבות פוטון (_LifetimeTable.txt) דרך קובץ ההיסטוגרמה | ייבוא | יחיד ASCII.
  2. ארגן מחדש את הטבלה כך IRF נמצא העמודה השניה של הטבלה (באמצעות העתק והדבק). מקם את IRF בעמודה השנייה B ליד ערכי הזמן בעמודה הראשונה א
  3. הקובע את טיב עקבות פוטון המוקלט על-ידי בחירת כל העמודות על-ידי הקשה על Ctrl + A ובחירה מגרש | רב הפאנל | לוח 9. לא מנתחים פוטון עקבות עם השתקפות גבוהה לשיא (איור 4F).
  4. בחר כל העמודות המכילות את היסטוגרמות שבשליטת איכות החיים זה להיות מצויד כמו גם IRF בעמודה B באמצעות Ctrl מקש ולטעון ההתאמה ליניארי ויה ניתוח | התאמת | להתאים עקומה לא ליניארית | פתח תיבת הדו-שיח.
  5. לטעון את הפונקציה בכושר deconvoluted (זמין ב ה 1 קובץ משלים) על-ידי הוספת פונקציה זו התוכנה ניתוח (via קטגוריה | המשתמש הגדיר | הפונקציה | להוסיף). בחר את הקובץ מתאים הפונקציה 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. זו פונקציה מתאימה היסטוגרמות שלמים זריחה עם פונקציה דעיכה מעריכית-מונו deconvoluted עם IRF (קרי, העמודה השנייה B בטבלה) (משוואה 1):
    figure-protocol-1(משוואת 1)
    עם t הזמן, τ זריחה נראית לעין כל החיים, A משרעת ו- y0 ההיסט.
    הערה: אפשרות אחרת היא להתאים את היסטוגרמות שלמים עם פונקציה בכושר bi-מעריכית (משוואה 2):
    figure-protocol-2(משוואת 2)
    על ידי תיקון החיים של הרכיב איטי (1τ) שיש התנאי היחיד התורם (שלב 1.1.2: מדגם #1) של רכיב ה-מהיר (2τ) כדי הבונה טנדם (דוגמה מס ' 3), זה מאפשר הערכה של השבר של מוקש חלבונים במתחם (F) מ- amplitudes של איטי (א1) והרכיבים מהיר (2; ראה הדיון; משוואה 3):
    figure-protocol-3(משוואה 3)
    הקובץ פונקציה מתאים למדידה bi-מעריכי deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' זמין 2 הקבצים המשלימים.
  6. בחר מצויד עקומות | X סוג הנתונים כמו בדיוק כמו נתוני הקלט.
    הערה: זה יגרום המתאים x-ציר שינוי קנה מידה של עקומות מצויד.
  7. להתאים את העקומות בהקשת מתאים.
    הערה: זה להמיר את ההתאמה, ליצור גיליון' דוח' במערך באמצעות טבלה המכילה את גלגולי חיים פלורסצנטיות, קיזוז ו amplitudes. זה יפיק גם גליון נתונים עם העקומות מצויד, שנשאר משהו של התאים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרציונל של וזמינותו למדידת מוקש אינטראקציות על ידי סריג-FLIM מוצג באיור1. C-טרמיני של helices transmembrane של חלבונים סנר cognate הם התמזגו בזוג spectrally שהוסטו חלבונים פלורסנט (למשל, mCitrine ו- mCherry). היווצרות cis-ללכוד מורכבים על תוצאות פיוז'ן קרום חלבונים פלורסנט אלה הופכים מיד juxtaposed אחד לשני, דאגה. איור 2 מציג להחליפן בתמונות קונאפוקלית של הלה תאים המבטאים חלבונים מוקש עם התווית fluorescently. המוצגים הם תא לבטא syntaxin 4-mCitrine (התורם fluorophore) עם VAMP3-mCherry (מקבל fluorophore), כמו גם בקרת תנאי התאים לבטא רק לבנות 4-mCitrine syntaxin (התורם בלבד; אין סריג) ועל syntaxin 3 דבוקה שני mCitrine mCherry במשולב (סריג צפוי מקסימלי). איור 3 מראה את המלווה פלורסצנטיות שלמים ואת FLIM תמונות שנוצרו על-ידי הזזת את היסטוגרמות שלמים של כל פיקסל עם פונקציות דעיכה מעריכית-מונו (איור 3 א–B), דעיכה מעריכית-bi פונקציות ( איור 3C - D)- דמות 4A מציגה את IRF של ההתקנה שלנו נמדד על ידי פיזור אחורי של כוס כיסוי מיקרוסקופ. עקומות דעיכה מעריכית-מונו פונקציות מוצגים באיור 4B–E, זריחה נציג היסטוגרמות לכל החיים של התא כל ניתוח FLIM יחד עם ליווי מתאים. איור 4F מראה היסטוגרמה פלורסנט שלמים של ניסוי עם תמונה קרוב מדי אל פני השטח של הזכוכית המכסה מיקרוסקופ, וכתוצאה מכך לשיא השתקפות בולטים. איור 4G מראה היסטוגרמה לכל החיים עם נציג מתאים עם פונקציה דעיכה מעריכית-bi.

