זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Summary

התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.

Abstract

Immunoblotting הפך להיות טכניקה שיגרתי במעבדות רבות עבור חלבון איפיון מ דגימות ביולוגיות. פרוטוקול הבאים מספק אסטרטגיית חלופיים, נימי לגירויי כאב תוך התמקדות (cIEF), עם יתרונות רבים בהשוואה ל- immunoblotting קונבנציונלי. זוהי שיטה נוגדן מבוססי אוטומטית, מהירה, כמותי שבו הליך שלם blotting המערבי מתקיים בתוך נימי ודק במיוחד. טכניקה זו לא דורשים ג'ל כדי להעביר קרום, בנוכחות אחר של שהכלים, או סרטים, אשר נדרשים בדרך כלל עבור immunoblotting קונבנציונלי רנטגן. כאן, החלבונים מופרדים לפי תשלום שלהם (נקודה איזואלקטרית; pI), שימוש פחות microliter (400 nL) סה כ החלבון lysate. לאחר אלקטרופורזה, חלבונים הם ותשמרו על גבי קירות נימי על ידי טיפול אור אולטרה סגול, ואחריו ראשיים ומשניים (חזרת peroxidase (HRP) מצומדת) נוגדן דגירה, שאת איגודו מתגלה דרך משופרת chemiluminescence (ECL), יצירת אות אור שניתן שנתפסו או נרשם על ידי מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). התמונה הדיגיטלי ניתן לנתח, לכמת (אזור הפסגה) באמצעות תוכנה. הליך תפוקה גבוהה יכול להתמודד עם דגימות 96 בכל פעם; היא רגישה מאוד, עם זיהוי חלבון בטווח picogram; מפיק תוצאות מאוד לשחזור בגלל אוטומציה. כל ההיבטים האלה יקרים מאוד, כאשר הכמות של דגימות (למשל, דגימות רקמה, ביופסיות) הוא גורם מגביל. הטכניקה יש יישומים רחב יותר, כולל הקרנה של סמים או נוגדנים, גילוי סמן למטרות אבחון.

Introduction

התמקדות לגירויי כאב נימי (cIEF) היא מתכלה אוטומטיות, המבוססים על נימי הפותר חלבונים על בסיס שלהם תשלום^1,2,3. זה מאוד לשחזור ובעל יכולת לפתרון חלבונים ו שלהם איזופורמים ששונה post-translationally במהירות, באופן כמותי. הוא מציג אלטרנטיבה שיטות קונבנציונליות כמו סופג המערבי. בעוד סופג המערבי הוא טוב מאוד עבור המאשרים את נוכחותם של חלבונים בשפע בדגימות נגיש; השתנות זמן הצריכה, כימות מדויק הנוכחי אתגרים, בפרט כאשר בחינת דגימות רקמה ביולוגית. אכן, השתנות זו בעיה פנימית ב סופג המערבי, שכן ישנם שלבים רבים מעורבים, כגון טעינת וריצה של ג'ל מרחביות-דף, העברה של חלבונים על גבי קרום, דגיר....

Protocol

1. תא תרבות, גירוי, פירוק

פתק: ניתן להשתמש בשיטה זו עם סוגי תאים רבים. כדי להמחיש את השיטה, מתואר דוגמא באמצעות תאי אנדותל יפתור (HUVECs).

1. תרבות HUVECs על מצופים ג'לטין, צלחות פטרי 10 ס מ בינוני הבזליים תא אנדותל עם תוספי המתאים (ראה טבלה של חומרים), ומכילה גם 5% FCS, גורם הגדילה באפידרמיס (5 ng/mL), צמיחה אנדותל כלי הדם (VEGF: 0.5 ng/mL), FGF בסיסי (10 ng/mL), פקטורי גדילה דמויי אינסולין (20 ng/mL), הידרוקורטיזון (0.2 µg/mL), חומצה אסקורבית (1 µg/mL).
2. ברעב תאים בין לילה תא אנדותל בינונית הבזליים בתוספת 1% FCS, אין תוספת פקטורי גדילה.
3. תשאף כל מדיום, להוסיף 2 מ של תאי אנדותל בינוני תרבות ללא גור....