figure-results-1
איור 1: ערכה של הרציונל להמחשת מוקש תסביכים על-ידי קשת/קשתית. (א) מבניים מודל של החלבון קרום שלפוחית-הקשורים מלכודות (חלבון מסד הנתונים 3HD717) העצבית (ערפדים) 2 (כחול; R), syntaxin 1 (אדום; Qa-SNARE), ו- SNAP25 (ירוק; מכיל שני מוטיב Qb - ו -Qc-מוקש). קצה קרבוקסילי של סליל transmembrane של syntaxin-1 היא מצומדת כדי mCitrine (התורם fluorophore; חלבון מסד הנתונים 3DQ118). קצה קרבוקסילי של סליל transmembrane של VAMP2 מצומדת כדי mCherry (מקבל fluorophore; חלבון מסד הנתונים 2H5Q19). (B) ערכה של מוקש מתווכת פיוז'ן ממברנה וכתוצאה מכך סריג. לאחר היתוך הממברנה על ידי היווצרות cis-מוקש מורכבים, את מלכודות מוצבות מיד אחד לשני וכתוצאה מכך סריג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: ביטוי של חלבונים מוקש התמזגו חלבונים פלורסנט. העמודה הראשונה: fluorophore התורם, מתרגשים לקראת 516 ננומטר. העמודה השניה: fluorophore מקבל, מתרגשים לקראת 610 nm. (א) התורם: בתנאי. נציג תמונה קונאפוקלית של תא הלה לבטא syntaxin 4-mCitrine (התורם fluorophore; ירוק מיזוג). הערוץ מקבל (העמודה השניה) מציג את קרינה פלואורסצנטית צולבות לדבר. (B) שליטה שלילי (אין סריג). נציג תמונה קונאפוקלית של תא הלה לבטא בשתי syntaxin 4-mCitrine עם VAMP3-mCherry (מקבל fluorophore; מגנטה במיזוג). (ג) בקרה חיובית (סריג צפוי מקסימלי). נציג תמונה קונאפוקלית של תא הלה לבטא את טנדם 3-mCitrine-mCherry syntaxin לבנות. שימו לב: האות זריחה של mCitrine, mCherry אותות אינה לא לגמרי חפיפה, סביר להניח בגלל התנגדות נמוכה יותר של mCitrine כדי השפלה lysosomal בהשוואה mCherry (ראו סעיף דיון). BF: שדה בהיר. גודל ברים, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: FLIM תמונות של היווצרות מורכבות מוקש. (א) זריחה נציג תמונות לכל החיים של תאי באיור 2. התמונות היו שנוצרו על-ידי המרת את עקבות פוטון שהוקלט על ידי מערכת TCSPC (.pt3) התמונה cytometry רגיל (.ics) באמצעות התוכנה PT32ICS. פיקסל בודד מצויד שלמים פלורסצנטיות תמונות ואז נוצרו באמצעות12,את התוכנה TRI213 עם סף מן העוצמה 15-100%, 7 binning מעגלית פיקסל אלגוריתם מתאים monoexponential (Marquardt). הצבע ציון אורך החיים הממוצע פלורסנט נראית לעין. תמונות (B) FLIM שבו הדימויים שלמים קרינה פלואורסצנטית (באיור פאנל A) היו מפותל עם עוצמות קרינה פלואורסצנטית fluorophore תורם mCitrine (באיור 2). קונבולוציה בוצעה עם פיג'י ImageJ משתמש במאקרו בהזמנה אישית (ראה טבלה של חומרים). (ג) זריחה שלמים ותמונות FLIM של התא הלה לבטא syntaxin 4-mCitrine וגם VAMP3-mCherry של לוחות A-B, אבל עכשיו עם התאמה באמצעות עקומות דעיכה מעריכית-bi (עם משך חיים קבוע לתנאי בקרה; ראה צעד ב 4.4 פרוטוקול). פיקסל הצבעים מצביעים על ההערכה שברים F של syntaxin 4 במתחם עם VAMP3 (משוואה 3). (ד) אותו דבר כמו פאנל B, אך עבור מעריכי-bi מתאימים. קונבולוציה בוצעה עם פיג'י ImageJ משתמש במאקרו בהזמנה אישית (ראה טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: התא כולו ניתוח FLIM. (א) הפונקציה תגובת כלי נגינה (IRF) של ההתקנה. IRF נמדדה באמצעות חזרה על פיזור על הממשק זכוכית-מים (באמצעות צלחת מיקרוסקופית זכוכית נקי המכיל מים).(B–E) כל תא היסטוגרמות לכל החיים עבור התאים שמוצג באיור 2 , איור 3. נוכח התמונות כל הפוטונים היו איחדו. העקומות היו deconvoluted עם IRF, מצויד פונקציות דעיכה מעריכית-מונו (משוואה 1). עבור תאים אלה, התקבלו פלורסצנטיות תקופות חיים של 2.82 ns (תאים לבטא רק syntaxin 4-mCitrine; תורם רק פאנל B), 2.09 ns (תאים שותף לבטא syntaxin 4-mCitrine עם VAMP3-mCherry; החלונית ' ג), ו 2.08 ns (תאים לבטא את syntaxin 3 - mCitrine-mCherry טנדם לבנות; שליטה מירבית סריג צפוי; לוח ד). אינליי הצגת הגרפים אותו, אבל עכשיו עם שינוי קנה מידה לוגריתמי של ציר ה-y. פאנל E מראה על כיסוי של עקומות דעיכה של פאנלים B-ממד. (F) דוגמה היסטוגרמה שלמים פלורסנט הקליט קרוב מדי אל פני השטח של תגית כיסוי מיקרוסקופ. התוצאה לשיא השתקפות גדולה (מתואר על ידי האזור המוצלל צהוב). (G) בדיוק כמו לוח C, אבל עכשיו מתאים עם עקומה דעיכה מעריכית-bi עם משך חיים קבוע לתנאים שליטה (ראה שלב 4.4 בפרוטוקול). Amplitudes של מהיר (א1) והרכיבים (א2) איטי היו 14.42 0.01, בהתאמה, וכתוצאה מכך שבר המשוערת של מלכודות ב מורכבים F של 0.99 (משוואה 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1. הפונקציה קובץ FLIM_convoluted_IRF אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2. הפונקציה קובץ FLIM_convoluted_IRF_biexp אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים את השימוש סריג-FLIM עבור ויזואליזציה של מוקש אינטראקציות בין syntaxin 4 VAMP3 בתאים הלה בשידור חי. Syntaxin 4 הוא חלבון Qa-מוקש בעיקר באיתור קרום פלזמה איפה זה שמתווכת אקסוציטוזה1,2,20,21. VAMP3 הוא R-מוקש אשר מתואר בעיקר כדי לאתר מיחזור endosomal תאים שמתווכת סחר כדי endosomes אחרים, כמו גם לגבי קרום פלזמה2,1,, או20. עם זאת, וזמינותו סריג-FLIM ניתן להתאים בקלות ללמוד לחלבונים אחרים מוקש. התנאי היחיד הוא כי מלכודות אלה מכילים סליל transmembrane C-מסוף, וזה המקרה חלבונים מוקש ביותר על ידי רחוק1,2. בנוסף, פרוטוקול המתוארים כאן ניתן להתאים עבור ויזואליזציה של מוקש מתחמי בכל סוג התאים האיקריוטים, כולל צמחים ושמרים. ב פרוטוקול זה, השתמשנו לקיצור של קרינה פלואורסצנטית משך fluorophore התורם כאמצעי של סריג. כמו בגישה המשלימה, החיים של fluorophore מקבל יכולה להיבדק, כי הפליטה sensitized גורם שלב עלייה ברורה אשר מספק הוכחה ברורה וחד משמעית כי העברת האנרגיה תהודה מתרחשת.