Results

עיצוב של assay חדש: פריסה של צלחת assay מוצג איור 1A. מקסימאלית, ניתן להשתמש בארות 96 מהצלחת 384-טוב בבלוקים של בארות 12 עבור כל תנאי (נוגדן). כל בלוק של בארות 12 יכול להתחיל A1-A12 או A13-A24. צבע מקודד שורות לאפשר אחד להבחין בין דוגמאות או ריאגנטים אחד מהשני. בתבנית assay (איור 1B), מידע רלוונטי על כך assay מסוים ניתן לאחסן, אשר יכול לשמש בשלבים מאוחרים יותר של ניתוח התוצאות. איור 1C

Discussion

רגישות ורזולוציה של חלבונים מכריעים לחקר פרוטיאומיה מבנית דגימות ביולוגיות. יש ערך רב להיות מסוגלים לזהות חלבונים אשר נמצאים בכמויות דקה בתאים. cIEF יכולים להציע שיפור רגישות ורזולוציה לאיתור חלבונים ושלהם איזופורמים⁴.

טכנולוגיה זו שימש בהצלחה ב רבים פרוטיאומיה מבנית המחקר דוחות^5,6,7. עדיין, מספר מגבלות הם קשורים, כגון העובדה כי לא כל נוגדנים הראשי יכול לתת אות גם אם הם עובדים .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	חלבון Simple
Premix G2, pH 5– 8 שיפוע הפרדה (מקונן), pH 2– 4 תקעים	ProteinSimple	040-972	אמפוליט premix
תערובת מעכבי DMSO	ProteinSimple	040-510	מעכבי פוספטאז; לדילול cIEF 1:50 נעשה שימוש
במעכב מימי תערובת	חלבון	פשוט 040-482	מעכב פרוטאז; לדילול cIEF 1:25 בשימוש
סולם סטנדרטי pI 3	ProteinSimple	040-646	לדילול cIEF 1:60 בשימוש
מדגם	חלבון	040-649
מדלל נוגדנים	חלבון	040-309
חלבון תרכיז שטיפה	פשוט	041-108
חלבון	מילוי אנוליטים	040-337
חלבון	מילוי קתוליטים	040-338
חלבון מי חמצן XDR	פשוט	041-084
חלבון	לומינולפשוט	040-652
Bicine/CHAPS	חלבון	040-764
הפרדת מטען נימים (חבילה אחת) עבור	חלבוןSimple	CBS700
ערכת צלחת/מכסה	בדיקה חלבון פשוט	040-663
פרוקסידאז-אפיניחמור טהור נגד ארנב IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	עבור cIEF בשימוש (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	עבור cIEF בשימוש (1: 300)
Phospho-Erk 1/2	איתות תאי	9101	עבור cIEF בשימוש (1: 50)
Pan Erk	איתות תאי	9102	עבור cIEF בשימוש (1: 100)
תוכנת מצפן	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& נ.ב.פ; C-22221	תאי אנדותל מדיום בסיסי
גידול תאי אנדותל מדיום MV2 תוסף תזונה	PromoCell	C-39221	תוסף ל-MV2 מעל
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	סיגמא-אולדריץ'	85580C/I1146	גורם גדילה דמוי אינסולין
Bioruptor (Sonicator)	דיאגנוד	B01020001
חלבון BCA ערכת בדיקה	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris ג'ל חלבון	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS מאגר ריצה (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF ממברנה	Millipore	IPVH00010
מיקרופוגה צינור מערבולת
צנטריפוגה
מיקרוטיטר צלחת מתאם לצנטריפוגה
פיפטורים
טיפים
לקרח