כיום, הטכניקה סריג-FLIM ייתכן לא מסוגל לדמיין מוקש מתחמי בתאים lysosomal. עבור הבונה טנדם 3-mCitrine-mCherry syntaxin, זריחה mCherry ניתן לרוב למצוא יותר שהצטברו באזור juxtanuclear, ככל הנראה המתאים מדורים lysosomal, ואילו האות mCitrine הוא יותר בשפע הסלולר הפריפריה5. הצטברות juxtanuclear דומה של mCherry בהשוואה mCitrine נצפתה, כאשר אותם חלבונים מוקש התמזגו חלבונים פלורסנט אלה היו ביטוי במשותף5. Lysosomes מאופיינים של pH נמוך ביותר (< 4), פעילות גבוהה של אנזימי הפרוטאוליטי. הצטברות juxtanuclear mCherry נגרם על ידי התנגדות גבוהה יותר של fluorophore mCherry אל השפלה lysosomal בהשוואה fluorophore mCitrine. זה לא בגלל שכבתה ל- pH של mCitrine, כפי juxtanuclear הצטברות mCherry מתרחשת גם על קיבוע של תאים5. לפיכך, הטכניקה סריג-FLIM מעריך את כמות סריג באזורים (lysosomal) juxtanuclear וזה ידרוש לחלבונים אחרים כתב פלורסנט לשרוד את התנאים הקשים בתוך לומן של lysosomes.

סריג-FLIM באופן עקרוני מאפשר להשיג (נולד בלמחצה) הערכה כמותית של השבר של מלכודות מורכב5. כפי שהוסבר פרוטוקול זה, הדבר דורש ההתאמה של היסטוגרמות שלמים זריחה עם פונקציות דעיכה מעריכית-כפול (2 במשוואה), איפה משרעת רכיב מהיר הוא יחסי השבר של מלכודות ב (מורכבים משוואה 3). עם זאת, כזה מתאים מודל שני הוא טכנית מאתגר. התאמה עם מספר פרמטרים בכושר חינם (שתי תקופות חיים פלורסצנטיות, amplitudes שני) דורש מספר גדול מאוד של הפוטונים, במיוחד מאז הפרמטרים משפיעים אחד על השני, שגיאות קטנות בחיים ישפיע על amplitudes ועל סגן להפך. כדי להתגבר על בעיות אלה הולם, תקופות חיים זריחה של הרכיב איטי יכול להיות קבוע על חייו של התנאי היחיד התורם (קרי, אין סריג; רק mCitrine הנוכחי) ולבנות של הרכיב מהר כדי משך טנדם ( מקסימלי צפוי סריג). עם זאת, זה גם לפרש בזהירות, כי תקופות חיים ידי קרינה פלואורסצנטית ייתכן כמו מדינות בקרה אלה, יכול לסטות עקב מספר סיבות (עצמי שכבתה, התמצאות דיפול, microenvironment וריאציות). מתחמי מרובות סנר קרוב (< 10 ננומטר) יכול כתוצאה תלויי-מרחק סריג, אותו עיקרון המאפשר סריג לשמש "סרגל מולקולרי", אבל במקרה זה, מטשטש כימות של מתחמי מוקש. יתר על כן, הערכה כמותית אינה תמיד משמעותי, כי מלכודות שכותרתו להתחרות עם מלכודות אנדוגני (ללא תווית). כתוצאה מכך, רמת הביטוי של התווית על-ידי mCherry מוקש הוא דטרמיננטה הראשי עבור האחוז סריג5. בגלל כל אזהרות אלו, מומלץ להתאים את היסטוגרמות שלמים פלורסנט עם פונקציה דעיכה מעריכית-מונו (משוואה 1). יש לזה יתרון כי היא אינה דורשת כל ידע א-פריורי גלגולי חיים של, וכתוצאה מכך לכאורה החיים פלורסנט ממוצע מספק מדד מוצק מוקש complexing5.

ובכל זאת, הוא צפוי כי כמותיים הדמיה סריג-FLIM על ידי התאמת שני מודלים יהיה חזק יישומים עתידיים. קידוד מוקש הגנים בתוך הכרומוזום יכול להיות התמזגו עם חלבונים כתב פלורסנט, לדוגמה על-ידי CRISPR/CAS9. זה מתבטא תיוג פלורסנט חלבונים מוקש אנדוגני, עם רמות החלבון אנדוגני, ללא רקע של מלכודות ללא תווית, ומאפשר ובכך הערכה כמותית משמעותי של השבר של מתחמי מוקש על ידי סריג-FLIM. בעוד רמות הביטוי של מלכודות אנדוגני עשוי להיות נמוך ולתת אותות פלואורסצנט נמוכה יחסית, הוא צפוי כי מספר מספיק של פוטונים ניתן להשיג, במיוחד עבור התא כולו FLIM (אשר מחייב רק כמה 1,000s של פוטונים). יתר על כן, ניתן לבצע מדידות אלה סריג-FLIM עם יותר רגישות גלאי מפולת פוטודיודה גם תוצאה גבוהה יותר קרינה פלואורסצנטית אותות ונתונים סטטיסטיים פוטון יותר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמך על ידי מלגת היפאטיה מן המרכז הרפואי של אוניברסיטת Radboud, פרס פיתוח הקריירה מהתוכנית המדע של הגבול האנושי, 2013 תוכנית הכבידה מארגון הולנד למחקר מדעי (בתחרות; ICI-024.002.009), להם מענק של בתחרות (הציפורן להם 864.14.001), מענק החל מ האירופית מחקר המועצה (ERC) תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (גרנט הסכם מספר 336479).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DNA פלסמיד 'סינטקסין 4-mCitrine'AddgeneID 92422ניתן להשתמש גם ב-SNAREs אחרים עם חלבונים פלואורסצנטיים המאוחים לסלילים הטרנסממברניים C-terminal שלהם. במקום mCitrine-mCherry, ניתן להשתמש גם בזוגות תורמים-מקבלים אחרים של פלואורופורים מופרדים ספקטרלית (למשל, CFP-YFP).
ניתן להשתמש גם ב-DNA פלסמיד 'VAMP3-mCherry'AddgeneID 92423ניתן להשתמש גם ב-SNAREs אחרים עם חלבונים פלואורסצנטיים המאוחים לסלילים הטרנסממברניים C-terminal שלהם. במקום mCitrine-mCherry, ניתן להשתמש גם בזוגות תורמים-מקבלים אחרים של פלואורופורים מופרדים ספקטרלית (למשל, CFP-YFP).
פלסמיד DNA 'סינטקסין 3-mCitrine-mCherry'AddgeneID 92426בקרה חיובית ל-FRET מקסימלי שניתן להשיג.
תאי
35 מ"מ כלי זכוכית תחתונים Willco WellsHBST-3522תאי הדמיה אחרים של תאים חיים יעבדו כתחליף
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco, Life Technologies31966-021
סרום עגל עובריGreiner Bio-one758093
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטיתGibco, Life Technologies15240-062Pen/Strep יעבוד כתחליף
להדמיית תאים חיים מדיוםThermo Fisher ScientificA14291DJכל פתרון הדמיה אחר של תאים חיים יעבוד, כל עוד נמנעת פלואורסצנטיות מהמדיום
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP8 עם מטרת טבילה במים 63x 1.20 NALeicaSP8ניתן להשתמש גם במיקרוסקופים קונפוקליים אחרים המסוגלים ל-FLIM בתחום הזמן ניתן להשתמש גם
בלייזר אור לבן פועםLeicaSP8ניתן להשתמש גם במקורות לייזר פועמים אחרים
מערכת ספירת פוטונים בודדים בקורלציה בזמן (TCSPC)PicoQuantPicoHarp 300
המרת PT32ICSזמינה במדור 'תוכנה' של
תוכנת ניתוח נתונים www.membranetrafficking.com המסוגלת לפירוקOriginlabsOriginPro 2016
Fiji ImageJ
מאקרו Fiji ImageJ בהתאמה אישית לפיתול של תמונת FLIM עם עוצמהFiji ImageJזמין במדור 'תוכנה' של
www.membranetrafficking.com Bü rker HaemocytometerVWR630-1541
תאי HeLaATCCATCC  CCL-2
PBSB בראון מלסונגן  AG362 3140
EDTA 2 מ"מMerck108417CAS: 60-00-4
צינורות 15 מ"לGreiner Bio-one188271
Trypan blueSigma Aldrich93595CAS: 72-57-1
מכשיר אלקטרופורציה של תאי NEONThermo Fisher ScientificMPK5000S
הלהתוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).
  2. Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).
  3. van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).
  4. Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
  5. Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
  6. Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).
  7. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  8. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  9. JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2017).
  10. Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171(2005).
  13. Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).
  17. Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).
  18. Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).
  19. Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).
  20. Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).
  21. Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SNAREFRET FLIM

מאמרים קשורים